专利名称：：肠道病毒71型静注人免疫球蛋白及其制备方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种生物免疫制品，特别是涉及一种肠道病毒71型静注人免疫球蛋白及其制备方法。
背景技术：
：肠病毒在病毒学上的分类是属于微小病毒科(picornaviridae)中的肠病毒群(enterovirus),肠道病毒71简写为EV71。EV71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。EV71作为手足口病(HFMD)的主要病原体之一，感染性强、致病率高，其神经毒性仅次于脊髓灰质炎病毒。除引发上述手足口症状外，还可以引起疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样的麻痹性疾病、神经源性肺水肿或肺出血、心肌炎、急性呼吸道疾病等多种疾病。其中枢神经系统症状主要表现为肌震颤、共济失调、颅神经受累乃至心肺功能衰竭，患儿可能留下永久性神经系统后遗症甚至死亡。而另一类严重并发症为肺水肿或出血，表现为患儿发病后数天内突然发生心动过速、呼吸困难、紫绀和休克，出现双侧对称性非心源性肺水肿，这可能与脑干组织特定结构被破坏、植物神经功能紊乱有关。这也是最近中国内地EV71疫情中部分重症患儿的主要死因。根据国家卫生部数据，2008年我国手足口病例达50万人，至2009年4月份，发病人数达20余万例，重症800余人，死亡60余例，5岁以下儿童占94.8%，形势严竣。目前我国手足口病疫情正处于上升阶段，今后一段时间每周报告病例数将会呈增加趋势，预计将在5月至9月份间达到高峰。中国疾病预防控制中心副主任杨维中说，从目前情况看，近期的上升势头还是比较猛，每天全国增加报告10000多例，而今后一个较长的时间里，还会更多地增加。HFMD至今仍无有效的疫苗和特异性治疗手段，治疗轻症病例以门诊对症治疗为主。重症病例出现神经系统症状或心血管系统症状等应接收住院，重点救治。治疗原则主要是对症处理，可应用维生素B、C及抗病毒药物，但特异性差，疗效也不能充分肯定。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种有效可防治肠道病毒71型感染的疾病的静注人免疫球蛋白及其制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其中，其EV71病毒中和抗体效价大于等于1:256，免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的95%。本发明所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其中，所述免疫球蛋白仅与抗人血清产生沉淀线，与抗马、牛、猪、羊血清不产生沉淀线。本发明所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其中，所述免疫球蛋白与正常人血清比较，主要沉淀线为IgG。本发明所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其中，所述免疫球蛋白的IgG单体及二聚体含量之和大于等于96%。本发明所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其中，所述免疫球蛋白的剂型为液体剂型或冻干剂型。本发明所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其中，所述液体剂型的规格为50ml/瓶、100ml/瓶。本发明所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白的制作方法，其中，包括以下步骤a.中和试验法筛选出符合国家标准的献血者中，肠道病毒71型中和抗体效价滴度大于等于l:8的原料血桨；b.每批次的混合原料血浆由不少于1000名供血浆者的原料血浆混合而成，以中和试验法测混合原料血桨EV71抗体中和滴度，选择大于等于1:32的用于制备肠道病毒71型人免疫球蛋白；c.将b步骤所得的混合原料血浆用低温乙醇蛋白分离法或层析法，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置、除菌分装等工序制成人免疫球蛋白。本发明的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白适用于治疗包括手足口病在内的肠道病毒71型感染的疾病。具体是治疗包括手足口病及其并发症。治疗手足口病的参考剂量为2ml/kg体重计算，为静脉注射。本发明的优点:本发明提供的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，EV71病毒中和抗体效价大于等于l:256，可以针对性的对EV71病毒进行治疗，是控制EV71病毒暴发及治疗的有效药物，具有较大的社会效益和经济效益。具体实施方式实施例11、供血桨者的血浆筛选采集选择1000名符合国家献血标准的供血者血浆以中和实验法来检测血浆中的EV71中和抗体，中和效价滴度大于等于l:8;蛋白质含量(双缩脲法)大于等于55g/L;丙氨酸氨基转移酶(赖氏法)不高于25单位；乙型肝炎表面抗原阴性，梅毒阴性，HIV-l/HIV-2抗体阴性，HCV抗体阴性等均合格的为肠道病毒71型人免疫球蛋白原料血浆，低温冰冻储存，保存期不超过2年。中和实验法的测定方法为以人横纹肌肿瘤细胞(从军事医学科学院购得，第13代)(RD)作为指示细胞，培养液为含10%胎牛血清的DMEM，配制细胞浓度为1X10"个/ml的RD细胞悬液，于6孔细胞板中每孔接RD细胞悬液3ml，置于37'C、5%二氧化碳培养箱培育2-3天后接种病毒。将肠道病毒71型人免疫球蛋白供试品及培养液在细胞板中连续2倍系列稀释，共6-IO个稀释度。取肠道病毒71型以DM函稀释至浓度(100XTCID50/0.lml)等量加入供试品中，37。C孵育2小时，将中和病毒液接种于6孔细胞培养板中，每个稀释度接种2孔，0.l-0.2ml/孔，并设立病毒及正常细胞对照，将细胞板置于37'C吸附90分钟后，补加3ml病毒培养液，置37'C、5%二氧化碳培养箱培育7天。每次试验均须有病毒对照和细胞对照。病毒对照必须出现病变。细胞对照必须正常。结果判定以能保护50%细胞不出现病变的供试品稀释度为中和效价。本专利文件中所有提到的中和试验法均是以上述相同的方式进行，以下简称中和试验法。2、肠道病毒71型静注人免疫球蛋白(产品批号20090301)的制备(1)将1000名以上供血桨者的血浆融化混合，混合后体积为570L，用中和试验检测混浆中和效价为l:32;(2)混合后的血浆，在2。C下离心去除冷沉淀50Kg;(3)去除冷沉淀后的血浆(520L)用52L生理盐水稀释，用4.0醋酸缓冲液1850ml调节反应液pH值至6.5，加95%乙醇120L至反应液中，使最终乙醇浓度为20%，反应液终体积为692L,使用冷媒控制反应液温度至-4.5°C，板框压滤分离得沉淀60kg;(4)将步骤(3)的沉淀用(TC0.Olmol/LNaCl溶液540L搅拌溶解，最终溶液体积为600L(5)在上清液中加50%乙醇20礼至反应液中，使最终乙醇浓度为17%，以醋酸缓冲液3210ml调节反应液pH值至5.1，反应液终体积为804L,使用冷媒控制反应液温度至_4.5'C，板框压滤分离除去沉淀，收集上清液为780L;(6)将上清液进行超滤透析四遍后上DEAE-S印harose-FastFlow弱阴离子交换层析，反应液温度为10°C，收集流出液685L。(7)将步骤(6)的流出液进行再超滤，以醋酸缓冲液6250ml调节PH值为4.0，温度至10°C。透析8遍后浓縮至78L(蛋白含量7.4%、pH:3.40)。(8)将步骤(7)的浓縮液用2mol/L的冰醋酸260ml调pH至3.85，加入30%麦芽糖33.3L使最终浓度在10%，补加9L生理盐水使蛋白含量为5.8%，配置液最终体积为120L。(9)将上述步骤(8)所得原液在2425'C下孵放21天后用纳米膜过滤的双病毒灭活处理；柳将步骤(9)所得肠道病毒71型静注人免疫球蛋白无菌分装成1810瓶制品，取25瓶样品送质量检定部检定，该批生产的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白的批号为20090301。以中和实验法，检测其EV71病毒中和抗体效价等于1:256。3、检定上述步骤所得的批号为20090301的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白肠道病毒71型静注人免疫球蛋白检验报告书<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结论本品按肠道病毒71型静注人免疫球蛋白制造检定规程检验，结果符合规定。实施例2肠道病毒71型静注人免疫球蛋白治疗包括手足口病及其并发症的治疗实验组选择手足口病及其并发症的病人30例，男17例，女13例，平均年龄3.7岁，应用实例1制备的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白静脉注射2ml/Kg天，连续2-3天，全部病例均治愈，有效率100%。对照组选择带状疱疹病人23例，男13例，女10例，平均年龄3.5岁，均应用静注人免疫球蛋白2ml/Kg/天及一般对症治疗，连续观察7天，治愈20例，有效率87%。证明本发明可以有效的治疗手足口病及其并发症。上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。权利要求1、一种肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其特征在于，其EV71病毒中和抗体效价大于等于1∶256，免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的95％。2、根据权利要求1所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其特征在于,所述免疫球蛋白仅与抗人血清产生沉淀线，与抗马、牛、猪、羊血清不产生沉淀线。3、根据权利要求1所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白与正常人血清比较，主要沉淀线为IgG。4、根据权利要求1所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白的IgG单体及二聚体含量之和大于等于96%。5、根据权利要求1所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其特征在于,所述免疫球蛋白的剂型为液体剂型或冻干剂型。6、根据权利要求5所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其特征在于，所述液体剂型的规格为50ml/瓶、100ml/瓶。7、权利要求1至5任意一种所述的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白的制作方法，其特征在于，包括以下步骤a.中和试验法筛选出符合国家标准的献血者中，肠道病毒71型中和抗体效价滴度大于等于l:8的原料血浆；b.每批次的混合原料血浆由不少于IOOO名供血浆者的原料血浆混合而成，以中和试验法测混合原料血浆EV71抗体中和滴度，选择大于等于1:32的用于制备肠道病毒71型人免疫球蛋白；c.将b步骤所得的混合原料血浆用低温乙醇蛋白分离法或层析法，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置、除菌分装等工序制成人免疫球蛋白。全文摘要本发明公开了一种肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其中，肠道病毒71型抗体效价大于等于1∶256，其免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的96％，IgG单体及二聚体之和大于等于96％。其制造方法为在符合国家采血标准的供血浆者中，取其中肠道病毒71型病毒中和抗体IgG效价大于等于1∶32，蛋白质含量大于等于55g/L者的血浆为肠道病毒71型静注人免疫球蛋白的制备原料血浆，并将所得血浆混合；再将所得的原料血浆按低温乙醇或层析法蛋白分离工艺，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置、除菌分装等工序制成肠道病毒71型静注人免疫球蛋白，其可用于治疗包括手足口病在内的肠道病毒71型感染的疾病。文档编号C07K16/06GK101591392SQ20091008804公开日2009年12月2日申请日期2009年6月30日优先权日2009年6月30日发明者孙思才,张振湖申请人:同路生物制药有限公司