专利名称：：抗mfap3l单克隆抗体及其在肿瘤检测中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫学和细胞学领域。具体而言，本发明提供了一种可以产生与人结直肠癌细胞的天然抗原结合的单克隆抗体的杂交瘤，由该杂交瘤产生的单克隆抗体可应用于人结直肠癌的诊断试剂或相关领域。
背景技术：
：结直肠癌又称大肠癌，在我国常见恶性肿瘤中排第五位。在过去的25年中，随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，其发病率呈上升趋势，上升速度在各种恶性肿瘤中排第一位。肝脏是结直肠癌最易发生的转移器官，被称为结直肠癌器官转移的“第一站”，它是结直肠癌患者死亡的主要原因之一。在整个病程中，约有50%的结直肠癌发生肝转移(同时性转移为15%—25%，异时性转移为20%)，并最终死于以肝脏为主的远位转移。发生这种情况的原因是多方面的，比如手术的切除范围不足、常规病理取材时潜在阳性淋巴结的遗漏等都可造成对肿瘤分期的低估。但缺少较现行临床标准更精确而具指导意义的肿瘤分类标准是一个更为重要的原因，而这种情况又会直接影响到患者治疗方案的制定。只有通过早期发现甚至预测肝转移的发生，才有可能对肿瘤病期进行更准确的评估，尽早地进行针对性治疗，从而提高生存率，改善预后。目前临床上检测结直肠癌肝转移主要依靠影像学技术，包括B超、CT、MRI和血管造影等，对肝脏转移灶的检出率为50%—90%。但检出时多因转移灶过大、数目过多、分布太广或与周围血管关系过于密切而失去有效治疗时机。而且对于直径<Icm的微小转移灶，影像学技术也很难做出明确诊断。随着免疫学和分子生物学的发展，一系列敏感性和特异性更强的检测手段，如免疫组织化学、酶联免疫吸附实验(ELISA)、实时定量PCR(real-timePCR)和流式细胞仪等也被用于在外周血、胆汁和淋巴结等样本中检测微量肿瘤细胞和肝脏微小转移灶的存在。上述技术的应用，既为结直肠癌肝转移的早期诊断提供了可能，也使预测肝转移的分子标志物成为研究热点。本发明人利用双向电泳和基质辅助激光解吸附飞行时间串联质谱(MALDI-T0F/T0F)等蛋白质组学技术，在几十例大肠癌原发灶组织样品中筛查与肝转移特异相关的蛋白。我们发现，微丝相关蛋白3样(Microfibrillarassociatedprotein3_like，MFAP3L)的基因在转移组样本中高表达。MFAP3L是2002年从人睾丸cDNA文库中克隆出的一个与精子发生相关的基因，其功能研究到目前为止尚不多见，而检测该蛋白的特异性抗体也从未被制备。该基因的mRNA全长1345bp，编码45kDa蛋白。Southern印迹结果显示该基因在除卵巢外的人类各种组织中都有表达，其中在睾丸中高表达，在结肠中低表达。对于这样的新的靶点蛋白，急需提供特异性的检测抗体。
发明内容本发明所要解决的技术问题本发明的第一个目的是提供一种能专一性针对MFAP3L单克隆抗体杂交瘤及其制备方法。以及这种抗MFAP3L单克隆抗体杂交瘤分泌的抗体在肿瘤检测中的用途。本发明的第二个目的是提供一种特异性好的单克隆抗体，该抗体的亚类为IgGl，其能特异性地结合MFAP3L重组抗原和天然抗原。本发明的第三个目的是提供一种可以用于实验或临床诊断肿瘤组织MFAP3L表达水平的诊断试剂或检测试剂。本发明的第四个目的是提供抗MFAP3L单克隆抗体在检测肿瘤发生，发展及转移中的用途，特别是检测MFAP3L高表达的结直肠癌，更特别是发生远端脏器转移的肿瘤中的用途。解决技术问题所采用的技术手段本发明人通过原核表达该蛋白，免疫Balb/c小鼠并经过融合、克隆筛选、制备腹水、亲和层析技术纯化腹水获得了鼠源单克隆抗体。免疫印记试验显示该蛋白在高转移潜能的结肠癌细胞系RKO中的表达明显高于低转移细胞系HT29，而免疫组化(IHC)检测显示，在另外105对结直肠癌和正常组织样本中MFAP3L蛋白在肿瘤组织中的表达明显高于配对正常组织，而且高表达该蛋白的病例发生包括肝脏在内的各种远端脏器转移的几率较高，术后五年生存率较低(P<0.001)。具体地，本发明涉及以下几个方面1.一种单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由保藏日为2008年12月30日、保藏号为CGMCC2840的小鼠杂交瘤细胞系70016-1产生。2.项目1所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体为小鼠IgGl亚型单克隆抗体。3.含有项目1的单克隆抗体的免疫组化检测试剂，其用于检测人结直肠癌组织和正常组织中微丝相关蛋白3样表达的差异。4.含有项目1的单克隆抗体的免疫荧光检测试剂，其用于检测人结直肠癌组织和正常组织中微丝相关蛋白3样表达。5.含有项目1的单克隆抗体的免疫印迹检测试剂，其用于检测人结直肠癌组织和正常组织中微丝相关蛋白3样表达。6.含有项目1的单克隆抗体的检测试剂，其用于检测人结直肠癌的转移。7.使用项目1的单克隆抗体进行检测的方法，其包括使项目1的单克隆抗体与生物样品接触。8.项目1所述的单克隆抗体的用途，其用于制备用于检测人结直肠癌组织和正常组织中微丝相关蛋白3样表达的差异的免疫组化检测试剂。9.项目1所述的单克隆抗体的用途，其用于制备用于检测人结直肠癌细胞样品中微丝相关蛋白3样的表达的免疫荧光试剂和免疫印迹检测试剂。10.项目1所述的单克隆抗体的用途，其用于制备用于检测人结直肠癌转移的检测试剂。11.保藏号为CGMCC2840，保藏日为2008年12月30日的名为70016-1的小鼠杂交瘤细胞系。本发明的优点及有益效果本发明获得的杂交瘤(70016-1，保藏号为CGMCC2840)分泌产生的单克隆抗体，不仅与重组的MFAP3L抗原具有极强的特异性和敏感性，而且与结肠癌组织和细胞中的MFAP3L有极强的特异性敏感性。经过试验验证，本发明中杂交瘤产生的单克隆抗体可应用于蛋白印迹，免疫荧光和免疫组化等实验技术中。且特异性和灵敏度高，具有很高的应用价值。此外，在肿瘤生物学研究中，本发明的杂交瘤分泌的单克隆抗体可应用于研究亚细胞定位，蛋白相互作用等信号通路的科学研究中，也可以用于临床中检测肿瘤尤其是结肠癌的发生、发展、转移等实验中。通过试验证明本发明的杂交瘤分泌的单克隆抗体是高效的检测肿瘤尤其是结肠癌转移的试剂，检测效率高。具有很好的应用前景。附图简述图1表示由杂交瘤70016-1制备的抗MFAP3L单克隆抗体在免疫荧光检测中的应用。其结果显示可以通过本发明的单克隆抗体明确地检测出MFAP3L蛋白定位在细胞核中。图2表示采用本发明的单克隆抗体进行免疫印记试验的结果，具体可发现本发明的单克隆抗体能够特性地结合主要存在于胞核中的MFAP3L上。其中的核纤层蛋白A(LaminA)和醛还原酶(AR)分别为胞核与胞浆的标志蛋白。图3表示采用本发明的单克隆抗体进行免疫组化试验检测肿瘤组织和正常组织的差别的试验结果。具体可发现本发明的MFAP3L抗体主要在胞核中着色，且在肿瘤组织(左图)中的着色明显强于正常结肠组织。该结果表明此抗体可在免疫组化试验中特异地检测MFAP3L蛋白，而该蛋白在结肠肿瘤组织中特异性高表达，由此可以鉴定结肠肿瘤组幺口/Νο图4表示本发明的MFAP3L高低与患者术后五年生存率高低的关系。其中高表达该蛋白的肿瘤病例发生包括肝脏在内的各种远端脏器转移的几率较高(ρ<0.001)，术后五年生存率较低。其中实线对应MFAP3L低表达组，而虚线对应MFAP3L高表达组。具体实施例方式实施例1MFAP3L抗原的制备一、MFAP3L全长蛋白的克隆，表达和纯化以肝脏的cDNA文库为模板，根据MFAP3L序列(SEQIDNO1)对应的基因设计特异引物，引物两端连入BamHI和HindIII酶切位点上游引物5，AGCAGGATCCATGGATCGATTGAAGAGC3，下游引物5，CCCAAGCTTTTAGACATGGCTTTCGTA3，PCR扩增出全长MFAP3L基因，(PCR参数95°C5分钟，94°C30s，54°C30s,72°C1分钟，共40个循环；72°C后延伸10分钟)经双酶切后与pET28a连接，热激转化感受态细胞DH5a，挑单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。从测序正确的阳性菌中提取pET28a-MFAP3L质粒，(TIANGENBIOTECH公司试剂盒)转化BL21(DE3)感受态细胞，抗生素筛选得到阳性克隆，加入lmmol/LIPTG诱导4小时。诱导以后的菌株经超声后离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果显示表达的产物为可溶性蛋白。二、重组MFAP3L蛋白质的表达和纯化含有pET28a_MFAP3L质粒的BL21大肠杆菌在大规模培养后，加入IPTG进行诱导表达。诱导后的菌株经破碎和离心处理，再将可溶部分通过Ni-NAT亲和层析柱进行纯化，并用线粒梯度咪唑洗脱MFAP3L蛋白。洗脱的蛋白质以SDS-PAGE电泳检测纯度，最后进行MALDI-TOF/TOF鉴定，确证表达产物为MFAP3L。实施例2抗MFAP3L杂交瘤的制备一、免疫用纯化的MFAP3L蛋白为抗原，常规免疫(免疫前眼眶取20ul血清做阴性对照)4-6周龄雌性Balb/c小鼠3只；180ugMFAP3L蛋白+生理盐水至600ul+CFA600ul；腹部皮下注射每只小鼠6点。免疫剂量60ug/200ul/只。每14天加强免疫一次，90ug蛋白+生理盐水至600ul+IFA600ul；皮下注射每只小鼠6点。免疫剂量30ug/200ul/只。第3次后7天眼眶取血测效价，达要求者冲击免疫，50ug蛋白+生理盐水至IOOul；尾静脉注射。二、融合1.观察Sp2/0细胞(协和细胞库)的状态，并将选出的sp2/0细胞从培养瓶壁上吹打下来，然后吸入到50ml灭过菌的离心管中。将新鲜切下的小鼠脾脏放到细胞筛上碾碎，再吸入到装sp2/0的离心管中，盖好离心管助手拿去离心(1500rad/min，5min)。2.用同样的方法取出未免疫小鼠的胸腺并碾碎。取4ml碾好的胸腺细胞到15ml灭菌的离心管中，再加入Iml的HAT，放在离心管架上待用。3.将装有离心好的、且混勻的细胞的离心管放入温水中，加入Iml的PEG1500的，缓慢的搅动细胞。在温水中静置1分钟。IOml的无血清的IMDM离心(lOOOrad/min，5分钟)。4.加入IOml的血清小心的将细胞吹打起来，并倒入胸腺细胞，加入25ml灭菌的半固体培养基充分混勻。然后均勻的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入孵箱中培养。三、克隆选择1.融合后7-10天观察克隆细胞团大小密度适中，根据情况铺板。2.在解剖镜下，吸取圆、实、大克隆团打入96孔板中，3.放入10%CO2细胞培养箱。四、筛选1.一筛挑克隆后3天左右，70-80%每板观察细胞量大约占底面积2/3时，取IOOul上清ELISA筛选。2.结果出来之后，阳性克隆完全换液，再加200ul完全培养基(含1%HT液体)。3.2天后重复步骤1和2进行二次筛选并将阳性株重新编号。4.阳性株转入24孔板(用前1天铺好，加饲养细胞，HT)，并做好标记。5.筛标签用含标签HIS的蛋白包板，取IOOul上清ELISA筛选。6.符合要求的克隆转入6孔板或细胞培养瓶扩大培养。每株细胞冻存5次，并按要求收集上清(一般为IOml左右)。五、细胞冻存对数生长期细胞占满底面积80%左右即可冻存。收集上清且去除死细胞等杂质，上清存于_20°C。直接将冻存细胞放4°C半小时，然后放-20°C两小时，转-80°C冻存过夜，次日放液氮罐。实施例3由保藏号为CGMCC2840的杂交瘤制备抗MFAP3L单克隆抗体发明人将杂交瘤(70016-1，保藏日2008年12月30日，保藏号为CGMCC2840，保藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC)用于制备鼠抗MFAP3L单克隆抗体，具体操作步骤如下1.细胞复苏细胞遵循慢冻速融原则。从-80°C冰箱或液氮罐中迅速取出冻存管；迅速放入水浴锅中快速搅动，使冻存液在2分钟内全部融化成液体。用75%酒精擦拭冻存管。往15ml离心管中加入3ml血清培养基，将冻存液吸入离心管，1500rad/min,离心5分钟。弃上清，用完全培养基悬起细胞，培养于6孔板或瓶中。6孔板中培养基为3ml，第二天换液，再补足3ml；培养瓶培养基为5ml。2.腹水制备对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起；计数大约5X105，Iml0悬浮的细胞腹腔注射小鼠。一般7-10天后便可收集腹水。第一次可收集3ml左右，每隔2、3天可重复取，最终可收集8ml/只。每次取出的腹水4000rpm，10分钟离心；中间为腹水。小心吸出腹水收集于离心管中，4°C保存。3.单克隆抗体的纯化用HiTraprProteinAFF(GEHealthcare17-5079-01)纯化单克隆抗体。a.将腹水在4°C条件下，IOOOOrpm离心10分钟，去除脂类物质。b.离心后吸取上清，并用偶联缓冲液以13(腹水，偶连液比)稀释，过0.45um膜，准备过柱。c.用5-10柱体积的偶联缓冲液平衡柱子。d.上样。e.用5倍柱体积的偶联缓冲液洗柱。f.在收集管中加入60-200ul中和液，利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。g.用5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体，并收集在步骤6的收集管中。h.以5倍柱体积的洗脱缓冲液洗柱使柱再生。实施例4=ELISA法鉴定单克隆抗体亚类一、实验试剂1.封闭液2克BSA，3克蔗糖溶于100mlPBS中。2.ABTS储存液用Iml双蒸水溶解15mgABTS粉末，2-8°C闭光储存(可稳定4周)3.底物溶液加525mg柠檬酸到50ml双蒸水中震摇至溶解，用3NNaOH调节pH4.至加0.2mlABTS储存液和IOul30%H2O2到IOml柠檬酸盐缓冲液中。4.ABTS粉末(SouthernBiotechK3906-YC36公司)5.各型亚类二抗(SouthernBiotech公司)二、实验操作用IOOmMPBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG至0.5ug/ml，每孔加lOOul，4°C，过夜。倾空液体，用含0.05%Tween的PBS洗3次，每孔加入200ul封闭液，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.Im杂交瘤上清，37°C孵育lh。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液11000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ，λ)抗体或12000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM,IgGl,IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体0.Iml每孔，分别加入适当的孔中，37°C用孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50ul底物溶液，10-20分钟内测405nm<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.MFAP3L单克隆抗体(11000稀释)37°C孵育Ih或者4°C孵育过夜，4.相应羊抗鼠二抗(中杉金桥，13000稀释)室温孵育lh，5.用ImageQuantECL仪器曝光。二、实验结果实验结果显示本发明的单克隆抗体能够清楚定位存在与细胞核中的靶蛋白(图2)。具有很好的免疫印迹应用前景。实施例8本发明的单克隆抗体用途验证-免疫组化一、材料来源本发明具体实施方式所用结肠癌组织标本来源于北京大学临床肿瘤学院组织标本库，共包括105例结肠癌及对应的癌旁正常组织样本。样本取材是经手术切除的新鲜结直肠癌组织与其对应的癌旁组织经生理盐水洗涤后，放入液氮保存。标本均经病理证实，并有患者知情同意书。二、实验步骤1.0.3%H2O2甲醇室温10分钟，然后PBS洗3次X5分钟；2.MFAP3L单克隆抗体(150稀释)，湿盒孵育4°C过夜；3.滴加羊抗鼠二抗(1200稀释)，室温孵育30分钟；4.DAB-H2O2显色，镜下控制3_5分钟，PBS漂洗，终止显色，5.苏木素复染45秒，然后盐酸酒精分化，6.温热的自来水冲洗反蓝，7.95%和100%乙醇脱水各5分钟，二甲苯透明，中性树胶封片。三、实验结果1.如图3所示，MFAP3L抗体主要在胞核中着色，在肿瘤组织中的着色明显强于正常结肠组织。该结果表明此抗体可在免疫检测试验中特异地检测MFAP3L蛋白。具体检测结果如表1和表2所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在105例结直肠癌和配对正常组织样本中，MFAP3L在肿瘤组织中高表达，P<0.001。本发明的单克隆抗体检测结果与预期的一致，证明本发明的抗体具有较高的检测准确性。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在对105例结直肠癌组织样本的免疫组化检测中，MFAP3L的表达与远端转移呈正相关，其中肝转移P<0.001，其它类型转移P=0.003，而与淋巴结浸润间的关联没有统计学意义。此结果表明使用该抗体检测MFAP3L的表达量可以做为预测结直肠癌远端脏器转移的特异性指证。也就是说本发明的单克隆对这105对结直肠癌和正常组织样本的检测结果与MFAP3L蛋白在肿瘤组织中的表达情况一致，对结直肠癌组织的结合明显高于配对正常组织，已知高表达MFAP3L蛋白的病例发生包括肝脏在内的各种远端脏器转移的几率较高，术后五年生存率较低(P<0.001)。由此可知本发明的单克隆抗体可以用于直肠癌转移的检测。序列表<110>北京华大蛋白质研发中心有限公司<120>产生抗MFAP3L单克隆抗体的杂交瘤、抗MFAP3L单克隆抗体及其在肿瘤检测中的应用<130>IDC080148<160>3<170>PatentInversion3.2<210>1<211>409<212>PRT<213>MFAP3L的蛋白质序列<400>1MetAspArgLeuLysSerHisLeuThrValCysPheLeuProSerVal151015ProPheLeulieLeuValSerThrLeuAlaThrAlaLysSerValThr202530AsnSerThrLeuAsnGlyThrAsnValValLeuGlySerValProVal354045lielieAlaArgThrAspHislielieValLysGluGlyAsnSerAla505560LeulieAsnCysSerValTyrGlylieProAspProGlnPheLysTrp65707580TyrAsnSerlieGlyLysLeuLeuLysGluGluGluAspGluLysGlu859095ArgGlyGlyGlyLysTrpGlnMetHisAspSerGlyLeuLeuAsnlie100105110ThrLysValSerPheSerAspArgGlyLysTyrThrCysValAlaSer115120125AsnlieTyrGlyThrValAsnAsnThrValThrLeuArgValliePhe130135140ThrSerGlyAspMetGlyValTyrTyrMetValValCysLeuValAla145150155160PheThrlieValMetValLeuAsnlieThrArgLeuCysMetMetSer165170175SerHisLeuLysLysThrGluLysAlalieAsnGluPhePheArgThr180185190GluGlyAlaGluLysLeuGlnLysAlaPheGlulieAlaLysArglie195200205ProlielieThrSerAlaLysThrLeuGluLeuAlaLysValThrGln210215220PheLysThrMetGluPheAlaArgTyrlieGluGluLeuAlaArgSer225230235240ValProLeuProProLeulieMetAsnCysArgThrlieMetGluGlu245250255lieMetGluValValGlyLeuGluGluGlnGlyGlnAsnPheValArg260265270HisThrProGluGlyGlnGluAlaAlaAspArgAspGluValTyrThr275280285lieProAsnSerLeuLysArgSerAspSerProAlaAlaAspSerAsp290295300AlaSerSerLeuHisGluGlnProGlnGlnlieAlalieLysValSer305310315320ValHisProGlnSerLysLysGluHisAlaAspAspGlnGluGlyGly325330335GlnPheGluValLysAspValGluGluThrGluLeuSerAlaGluHis340345350SerProGluThrAlaGluProSerThrAsnValThrSerThrGluLeu355360365ThrSerGluGluProThrProValGluValProAspLysValLeuPro370375380ProAlaTyrLeuGluAlaThrGluProAlaValThrHisAspLysAsn385390395400ThrCyslielieTyrGluSerHisVal405<210>2<211>28<212>DNA<213>上游引物<400>2agcaggatccatggatcgattgaagagc28<210>3<211>26<212>DNA<213>下游引物<400>3cccaagcttttagacatggctttcgt2权利要求一种单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由保藏日为2008年12月30日、保藏号为CGMCC2840的小鼠杂交瘤细胞系70016-1产生。2.含有权利要求1的单克隆抗体的免疫组化检测剂，其用于检测人结直肠癌组织和正常组织中微丝相关蛋白3样表达的差异。3.含有权利要求1的单克隆抗体的免疫荧光检测剂，其用于检测人结直肠癌组织和正常组织中微丝相关蛋白3样表达。4.含有权利要求1的单克隆抗体的免疫印迹检测剂，其用于检测人结直肠癌组织和正常组织中微丝相关蛋白3样表达。5.含有权利要求1的单克隆抗体的检测试剂，其用于检测人结直肠癌的转移。6.使用权利要求1的单克隆抗体进行检测的方法，其包括使权利要求1的单克隆抗体与生物样品接触。7.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其用于制备用于检测人结直肠癌组织和正常组织中微丝相关蛋白3样表达的差异的免疫组化检测试剂。8.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其用于制备用于检测人结直肠癌细胞样品中微丝相关蛋白3样的表达的免疫荧光试剂和免疫印迹检测试剂。9.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其用于制备用于检测人结直肠癌转移的检测试齐LU10.保藏号为CGMCC2840，保藏日为2008年12月30日的名为70016-1的小鼠杂交瘤细胞系。全文摘要本发明涉及产生抗MFAP3L单克隆抗体的杂交瘤、抗MFAP3L单克隆抗体及其在肿瘤检测中的应用，具体地涉及产生与人结直肠癌组织中的以及正常组织中的天然蛋白-微丝相关蛋白3样蛋白(MFAP3L)特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤、以及相应的抗体。进一步地，本发明涉及含有所述单克隆抗体的免疫检测试剂。以及所述单克隆抗体或者所述检测剂在有效检测结直肠癌中的用途，从而提供了有效检测MFAP3L的检测工具。文档编号C07K16/18GK101805405SQ200910077768公开日2010年8月18日申请日期2009年2月17日优先权日2009年2月17日发明者刘国振,刘斯奇,吕有勇,吴琳,康滨,张军,徐宁志,邢蕊申请人:北京华大蛋白质研发中心有限公司