专利名称：一种从山核桃外果皮中提取球松素及β-谷甾醇的方法
技术领域：
本发明属于^r》素及p -谷甾醇提取方法技术领域，具体为一种从山核桃外果皮 中提取^^素及e -谷甾醇的方法。
山核杉s Juglans mandshurica Maxim， 为胡杉〖禾斗Juglandaceae， 山核杉〖属Carya
植物，主产于浙江临安、淳安和安吉等地。山核桃未成熟时核外部有一层厚厚的绿色 外果皮，随着山核桃逐渐成熟并!棘摘剥离后，该外果鹏色会渐渐变棕红。剥离后 的山核桃外果皮量非常大，果实与外果皮重量比几乎为l:l，因此废弃后造成极大的 浪费。经文献报道，山核桃叶、树皮和外果皮均可入药。山核桃树皮味苦、辛、性寒, 可清热、夂鄉、清肠、杀虫。近年来它应用于治疗消化系统、肿瘤，尤其对食管癌、 胃癌均有显著疗效。山核桃外果皮其性淡、味苦涩、有毒，具有抗肿瘤、镇痛消炎、 拟菌杀菌、消肿止庠、清热利尿、明目解毒等功效。 球松素为5-羟基-7-甲氧基二氢黄酮，其结构式为
属于二氢黄酮类化合物，具有抑菌、消炎的活性，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄 球菌、大肠杆菌等具有较强的抑菌作用。 e-谷甾醇的结构式为
背景技术：
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e-谷甾醇能抑制人体对胆固醇的吸收，具有降低血脂的作用，可预防和治疗冠 心病、动脉粥样硬化，同时具有防治前列腺肥大、抗炎、抑制肿瘤、抑制乳腺增生和 调节免疫等方面的作用，还有报道3-谷甾醇具有保肝护肝的作用。因此研究幵发高 纯度球松素及P-谷甾醇纯品，可广泛应用于食品、医药等行业用做生产食品、药品 的原料和对照品等，因此具有广阔的市场潜力。
国内现有的分离纯化球松素及3 -谷甾醇的报道仅限于对植物原料进行系统化 学成分研究，从中分离并鉴定出它们的化学结构的基5蹄开究报道，而未从工艺方法上 给出提取分离中的具体工艺参数，也不考虑产品纯度、工艺方法及步骤、生产成本、 环境污染等问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种从山核桃外果 皮中提取球松素及P-谷甾醇的方法的技术方案，其工艺简单，生产成*^低，制得 的产品纯度高。
戶腐的一种从山核杉挑果皮中提取球松素及P-谷甾醇的方法，其特征在于包括 以下步骤
1) 将山核桃外果皮洗净，晾干，粉碎，过筛；
2) 经步骤l)处理后的原料用95%乙醇溶胀后进行渗漉提取，收麟漉液；
3) 将渗漉液在50。C以下真空薄膜浓缩至无醇味，回收乙醇，得到、 液；
4) 有机M!J萃取将、WI液超声分散到水中，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液减 压 ，回收溶剂，萃取,液真空^P燥，得到萃取物干粉；
5) 萃取物干粉采用硅胶柱色谱分离5a)分别采用石油醚和体积比为45 : 1 15 : 1的石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯 度洗脱，合并洗脱液；
5b)采用体积比为io : i i: 20的石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，合并
洗脱液；
6) 離鄉析晶将步骤5a)、 5b)得到的洗脱液分别进行 鄉，回收溶 剂，放凉，析出沉淀，抽滤，除去母液，洗涤沉淀后分别得到球松素粗晶和P _谷甾 醇粗晶；
7) 重结晶处理将^^素粗晶和卜谷甾醇粗晶分另佣石油醚-丙酮混合翻腿 行重结晶，即得球松素结晶和P-谷甾醇结晶。
所述的一种从山核杉〖外果皮中提取球松素及P -谷甾醇的方法，其特征在于步骤
1) 中山核杉〖外果皮洗净自然晾干后，先置35-45。C的烘箱中干燥20-28小时，再取 出粉碎成粗粉，过20 40目筛。
所述的一种从山核桃外果皮中提取球松素及P -谷甾醇的方法，其特征在于步骤
2) 中经步骤1)处理后的原料用95%乙醇溶胀3. 5 4. 5小时后^A渗漉筒中，以 95%乙醇为歸1诚行渗漉提取，^il为5 10 mL/min，收集10 20倍量的渗漉液。
所述的一种从山核杉〖外果皮中提取球松素及3 -谷甾醇的方法，其特征在于步骤
4) 中将 液超声分散到水中得到水溶液，用乙酸乙酯萃取4次，前2次每次用量 为水溶液的1 1. 5倍量，后2次每次用量为水溶液的0. 4 0. 6倍量；合并萃取液减 压浓縮，回收溶剂，真空^P燥，得到乙酸乙酯萃取物干粉。
所述的一种从山核桃外果皮中提取^^素及3 -谷甾醇的方法，其特征在于步骤
5) 中萃取物干粉采用160 200目的硅胶G进行柱色谱分离，湿法装柱，后干法上样。
所述的一种从山核杉挑果皮中提取;^公素及e -谷甾醇的方法，其特征在于步骤 5a)中石油醚-乙酸乙酯的体积比为40 : 1 20 : i，优选为40 : 1 30 : i; 步骤5b)中石油醚-乙酸乙酯的体积比为5: 1 1 : io，优选为5 : 1 1: l。
6所述的一种从山核桃外果皮中提取球松素及P -谷甾醇的方法，其特征在于步骤
6) 中将步骤5a)、 5b)得到的洗脱液分别Mi5^L缩至原液体积的1/5-1/10，用石油 醚洗涤沉淀分另幌至M^素粗晶和e-谷甾醇粗晶。
所述的一种从山核桃外果皮中提取^^素及3 -谷甾醇的方法，其特征在于步骤
7) 中^^素粗晶采用体积比20:1 10:1的石油醚-丙酮混合溶剂进行重结晶；P-谷甾醇粗晶采用体积比5:1 1:1的石油醚-丙酮混合溶剂进行重结晶。
所述的一种从山核桃外果皮中提取^^素及P -谷甾醇的方法，其牛寺征在于所述 石油醚的沸程为60 90°C。
所述的一种从山核桃外果皮中提取球松素及3 -谷甾醇的方法，其特征在于渗漉 提取时，、繊为6 8 mL/min，收集15 18倍量的渗漉液。
吸附色谱的原理是利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差异而实 现分离的一类色谱。常用的吸附剂包括硅胶和氧化铝。硅胶吸附色谱的应用较 广泛，中草药中的各类化学成分大多均可用其进行分离。吸附剂的填装分为干 法和湿法两种。干法将吸附剂一次加入色谱柱，振动管壁使其均匀下沉，然 后沿管壁缓缓加入洗脱剂；湿法将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡， 徐徐倾入色谱柱中，然后加入洗脱剂将附着管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平 整；填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下，液面和柱表面相平时，即可加 样品溶液。
梯度洗脱流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂 组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使 样品的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，提高分离效果。
上述一种从山核桃外果皮中提取球松素及P -谷甾醇的方法，以山核桃剥离后的 废弃物一山核桃外果皮为原料，原料来源丰富、成本低，提取分离工艺简单，操作方 便，设紐资少，过程中不4顿有毒溶剂，无环境污染，所用溶齐何回附顿，生产
7成本低；制得的球松素结晶及e-谷甾醇结晶，经高效液相色谱峰面积归一化法标定 纯度，两者含量均大于98%，产品纯度高，可用于实验室及工业化生产中，适合做 标准品及医药原料。通过综合开发利用山核桃外果皮，可增加农产品的附加值，因此 具有一定的经济价tt^现实意义。
本申请文件中涉及的百M量除另有说明外，液体的百M量为体积比，固体的 百分含量为重量比。
具体实施例方式
现结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
一种从山核杉挑果皮中提取^^素及3 -谷甾醇的方法，包括以下步骤
1) 原料处理将山核桃外果皮洗净自然晾干后，先置4(TC烘箱中干燥24小时， 再取出粉碎成粗粉，过20 40目筛；
2) 提取经步骤l)处理后的原料用95%乙醇溶胀4小时后駄渗漉筒中，以 95%乙醇为辭1」进行渗漉提取，控制流速为8 mL/min，收集15倍量的渗漉液；
3) ^ffi浓瓶将渗漉液在5(TC以下真空薄膜浓縮至无醇味，回收乙醇，得到浓 縮液；
4) 有机溶剂萃取将l顿鹏声分散到水中得到水溶液，加水量使其达到含1 g 原料/raL7jC溶液；用乙酸乙酯萃取4次，前2次每次用量为水溶液的1倍量，后2次 每次用量为水溶液的0. 5倍量；合并萃取液Mffi鹏宿，回收溶剂，真空千燥，得到乙 酸乙酯萃取物干粉；
5) 硅胶柱色谱分离萃取物干粉采用160 200目的硅胶G进行柱色谱分离，硅
胶G和石油醚混合后湿法装柱，萃取物干粉和少量硅胶G及，幌合炒干后干法上样;
5a)分别采用石油醚和体积比为40 : 1、 30 : 1的石油醚-乙酸乙酯混合、M行梯 度洗脱，合并洗脱液；
5b)采用体积比为5: l、 l: i的石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，合并洗脱液；
6) ^ffi浓缩析晶将步骤5a)、 5b)得到的洗脱液分别进行, 至原液体 积的1/5 1/10，，回收溶剂，放凉，析出沉淀，抽滤，除去母液，用石油醚洗涤沉 淀分别得到^^素粗晶和P-谷甾醇粗晶；
7) 重结晶处理球松素粗晶采用体积比为10:1的石油醚-丙酮混合^腿行重
结晶，即得^^素结晶；e-谷甾醇粗晶采用体积比为m的石油醚-丙酮混合溶剂进
行重结晶，即得P-谷甾醇结晶。
在上述提取方法中步骤U中烘箱温度为35'C或45"C， ^B喿时间为20小时、 26小时或28小时；步骤2)中溶胀时间为3. 5小时或4. 5小时，流速为5 mL/min、 6 mL/min或10 mL/min,收集12、 16、 20倍量的渗漉液；步骤4)中用乙酸乙酯萃 取前2次敏細量为水溶液的1. 2或1. 5倍量，后2次每次用量为水溶液的0. 4或
0. 6倍量；步骤5a)中采用石油醚 乙酸乙酯体积比为45 : 1、 25 : 1，或35 : 1、 20 :
i，或40 : i、 15 : i进行梯度洗脱；步骤5b)中采用石油醚-乙酸乙酯体积比为io :
1、 l:5，或5: l、 i: io，或15 : l、 l: 5进行梯度洗脱；其它方法和上述具体工 艺步骤相同，也基本能达到本发明所述的技术效果。
上述步骤2)中收集10 20倍量渗漉液的意思是渗漉液的多少根据原料重量 来决定，若外果皮粗粉为lkg，则渗漉液的体积为10 20升。步骤4)中加水量使其 达至晗1 g原料/mL水溶液的意思是加水量的多少根据原料重量来决定，若外果皮 粗粉为lkg，提取鄉后，在M液中加水，使水溶液体积达到1000ml。本发明所采 用的石油醚沸程为60 90°C。
采用上述方法制得的球松素结晶及P-谷甾醇结晶，经高效液相色谱峰面积归一 化法标定纯度，两者含量均大于98Q/^，产品纯度高，可用于实验室及工业化生产中， 适合做标准品及医药原料。
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权利要求
1、一种从山核桃外果皮中提取球松素及β-谷甾醇的方法，其特征在于包括以下步骤1)将山核桃外果皮洗净，晾干，粉碎，过筛；2)经步骤1)处理后的原料用95％乙醇溶胀后进行渗漉提取，收集渗漉液；3)将渗漉液在50℃以下真空薄膜浓缩至无醇味，回收乙醇，得到浓缩液；4)有机溶剂萃取将浓缩液超声分散到水中，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液减压浓缩，回收溶剂，萃取浓缩液真空干燥，得到萃取物干粉；5)萃取物干粉采用硅胶柱色谱分离5a)分别采用石油醚和体积比为45∶1～15∶1的石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，合并洗脱液；5b)采用体积比为10∶1～1∶20的石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，合并洗脱液；6)减压浓缩析晶将步骤5a)、5b)得到的洗脱液分别进行减压浓缩，回收溶剂，放凉，析出沉淀，抽滤，除去母液，洗涤沉淀后分别得到球松素粗晶和β-谷甾醇粗晶；7)重结晶处理将球松素粗晶和β-谷甾醇粗晶分别用石油醚-丙酮混合溶剂进行重结晶，即得球松素结晶和β-谷甾醇结晶。
2、 如权利要求1戶腿的一种从山核桃外果皮中提取^^素及P -谷甾醇的方法， 其特征在于步骤1)中山核桃外果皮洗净自然晾干后，先置35-45。C的烘箱中干燥 20-28小时，再取出粉碎成粗粉，过20 40目筛。
3、 如权利要求1所述的一种从山核杉附果皮中提取^^素及P -谷甾醇的方法， 其特征在于步骤2)中经步骤l)处理后的原料用95%乙醇溶胀3.5 4.5小时后装 入渗漉筒中，以95%乙醇为溶剂进行渗漉提取，流速为5 10mL/min，收集10 20倍量的渗漉液。
4、 如权利要求1所述的一种从山核桃外果皮中提取^^素及e -谷甾醇的方法， 其特征在于步骤4)中将^fl液超声分散至lj水中得到水溶液，用乙酸乙酯萃取4次， 前2次每次用量为7K溶液的1 1. 5倍量，后2次每次用量为7jC溶液的0. 4 0. 6倍量;合并萃取液wm^，回收翻"，真空千燥，得到乙酸乙酯萃取物干粉。
5、 如权利要求1所述的一种从山核杉〖外果皮中提取球松素及后-谷甾醇的方法， 其特征在于步骤5)中萃取物干粉采用160 200目的硅胶G进行柱色谱分离，湿法 装柱，后干法上样。
6、 如权利要求1所述的一种从山核杉挑果皮中提取^f^素及3 -谷甾醇的方法， 其特征在于步骤5a)中石油醚-乙酸乙酯的体积比为40 : 1 20 : 1，,为40 : l 30 : i;步骤5b)中石油醚-乙酸乙酯的体积比为5: i i : io，雌为5: 1 1: i。
7、 如权利要求l所述的一种从山核杉〖外果皮中提取^T公素及P -谷甾醇的方法，其特征在于步骤6)中将步骤5a)、 5b)得到的洗脱液分别减压浓縮至原液体积的 1/5-1/10，用石油醚洗涤沉淀分别得到球松素粗晶和P-谷甾醇粗晶。
8、 如权利要求1所述的一种从山核杉〖外果皮中提取^fe嗜及3 -谷甾醇的方法， 其特征在于步骤7)中^^素粗晶采用体积比20:1 10:1的石油醚-丙酮混合、M!J 进行重结晶；3 -谷甾醇粗晶采用体积比5: 1 1:1的石油醚-丙酮混合、翻!j进行重结 晶。
9、 如权利要求1所述的一种从山核杉〖外果皮中提取^^素及3 -谷甾醇的方法， 其特征在于所述石油醚的沸程为60 90°C。
10、 如权利要求3戶舰的一种从山核杉斷果皮中提取^^素及P -谷甾醇的方法， 其特征在于渗漉提取时，流速为6 8 mL/min，收集15 18倍量的渗漉液。
全文摘要
一种从山核桃外果皮中提取球松素及β-谷甾醇的方法，属于球松素及β-谷甾醇提取方法技术领域。包括以下步骤将山核桃外果皮洗净，粉碎；然后用乙醇溶胀后渗漉提取，收集的渗漉液浓缩得浓缩液；将浓缩液用有机溶剂萃取，得萃取物干粉；萃取物干粉采用硅胶柱色谱分离a)分别采用石油醚和体积比为45∶1～15∶1的石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，合并洗脱液；b)采用体积比为10∶1～1∶20的石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，合并洗脱液减压浓缩析晶，得球松素粗晶和β-谷甾醇粗晶；重结晶处理得球松素结晶和β-谷甾醇结晶。该方法工艺简单，生产成本低，制得的球松素结晶及β-谷甾醇结晶含量均大于98％。
文档编号C07C49/755GK101475459SQ200910095730
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者刘元慧, 张智俊, 珂 袁 申请人:浙江林学院