专利名称：一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种黄芪提取物，特别涉及一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途。
背景技术：
糖蛋白(glycoprotein)是一类由糖类与多肽或蛋白质以共价键连接而形成的结 合蛋白，广泛地存在于自然界动物植物和某些微生物中，是生物体内重要的一类大分子。20 世纪60年代，生物化学家和化学家们对长期忽视的糖蛋白产生了兴趣，开展了多方面的研 究。越来越多的研究发现，糖蛋白具有显著的药用功效和保健功能，能够增强免疫调节、抑 制肿瘤、降低血糖、血脂、抗氧化、防衰老等，对于人体极具利用价值。目前已应用于临床并 具有高效的免疫活性的药用蛋白制剂大都是糖蛋白。近年来，植物和天然产物来源的糖蛋 白，在生物化学、生物工程学、临床化学、药学及食品等领域受到高度重视。特别是存在于植 物中的糖蛋白，在新型特种药物及功能性食品开发方面具有广阔的运用前景。山西道地药材黄芪是一种常用补气固表中药材，能够增强机体的免疫功能。自20 世纪70年代以来，国内外学者对黄芪化学成分及药理作用进行了大量的研究，从中提取分 离许多黄酮类、皂苷类、多糖等化合物，并对其药理作用及生物活性进行了研究。但迄今为 止，尚未见到有关黄芪糖蛋白的研究报道。
发明内容
本发明目的在于公开一种黄芪糖蛋白，本发明的目的还在于公开该糖蛋白的制备 方法，本发明的目的还在于公开该糖蛋白的用途。本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明黄芪糖蛋白由如下方法制备取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取200-600重量份，加水1200-2000体积份，浸 泡8-16小时，40-60°C以下浸提1-3小时，过滤；残渣中再加水800-1600体积份，40-60°C以 下浸提1-3小时，过滤，合并两次滤液，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，合并上清
液，得粗提液；将粗提液浓缩至200-400体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和， 于2-6°C下静置12-24小时，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，弃去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置1-3小时，以2000-4000r/min速 度离心20-40分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋 白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇10-30分钟，离心，倾出上清 液，除去中间层变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；将上清液置于透析袋中，纯水透析24-72小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥， 得乳白色粉状物黄芪糖蛋白(HQGP)。本发明黄芪糖蛋白优选如下方法制备
取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取400重量份，加水1600体积份，浸泡12小 时，55-600C以下浸提2小时，过滤；残渣中再加水1200体积份，55-60°C以下浸提2小时，过 滤，合并两次滤液，以3000r/min速度离心30分钟，合并上清液，得粗提液；将粗提液浓缩至300体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于 4°C下静置12小时，以3000r/min速度离心30分钟，弃去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置2小时，以3000r/min速度离心 30分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇20分钟，离心，倾出上清液， 除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析48小时，得黄芪糖蛋白 溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白(HQGP)。本发明黄芪糖蛋白优选如下方法制备取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取300重量份，加水1900体积份，浸泡9小时， 500C以下浸提3小时，过滤；残渣中再加水1500体积份，500C以下浸提1小时，过滤，合并两 次滤液，以3500r/min速度离心35分钟，合并上清液，得粗提液；将粗提液浓缩至250体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于 3°C下静置24小时，以3500r/min速度离心35分钟，弃去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置1小时，以2500r/min速度离心 35分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇25分钟，离心，倾出上清液， 除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析24小时，得黄芪糖蛋白 溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白(HQGP)。本发明黄芪糖蛋白优选如下方法制备取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取500重量份，加水1300体积份，浸泡15小 时，45°C以下浸提1小时，过滤；残渣中再加水900体积份，45°C以下浸提3小时，过滤，合并 两次滤液，以2500r/min速度离心25分钟，合并上清液，得粗提液；将粗提液浓缩至350体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于 5°C下静置18小时，以2500r/min速度离心25分钟，弃去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置3小时，以3500r/min速度离心 25分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇15分钟，离心，倾出上清液， 除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析72小时，得黄芪糖蛋白 溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白(HQGP)。其中，所述的重量份与体积份是g/ml的关系。本发明所述黄芪蛋白呈乳白色粉状，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯 仿等有机溶剂；浓度为0. 096mg/ml的黄芪糖蛋白水溶液于23 °C下测定pH值为5.8 ；浓 度为0.08g/100ml的黄芪糖蛋白水溶液的比旋光度为-56. 38° ；紫外光谱图的特征吸收峰为 485nm 和 280nm ；红外光谱图显示于 3399. 2cm_1,2962. 6cm_1,1643. 2cm1,1546. 2cm1, 1403. 0，1246. ScnT1处有明显吸收峰；黄芪糖蛋白中糖肽的结合方式为N-糖苷键；黄芪糖蛋 白的分子量为50-55kD，优选53. 26kD。
图1 黄芪提取物紫外光谱2 黄芪提取物红外光谱3 提取物在DEAE-CelIulose 32层析柱上的洗脱曲线图4 黄芪提取物经过碱处理前后紫外光谱5:标准曲线图6 单糖组成分析图，图6. 1 =HQGP样品GC图，图6. 2 木糖(局部)，图6. 3 阿 拉伯糖(局部)，图6. 4 甘露糖(局部)，图6. 5 半乳糖(局部)，图6. 6 葡萄糖(局部)图7 =SDS-PAGE电泳图谱，1、2为HQGP样品；3为标准蛋白。本发明所述黄芪糖蛋白(HQGP)是采用硫酸铵盐析，Sevage法除游离蛋白质，再经 透析和DEAE-C32阴离子交换树脂柱层析，从黄芪水提液中分离得到的一类新的活性组分。 经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析，得其分子量约为53. 26kD。经过实验进一步得到该新 活性组分的理化性质，并通过小鼠脾淋巴细胞体外转化实验证明，本发明方法制得的具有 本发明所述理化性质的黄芪糖蛋白(HQGP)对体外培养正常小鼠脾淋巴细胞及免疫低下的 小鼠脾淋巴细胞的增殖均呈抑制作用，不同剂量HQGP组与空白对照组进行统计学比较，均 有极显著差异，并且抑制作用呈现出剂量依赖性；同时本发明黄芪糖蛋白对活化状态下小 鼠脾细胞体外增殖具有显著的抑制活性。由此证明，本发明黄芪糖蛋白具有显著的免疫调节活性。下述实验例和实施例进一步说明但不限于本发明实验例1本发明黄芪糖蛋白的理化性质研究实验1、实验材料(1)原料黄芪，购自山西浑源。(2)试剂丙烯酰胺(Acrylamide)、双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)、三羟甲基氨基 甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250、溴酚兰(BBI进口原 装)；低分子量蛋白标准(LMW-SDS markerkit) (Amersham公司)；甘氨酸(Gly)、三羟甲基 甲基甘氨酸(Tricine)、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate, AP)(均 为Amresco公司进口分装)；DEAE-Cellulose 32 (国药集团化学试剂有限公司)；氯化钠、 氢氧化钠、盐酸、硫酸铵、冰醋酸、甲醇、乙醇、正丁醇、甘油、氯仿(均为国产分析纯)；二次 蒸馏水；透析袋(美国)。(3)仪器=AKTA Purif ier_10型生物活性分子系统，美国PharmaciaBiotech公司； TE612-L型电子天平，德国赛多利斯仪器系统有限公司；VarianCary50紫外可见分光光度 计；LR4001型旋转蒸发仪，德国HE100LPH公司；98-1-B型电子恒温电热套，Heto FD8真空 冷冻干燥箱(丹麦)；天津市泰斯特仪器有限公LD5-10B型低速离心机，北京医用离心机 厂；CA-Illl型冷水循环装置，上海爱朗仪器有限公司；SHB-88型循环水式真空泵，郑州长 城科贸有限公司；THE-D台式恒温振荡器(空气浴)，太仓市实验设备厂。
2、实验方法(1)按本发明实施例1所述方法经过分离、纯化制得本发明黄芪提取物。(2)物态⑴所得黄芪提取物呈乳白色粉状。(3)溶解性测定取(1)所得黄芪提取物少量，分别以水，甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、 氯仿等有机溶剂试验其溶解性，结果表明该提取物呈乳白色粉状，易溶于水，不溶于甲醇、 乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂。(4)PH值测定将(1)所得黄芪提取物配制成浓度为0.096mg/ml的水溶液，于 23. °C测定 PH 值=5.8。(5)比旋光度测定将(1)所得黄芪提取物配置成浓度为0. 08g/100ml的水溶 液，以二次蒸馏水做空白，1.002g/100ml的葡萄糖溶液做校正测量得HQGP的比旋光度 为-56.38° 。(6)紫外、红外光谱分析将⑴所得黄芪提取物配置成浓度为0.5mg/ml的水溶液，以水为空白，在 200nm-320nm波长范围内扫描得紫外光谱图，如附图1所示，紫外光谱图显示特征吸收峰为 485nm 禾口 280nmo取上述水溶液少量，采用KBr压片法，在^ΟΟοπ^-δΟΟοπΓ1范围内扫描，得红外图 谱，如附图2所示，吸收峰位于SSOOcn^lSOOcnT1之间，表明本发明提取物为糖类化合物， 3399. 2,2962. 6，1643. 2，1546. 2，1403. 0，1246. 5cm_l 处有明显吸收峰，进一步证明该样品 为糖蛋白。其中3399. 2cm-1左右为多糖羟基伸缩振动吸收峰，2962. ecnT1左右为糖C-H伸 缩振动吸收峰，1403cm"1为多糖C-O振动吸收峰，1246. ScnT1为吡喃糖环醚键C-O-C的吸收 峰，1643. 2CHT1和1546. 2cm"1处为酰胺基的N-H振动吸收峰。(7)生物活性分子系统分析取(1)所得的黄芪提取物，经DEAE-CelIulose 32柱层析，分别用0. 05mol/lLNaCl 和0. Imol/LNaCI为洗脱液依次洗脱，在糖蛋白特征吸收峰485nm和280nm处测定其吸光 度，以吸光度为纵坐标，得出HQGP吸光度与流出时间曲线图。如附图3所示，485nm处多糖 吸光峰和280nm处蛋白吸光峰出现的时间一致，说明该提取物具有糖蛋白的特征。(8)糖肽键类型的测定取(1)所得的黄芪提取物配成0. 5mg/ml的水溶液和0. 5mg/ml的NaoH(0. 2mol/L) 溶液，于45°C水浴处理2h，分别以水和0. 2mol/L的NaoH溶液为空白，在200nm-400nm范围 内扫描得紫外光谱图，如附图4所示，水溶液和碱处理样品的紫外光谱图在230nm-240nm间 均未出现吸收，及未出现羟基不饱和氨基酸的特征吸收，由此确定该黄芪提取物中糖肽的 结合方式为N-糖肽键。(9)总糖含量测定用硫酸-苯酚法显色，以0. 02mg/ml、0. 04mg/ml、0. 06mg/ml、0. 08mg/ml、0. IOmg/ ml的葡萄糖溶液做标准在475nm处测定，得标准曲线为Abs = 5. 22884*C+0. 23032 ；r = 0. 98042 ；将(1)所得黄芪提取物配制成0. 5mg/ml水溶液，在同等条件下测定吸光度，计算 得总糖含量为6.0%，见附图5。(10)单糖组成分析取木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸各4. 6mg于6支安瓿瓶中，各加2moL/L的F3CC00H2mL后封管，120°C水解3h，滤去水解液中的残渣，蒸干后用ImL水洗 一次，蒸干水分，各加入0. 13mL无水吡啶和4mg盐酸羟胺，于90°C水浴30min，冷却后各加 0. 2mL无水乙酸酐，于90°C乙酰化30min，浓缩，进行GC分析。取糖混合样4. 6mg (含上述六 种糖各约0. 8mg)和4. 6mg的该黄芪提取物样品同上法制得供试品。GC 分析条件19091J-433HP-5 毛细管柱(30m*0. 25mm*0. 25um)；升温程序为 80°C始以8. 0°C /min升至160°C并保持2min，以5. 0°C /min升至200°C并保持3min，再 以2. 0° c/min升至230°C并保持2. Omin ；FID检测器，N2为载气，流速为0. 6mL/s，分流为 10mL/mino如图6所示，该提取物单糖组成主要含有葡萄糖和阿拉伯糖等。(11)分子量测定取(1)所得黄芪提取物进行SDS-PAGE电泳，分离胶质量分数为15%，电极缓冲液 为pH = 8. 3的1. 5mol/L Tris-Gly-SDS溶液，采用考马斯亮蓝R-250染色，脱色液为7% 的冰乙酸，上样量25yg。同时，采用LMW-SDS markerkit作为对照，溴酚蓝为指示剂，得 SDS-PAGE电泳图谱，如附图7所示，样品经SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝R-250染色，得 一条均一的染色带区，表明该提取物达到电泳纯。根据样品的相对迁移率，测得其分子量约 为 53. 26kD。(12)氨基酸组成分析取(1)所得的黄芪提取物，采用氨基酸自动分析仪检测，该 提取物的氨基酸组成如表1所示表1.黄芪提取物中氨基酸组成及含量
序号项 目g/100g序号项目g/100g1天门冬氨酸(Asp)4. 5010异亮氨酸(Ile)2. 312苏氨酸(Thr)3. 2011亮氨酸(Leu)2. 343丝氨酸(Ser).2.3312酪氨酸(Tyr)4. 394谷氨酸(Glu)6. 4913苯丙氨酸(Phe)1. 935甘氨酸(Gly)3.8314赖氨酸(Lys)6. 506丙氨酸(Ala)1.6815组氨酸(His)2. 007胱氨酸1.4216精氨酸(Arg)1. 448缬氨酸(Val)5.9917脯氨酸(Pro)5.919蛋氨酸(Met)0. 92氨基酸总量57. 18
磷酰胺
实验例2本发明黄芪糖蛋白的小鼠脾淋巴细胞体外转化实验 1、实验材料
(1)动物8 12周龄雄性Balb/c小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所
(2)试剂本发明实施例1所得的黄芪提取物(HQGP)山西中医学院提供；
黄芪多糖粉针剂(Astragalus polysaccharides, APS-P)美国泛华医药公司；环 (CTX)山西普德药业有限公司； 刀豆蛋白A、脂多糖(LPS)、四噻唑盐(MTT)为Sigma公司产品； RPMI1640培养基Hyclone改良型，赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司； 小牛血清杭州四季青生物材料有限公司
(3)仪器C02培养箱(德国BINDER)；酶标仪(瑞士Tecan Safire2)；低温离心机
8(日本 Sanyo)2、实验方法(1)动物处理将10只小鼠随机分为两组，腹腔注射给药。第一组为正常对照组， 注射生理盐水，0. lml/10g体重，第二组为模型组，注射环磷酰胺，40ml/10g体重。给药2天。(2)小鼠脾细胞制备第三天颈椎脱臼处死小鼠，75%乙醇浸泡3分钟，无菌取出 脾脏，通过200目细胞筛，1500r/min离心10分钟，弃上清，加入6ml 8. 3ml/L Tris-NH4CL, 室温放置10分钟裂解红细胞后1500r/min离心10分钟，弃上清，加入无血清RPMI1640培 养基洗涤2次，每次1500r/min离心10分钟，弃上清，加入1 2ml RPMI1640培养基，调节 细胞悬液密度为3 X 106/ml，并用台盼蓝染色检测细胞活力> 95 %。(3)脾淋巴细胞体外转化的测定将制备的正常对照组脾细胞悬液加入96孔细胞 培养板中，每孔100μ 1，分为4组①空白对照，加入RPMI 1640培养基ΙΟΟμ 1 ；②刀豆蛋白 A 8 μ 1终浓度为4 μ g/ml ；③脂多糖30 μ 1终浓度为15 μ g/m ；④不同浓度的本发明实施例 1 所得的黄芪提取物(0. 5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml、10 μ g/ml、30 μ g/ml、90 μ g/ ml)。总体积为200 μ 1。每组设3个复孔。将制备的模型组脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100 μ 1。分组及给药剂 量同正常对照组脾细胞。每组设3个复孔。然后将细胞板放入37°C C02培养箱68小时，吸弃100 μ 1上清，每孔加入5mg/ml MTT 10 μ 1，继续培养6小时，每孔加入100μ 1含0. OlN盐酸的10% SDS，充分溶解细胞。在 Tecan Safire2全波长酶标仪上测0D570吸光值，以表示淋巴细胞转化增殖的大小。3、统计学处理数据资料用 ±s表示，应用SPSS13. 0进行统计学处理，各组均数之间比较进行 one-way ANOVA 检验。4、实验结果MTT结果见表2、表3。黄芪提取物对体外培养正常小鼠脾淋巴细胞及免疫低下的 小鼠脾淋巴细胞的增殖均呈抑制作用，不同剂量HQGP组与空白对照组进行统计学比较，均 有极显著差异，并且抑制作用呈现出剂量依赖性，该黄芪提取物具有显著的免疫调节活性。表2黄芪提取物对正常小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响(n = 3，5 士s)
_ Μ_剂量(μ g/ml)_0D570nm_
空白组 一 0. 1358±0.0026 刀豆蛋白 A 组 4 0.9678±0.0397* 脂多糖组 15 0. 5898±0. 0248* _黄芪提取物 1_05_0. 1193±0. 0079*_
权利要求
一种黄芪糖蛋白(HQGP)，其特征在于该糖蛋白的分子量为50 55kD。
2.如权利要求1所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该糖蛋白的分子量为53.26kD。
3.如权利要求1或2所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该糖蛋白呈乳白色粉状，易溶 于水，不溶于有机溶剂甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿；浓度为0. 096mg/ml的黄芪糖蛋白水 溶液于23°C下测定pH值为5. 8 ；浓度为0. 08g/100ml的黄芪糖蛋白水溶液的比旋光度 为-56. 38°。
4.如权利要求1或2所述的黄芪糖蛋白，其特征在于将该黄芪糖蛋白配置成浓度为 0. 5mg/ml的水溶液，以水为空白，在200nm-320nm波长范围内扫描得紫外光谱图，显示特征 吸收峰为485nm和280nm。
5.如权利要求1或2所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该黄芪糖蛋白配置成浓度为 0. 5mg/ml的水溶液，采用KBr压片法，在^ΟΟαι^-δΟΟαιΓ1范围内扫描，得红外图谱，吸收 峰位于 3500cm_1-2800cm_1 之间，3399. 2,2962. 6，1643. 2，1546. 2，1403. 0，1246. 5cm_l 处 有明显吸收峰；其中3399. 2cm-1为多糖羟基伸缩振动吸收峰，2962. θ^1糖C-H伸缩振动 吸收峰，1403cm"1为多糖C-O振动吸收峰，1246. 5cm"1为吡喃糖环醚键C-O-C的吸收峰， 1643. 2cm"1和1546. 2cm"1处为酰胺基的N-H振动吸收峰。
6.如权利要求1或2所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该糖蛋白的糖肽的结合方式为 N-糖肽键。
7.如权利要求1或2所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该糖蛋白中氨基酸组成及含量为 每IOOg糖蛋白含氨基酸总量57. 18g，其中天门冬氨酸4. 50g,苏氨酸3. 20g,丝氨酸2. 33g， 谷氨酸6. 49g，甘氨酸3. 83g，丙氨酸1. 68g，胱氨酸1. 42g，缬氨酸5. 99g，蛋氨酸0. 92g，异 亮氨酸2. 31g，亮氨酸2. 34g，酪氨酸4. 39g，苯丙氨酸1. 93g，赖氨酸6. 50g,组氨酸2. OOg, 精氨酸1.448，脯氨酸5.918。
8.如权利要求1至7任一所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该糖蛋白由如下方法制备而成取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取200-600重量份，加水1200-2000体积份，浸泡 8-16小时，40-60°C以下浸提1-3小时，过滤；残渣中再加水800-1600体积份，40_60°C以下 浸提1-3小时，过滤，合并两次滤液，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，合并上清液，得粗提液；将粗提液浓缩至200-400体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于 2-6°C下静置12-24小时，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，弃去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置1-3小时，以2000-4000r/min速度离 心20-40分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白； 把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇10-30分钟，离心，倾出上清液， 除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；将上清液置于透析袋中，纯水透析24-72小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳 白色粉状物黄芪糖蛋白。
9.如权利要求8所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该糖蛋白由如下方法制备而成 取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取400重量份，加水1600体积份，浸泡12小时，55-600C以下浸提2小时，过滤；残渣中再加水1200体积份，55_60°C以下浸提2小时，过滤，合并两次滤液，以3000r/min速度离心30分钟，合并上清液，得粗提液；将粗提液浓缩至300体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于4°C下 静置12小时，以3000r/min速度离心30分钟，弃去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置2小时，以3000r/min速度离心30分 钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇20分钟，离心，倾出上清液，除去 中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析48小时，得黄芪糖蛋白溶 液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白。
10.如权利要求8所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该糖蛋白由如下方法制备而成 取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取300重量份，加水1900体积份，浸泡9小时，50°C以下浸提3小时，过滤；残渣中再加水1500体积份，500C以下浸提1小时，过滤，合并两次滤 液，以3500r/min速度离心35分钟，合并上清液，得粗提液；将粗提液浓缩至250体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于;TC下 静置24小时，以3500r/min速度离心35分钟，弃去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置1小时，以2500r/min速度离心35分 钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇25分钟，离心，倾出上清液，除去 中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析24小时，得黄芪糖蛋白溶 液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白。
11.如权利要求8所述的黄芪糖蛋白，其特征在于该糖蛋白由如下方法制备而成 取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取500重量份，加水1300体积份，浸泡15小时，450C以下浸提1小时，过滤；残渣中再加水900体积份，450C以下浸提3小时，过滤，合并两 次滤液，以2500r/min速度离心25分钟，合并上清液，得粗提液；将粗提液浓缩至350体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于5°C下 静置18小时，以2500r/min速度离心25分钟，弃去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置3小时，以3500r/min速度离心25分 钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇15分钟，离心，倾出上清液，除去 中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析72小时，得黄芪糖蛋白溶 液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白。
12.如权利要求1至7任一所述的黄芪糖蛋白在制备免疫抑制药物中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于其中所述的免疫抑制是指对体外培养正常 脾淋巴细胞及免疫低下的脾淋巴细胞的增殖均呈抑制作用。
14.如权利要求12所述的应用，其特征在于其中所述的免疫抑制是指抑制T细胞和B 细胞增殖。
全文摘要
本发明公开一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途，本发明所述黄芪糖蛋白是从黄芪水提液中经硫酸铵盐析，Sevage法除游离蛋白质，再经透析和DEAE-C32阴离子交换树脂柱层析，分离纯化得到的一类新的活性组分。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析，得其分子量约为53.26kD。经过实验进一步测定了该新活性组分的理化性质，并通过药效实验证明，本发明黄芪糖蛋白具有显著的免疫抑制作用，临床上可以作为一种经济有效的免疫抑制剂使用，具有广阔的市场前景。
文档编号C07K1/30GK101962402SQ200910089580
公开日2011年2月2日 申请日期2009年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者冯前进, 刘亚明, 宋强, 张立伟, 杨向竹, 牛欣, 王永辉, 薛慧清, 赵俊云 申请人:山西中医学院