专利名称：锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到99mTc标记的放射性药物化学和临床核医学技术领域，特别是 涉及到一种锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物及其制备方法和 应用。
背景技术：
ASGP受体(Asialoglycoprotein receptor, ASGP-R)是去唾液酸糖白蛋白受 体的简写，存在于哺乳动物肝细胞膜上，是介导肝脏清除血液中去唾液酸糖蛋白 (Asialoglycoprotein, ASGP)的专一位点。除了白蛋白之外几乎所有血浆蛋白 都为糖蛋白，在被肝脏合成并释放到血液时，其糖链末端为唾液酸。唾液酸与其 它糖基形成较弱的连接，在血液中并不稳定，很易被清除。唾液酸部分被清除， 标志着这个糖蛋白寿命的结束。大部分血浆蛋白中半乳糖结构都位于末端的第二 位上，因此当末端的糖被酶解后，以半乳糖结尾的糖蛋白就可以作为ASGP受体 的作用底物。去唾液酸糖蛋白一旦在细胞表面与ASGP受体结合，所形成的配体 -受体复合物迅速内化，5分钟左右进入前溶酶体囊泡后由于pH的作用而解离， 受体再循环到质膜，大部分配体经溶酶体酶的作用而被分解代谢，小部分配体则 绕过溶酶体的降解而排入胆汁，或穿过细胞膜返回细胞表面仍与受体相结合。这 个过程可以维持血浆糖蛋白的动态平衡。ASGP受体可以在一定程度上反映出有 效肝细胞功能，在肝炎、肝硬化或肝癌等肝损伤性疾病发生时，其数量和活性均 受到损害。肝炎疾病在世界范围内都是一种高发疾病，特别是肝硬化继发肝癌患 者众多，严重影响人类健康与生活质量，其重要性现在巳经引起广泛关注突现。 日本已经利用ASGPR显像剂为核医学肝脏SPECT显像建立了三维肝脏模型， 该显像技术可以真实、数字化地反映肝脏功能，这样既可以对肝硬化患者术前肝 功能进行正确的评估，帮助预测手术风险、制定治疗方案，降低肝脏手术的围手 术期死亡率。1984年Vera等通过化学合成方法将半乳糖结构与人血清白蛋白偶
4联得到新乳糖白蛋白(galactosyl-neoglycoalbumin， NGA)，并经99mTc标记后进 行肝显像研究。1986年Kubota等研制了 一种99mTc标记GSA (99mTc-diethylenetriamine pentaacetic acid-galactosyl-human serum albumin),通过
增加双功能连接剂DTPA (二乙烯三胺五乙酸)结构，简化了标记条件，减少了 非特异性结合。但""^c-GSA仍存在""^c结合能力较低、在肾摄取略高等缺 点。2004年，Jeong等用(3巯基乙醇还原LSA (neolactosyl human serum albumin) 得到含有巯基的配体，用"mTc标记后，显示出较好的稳定性和优异的生物性能， 但是通过还原二硫键会破坏蛋白质的结构，进而影响其体内的生物性能。
如何通过NGA分子上引入含巯基的二巯基丙酸，不影响蛋白分子结构的同 时，增强其与锝-99m的配位能力，得到锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白 蛋白配合物而制备一种新型锝-99m标记配合物的的肝脏受体显像剂，是当前本 技术领域需要解决的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种具化学稳定性及生物性能好、初始摄取值及化学纯 度高、制备简单及使用成本低，应用在肝脏受体显像领域的锝-99m标记的二巯 基丙酰胺基新乳糖白蛋白(99mTc-DMP-NGA)配合物。
本发明的另一目的是提供一种所述配合物作为肝脏受体显像剂的制备方法 和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案 一种锝-99m标记的二巯 基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物，其配体分子二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白 (DMP-NGA)的结构通式为
0H
H0
式中DMP-NGA为配体为在人血白蛋白分子链上通过赖氨酸残基同时连接上n 个半乳糖基和m个二巯基丙酰胺基，其中n为20^5， m与n之和小于等于56。 锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物的制备方法如下
以放射性高锝酸盐(""^c04—)与二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白合成配体(DMP-NGA)，在还原剂、保护剂的存在下反应制备得到所述的放射性锝-99m标 记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物，其制备步骤为
a. 将DMP-NGA配体溶于缓冲液中，按照保护剂比配体为1:0.2~10的重量 比，加入保护剂；
b. 然后按还原剂比配体为1:25~500的重量比称取还原剂并溶于盐酸溶液 中；加入到步骤a所得溶液中，混合均匀，控制其pH在5.5 6.5之间；
c. 将从医用99Mo-99mTc发生器中淋洗获得的99mTc04—淋洗液加入步骤b制 备的溶液中，混匀后在20。C 80。C条件下反应10 60min;
d. 将步骤c所得溶液通过高效液相色谱进行纯化。 上述步骤a中所述的述保护剂为酒石酸钾钠，其用量为0.5mg—5mg。 上述步骤a中所述的缓冲液为0.05mol/L pH6.0磷酸缓冲液，用量为
0.1mL 5mL。
上述步骤b中所述的所述还原剂为将放射性高锝酸盐("mTc04—)还原为
99111化5+的常规化学试剂，优选为二水合氯化亚锡(SnCl2.2H20)，原剂用量为 0.01mg~0.04mg。
上述制备方法中所述的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配体为自行合成，其配 体用量为lmg—5mg;还原剂比配体为1:25~500的重量比，保护剂比配体为 1:0.2~10的重量比。
上述制备方法中所述的保护剂、缓冲液、还原剂等试剂均可以从市场购得。
本发明以放射性高锝酸盐"mTd("mTc04—)与二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白
合配比成配体(DMP-NGA)，在还原剂、保护剂的存在下，反应制备得到放射性 锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物(99mTc-DMP-NGA)，是一种 新型的肝细胞去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)显像剂，通过双功能连接剂二巯 基丙酸，在不影响蛋白分子结构的同时，在NGA分子中引入巯基。与GSA相 比，增强了与锝-99m的配位能力。,Tc-DMP-NGA化学稳定性及生物性能好、 初始摄取值及靶与化学纯度高、制备简单及使用成本低，可以成为一种新型的肝 脏显像剂。
检测表明"mTc-DMP-NGA配合物通过层析及RP-HPLC鉴定，其放射化学 纯度大于98%，而在室温下放置6小时后放化纯度大于91%，有较好的稳定性。
6实验表明，99mTc-DMP-NGA配合物的基本的性能如下 1. 99mTc-DMP-NGA在正常小鼠体内生物分布
取15只正常昆明小白鼠，于尾静脉注射0.1mL"mTc-DMP-NGA (约0.185 MBq，含2pgDMP-NGA)。于注射后5、 30和120min后断头处死。取出心、肝、 肺、肾、肌肉、骨、血等组织，称量并在锝分析仪内测其放射性计数。 "mTc-DMP-NGA在正常小鼠中的生物分布见表1。
表1.99mTc-DMP-NGA在正常小鼠体内生物分布数据(％ID/g±s, n=5)及与99mTc-
GSA (%ID/g±s,n=3)生物性能的对比
脏器 -99raTc-DMP-NGA99mTc- GSA
5min30min120min3Qmin
心1.61±0.172.11±0.711.97±0.231.41±0.57
肝99.35±9.7774.25±3.0352.47±7.5873.44±5.01
肺1.77±0.222.85±2.331.28±0.192.73±0.21
肾3.01±0.195.14±0.646.31±1.2112.92±0.50
脾3.10±0.584.02±1.194.07±0.935.08±0.87
胃1.58±2.005.53±7.404.00±3.167.34±8.01
血1.04±0.050.89±0.190.61±0.012.32±0.15
骨4.28±0.945.39±1.035.54±1.083.34±0.52
肌1.62±0.49L81±0.301.82±0.370.99±0.20
肠2.21±0.887.41±5.733.83±1.8226.15±5.76
在正常小鼠中的生物分布结果显示，"mTc-DMP-NGA在肝脏中有较高的初始 摄取，且在肝脏中的滞留优于99mTc-GSA，即使在120min，在肝脏中仍然有
(52.47±7.58) %ID/g的摄取值。在心、肺、脾等脏器的放射性浓集较低，与 99mTc-GSA相似。在肌肉与骨中的摄取比99mTc-GSA略高。但是99mTc-DMP-NGA 同99mTc-GSA相比，在肾脏和血液中的摄取值明显降低，30min时肝/肾、肝/ 血比分别达到14.4和83.4，明显高于99mTc-GSA在30min时的肝/肾、肝/血比(分 别为5.7和31.7)，这样的结果可能是由于"""Tc-DMP-NGA配位比较稳定，在生 物体内的稳定性较好，在未来的SPECT显像中，将能够获得更清晰的图像。
2. 99mTc-DMP-NGA在小鼠体内抑制实验
7取同批次5只正常昆明小白鼠，于尾静脉预注射0.1mL抑制剂(GSA配体 溶于生理盐水，按10mg/kg体重的剂量注射)，5min后，于尾静脉注射0.1 mL 99mTc- DMP-NGA (约0.185 MBq，含2|tig DMP-NGA)。注射后5 min后断头处死。 取出心、肝、肺、肾、肌肉、骨、血等组织，称量并在锝分析仪内测其放射性计 数。99mTc-DMP-NGA在正常小鼠体内抑制实验结果见表2。 表2.99mTc-DMP-NGA在正常小鼠体内抑制实验数据(注药后5 min, %ID/g±s,
n=5)
对照组抑制组
心1.61±0.174.65 ±0.64
肝99.35 ±9.7736.08±4.31
肺1.77±0.2212.59±1.96
肾3.01 ±0.199.83 ±1.00
脾3.10±0.586.18±0.78
胃1.58±2.000.84±0.16
血1.04±0.0531.72±1.24
骨4.28 ±0.947.91 ±1.92
肌肉1.62 ±0.491.99 ±0.26
小肠2.21 ±0.883.58±1.48
抑制实验的结果表明，在通过预注射GSA，在5min时能够明显的抑制 99mTc-DMP-NGA在小鼠肝脏中的摄取(PO.OOOl)，大量未进入肝脏的 "mTc-DMP-NGA滞留在血液中，在心、肺、肾等各脏器摄取也明显增加。
抑制实验的结果说明通过预注射GSA，可抑制99mTc-DMP-NGA在肝中的摄 取。证明99mTc-DMP-NGA对ASGP受体具有亲和性。
3. ."""Tc-DMP-NGA在小鼠体内显像实验
取同批次2只正常昆明小白鼠， 一只于尾静脉预注射O.lmL抑制剂(GSA 配体溶于生理盐水，按10mg/kg体重的剂量注射)，5min后，将两只小鼠同时于 尾静脉注射0.1 mL 3.7 MBq""^c-DMP-NGA。注射后5、30、60、 120 min在Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro上进行显像，并将所得放射性图像与X-ray图像融合。结果显示"mTc-DMP-NGA在正常小鼠中有较高的肝脏摄取和较好的保留， 而在抑制后小鼠肝脏摄取明显降低，说明,Tc-DMP-NGA在肝脏中的摄取是通 过ASGP受体机制。5min在抑制后的小鼠心脏部分有较高的浓集，这是由于未 进入肝脏的99mTc-DMP-NGA大量滞留在血液中，造成心血池中的放射性浓度较 高，随着时间的推移，"，c-DMP-NGA逐渐代谢，心脏部位的摄取也明显降低。 99mTc-DMP-NGA在小鼠体内的显像实验结果与生物分布结果及其抑制实验结果 一直。上述各项实验足以证明，本发明所述的锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新 乳糖白蛋白配合物具有优良的生物性能，能够满足作为肝细胞受体显像剂的条 件，说明本发明所述新型配合物可作为肝细胞受体显像剂在临床上推广应用。
上述各项实验说明，本发明所述的(99mTc-DMP-NGA)配合物，其放射化学 纯度大于98%，具有优良的生物性能，在肝脏中有较高的初始摄取，且具有较好 的滞留，并随着时间增加从肝脏中清除；与"mTc-GSA相比有较低的血、肾等脏 器的摄取，能满足用作肝细胞受体显像剂的条件，从而能减少不必要的放射性损 伤，可作为新型的肝细胞去唾液酸糖蛋白受体显像剂，(99mTc-DMP-NGA)配合 物作为一种新型配合物具有高化学稳定性和良好的生物分布性质，可作为肝细胞 受体显像剂在临床上推广应用。
具体实施例方式
下面通过实施例详述本发明， 一种锝-99m标记的6-肼基吡啶-3-甲酰胺基新 乳糖白蛋白配合物
(1) DMP-NGA的制备
取2,3-二乙酰硫代丙酸二环己胺盐0.86g置于小烧杯中，加入4mL乙酸乙酯， 搅拌得到白色的悬浊液，在搅拌下，慢慢滴加10%硫酸氢钾溶液，酸化至溶液澄 清，用40mLx3乙酸乙酯萃取。所得淡黄色有机相用无水硫酸钠干燥过夜。抽滤 后，旋蒸除去溶剂，得到白色固体0.48g。产率93.8%。
在25mL三口瓶中，将所得白色固体溶于4mL二氯甲垸，冰浴冷却至0'C， 加入0.25gN-羟基琥珀酰亚胺，再加入2.1mL二氯甲烷，冷却至0X:。慢慢滴加 DCC (0.44g，溶于2.1mL二氯甲垸)，滴加完毕后，室温反应18h。抽滤除去白 色沉淀，母液旋干后，用少量二氯甲垸溶解，除去痕量白色沉淀后，旋干溶剂， 得澄清的黄色油状物N-琥珀酰亚胺基2,3-二乙酰硫代丙酸酯(SATP) 0.456g。产率61.4%。 !HNMR (CDC13)， S: 2.41， 2.45 (2s， 6H， CH3)， 2.86 (s， 4H， CH2)， 3.45 (m， 2H， CH2)， 4.69 (t, H， CH)。
IRv/cm": 2932 (CH3)， 2854 (CH2)、 1816、 1785、 1740 (C=0)。
取20mg NGA溶于lmL 0.05mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液中，滴加lO^L 0.75mol/L的SATP的DMSO溶液。室温反应2h。反应结束后，通过lxl5cm Sephadex G100葡聚糖凝胶柱分离除去小分子，用0.05mol/L pH 7.5的磷酸缓冲 液为淋洗液，用紫外分光光度计在280nm处检测收集蛋白得到SATP-NGA。
在SATP-NGA溶液中加入0.2mLpH 7.5的羟胺溶液(含0.5 mol/L羟胺，0.025 mol/L EDTA， 0.05 mol/L磷酸缓冲液)，40pL 2.27mg/mL的DTT水溶液。室温 反应2h。反应结束后，通过lxl5cmSephadexG100葡聚糖凝胶柱分离除去小分 子，用0.05mol/LpH 7.5的磷酸缓冲液为淋洗液，用紫外分光光度计在280nm处 检测收集蛋白。即得到配体DMP-NGA。 (2) 99mTc-DMP-NGA的制备
其制备步骤为
a. 取新制的DMP-NGA2mg溶于0.5mL磷酸缓冲液(0.05mol/LpH6.0)中， 加入lmg的酒石酸钾钠；
b. 待全部溶解后加入2mg/mL SnCl2*2H20溶液lOpL到步骤a所得溶液中， 充分混合均匀，混合溶液pH为6.0;
c. 将新鲜"""TcO4'洗脱液0.5mL G7MBq)加入步骤b制备的溶液中，充分振 荡，50。C反应30min。
d. 反应结束后，通过高效液相色谱进行纯化，HPLC条件为高效液相色谱 仪Alltech(Model 626); Kromaisl C4柱250x4.6mm,5pm 300a ; A相为水(含 0.1%TFA)， B相为乙腈(含0.1。/qTFA);淋洗梯度为0 30min: 30% 70%B 相。流速lmL/min。各组分保留时间为99mTc04-: 3.7min; 99mTc-DMP-NGA: 17.4min。收集保留时间为17.4min的峰，即为纯化后的99mTc-DMP-NGA。
纯化后的99mTc-DMP-NGA高效液相色谱分析结果显示，其保留时间为 17.4min，放射化学纯大于98%。
权利要求
1. 一种锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物，其配体分子二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白的结构通式为式中二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白为配体，为在人血白蛋白分子链上通过赖氨酸残基同时连接上n个半乳糖基和m个二巯基丙酰胺基，其中n为20—45，m与n之和小于等于56。
2. —种制备锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物的制备方 法，其特征在于99mTc-DMP-NGA配合物的制备方法如下以放射性高锝酸盐 与二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白合成配体，在还原剂、保护剂的存在下反应制备 得到所述的放射性锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物，其制备 步骤为a. 将DMP-NGA配体溶于缓冲液中，按照保护剂比配体为1:0.2~10的重量 比，加入保护剂；b. 然后按还原剂比配体为1:25~500的重量比称取还原剂并溶于盐酸溶液 中；加入到步骤a所得溶液中，混合均匀，控制其pH在5.5 6.5之间；c. 将从医用99Mo-99mTc发生器中淋洗获得的99mTc04—淋洗液加入步骤b制 备的溶液中，混匀后在20°C~80°C条件下反应10 60min;d. 将步骤c所得溶液通过高效液相色谱进行纯化。
3.如权利要求2所述的锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物 的制备方法，其特征在于上述步骤a中所述的述保护剂为酒石酸钾钠，其 用量为0.5mg—5mg。
4.如权利要求2所述的锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物 的制备方法，其特征在于上述步骤a中所述的缓冲液为0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液，用量为0.1mL 5mL。
5.如权利要求2所述的锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物 的制备方法，其特征在于上述步骤b中所述的所述还原剂为将放射性高锝酸 盐还原为991"化5+的常规化学试剂，优选为二水合氯化亚锡，原剂用量为O.Olmg 一0.04mg。
6. 如权利要求2所述的锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物 的制备方法，其特征在于上述制备方法中所述的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白 配体，其配体用量为lmg—5mg;还原剂比配体为1:25~500的重量比，保护剂 比配体为1:0.2 10的重量比。
7. 如权利要求1或2所述的锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配 合物及其制备方法，其特征在于所述配合物作为肝脏受体显像剂在核医学领域 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物及其制备方法和应用，以放射性高锝酸盐(<sup>99m</sup>TcO<sub>4</sub><sup>-</sup>)与二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白合成配体(DMP-NGA)，在还原剂、保护剂的存在下反应制备得到所述的放射性锝-99m标记的二巯基丙酰胺基新乳糖白蛋白配合物。该配合物的化学稳定性及生物性能好、初始摄取值及靶与化学纯度高、制备简单及使用成本低，可作为一种新型的肝脏显像剂应用在放射性药物化学和临床核医学技术领域中。
文档编号C07K14/765GK101486763SQ200910079369
公开日2009年7月22日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者唐志刚, 张俊波, 张现忠, 杨文江, 牟甜甜, 王学斌, 洁 陆 申请人:北京师范大学;北京师宏药物研制中心