一种新的松香烷型二萜化合物及其制备和用途的制作方法

专利名称：一种新的松香烷型二萜化合物及其制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体是以贵州省龙里县产的冬凌草为原料 首次分离到的松香烷型二萜化合物雪花草丁素及其制备方法和用途。上述 化合物对肿瘤细胞株具有明显的抑制作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的 先导化合物，也可以作为研制治疗各种临床常见多发癌症的药物。
背景技术：
冬凌草T50c/o/ ri/Z esce/ ce (Hemsl. ) Hara系唇形科香茶菜属多年生 草本或灌木、半灌木，又名雪花草、冰凌花、冰凌草、六月令、山荏、破 血丹、明镜草、彩花草、山香草。分布于河南、四川、贵州等地海拔400-1500 米山坡灌丛、林地、砾石地等向阳处。具清热解毒、消炎止痛、健胃活血 及抗肿瘤功效，民间用于治疗食管癌己有几十年的历史[《贵州植物志》编 辑委员会.贵州植物志(第八巻)[M].四川成都四川民族出版 社，1988， 12:493-494.]。
冬凌草中的次生代谢成分类型异常丰富，往往因产地、季节的不同， 其化学成分有较大的差异。目前，已经从冬凌草及其变种中分离出来的二 萜有对映贝壳杉垸型(ent-kaurane)、对映-6， 7-断裂-贝壳杉烷型(ent-6， 7-seco-kaurane type )、对映-8， 15_断裂-贝壳杉烷型(ent-8 ， 15-seco-kaurane type )、对映-15， 16-断裂-贝壳杉垸型(ent-15，16-seco-kaurane type )、对映-7 ， 20-环-贝壳杉火完型(ent-7 ， 20-cyclo-kaumne type)、对映贝壳杉烷二聚体(ent-kaurane dimmer)、 杂贝壳杉烷 (Miscellaneous-ent-kaurane )、 对映松香烷型 (ent-abietane)。 [H. D. Sun， Y丄Xu， B. Jiang, Diterpenoids from Isodon Species[M]， Science Press: Beijing, 2001 ;H. D. Sun， S. X. Huang, Q. B. Han，Diterpenoids from Isodon Species and their biological activities, ^3亡尸rr;d /fep， 2006， 23， 673—698.]
本发明中的松香烷型二萜化合物为首次从冬凌草中分离提取得到的新 化合物，在已有文献中未有报道，而实验证明这个化合物具有明显的抑制 肿瘤细胞活性，可以在制备治疗癌症或肿瘤的药物中应用。

发明内容
1、 发明目的
本发明的- 个目的在于提供从冬凌草中提取分离得到的--个新的松香 烷型二萜化合物冬凌草丁素。
本发明的另--个目的是提供上述松香烷型二萜化合物雪花草丁素的制 备方法。
本发明的又一个目的是提供上述松香烷型二萜化合物冬凌萆丁素在制 备癌症和/或肿瘤药物中的应用。
2、 技术方案本发明人在现有技术的基础上又做了进-一步的研究，发 现贵州省龙里县产的冬凌草叶的浸膏中其抗癌的活性成分主要是本发明的 松香烷型二萜化合物。并经资料查阅目前还没有文献报道松香烷型二萜化 合物雪花草丁素用于癌症和/或肿瘤的治疗。本发明从贵州省龙里县产的冬
5凌草(Isodon rubescence (Hemsl. ) Har9)中首次提取分离得到一种松香 垸型二萜化合物，名称为雪花草丁素，化学名为8P， 9a-二羟基-松香烷 -13-烯-8， 20-酯-20-酸，其分子式为C2l)H3。04，化学结构式如下
一种松香烷型二萜化合物雪花草丁素的制备方法，其步骤依次是
(1) 乙醇加热回流提取阴千的冬凌草叶，经粉碎后用乙醇加热回流 提取，趁热过滤，得稀乙醇提取液；
(2) 浓縮稀乙醇提取液将稀乙醇提取液减压浓缩，得乙醇浸膏；
(3) 萃取乙醇浸膏用蒸馏水溶解，再用氯仿萃取，保留氯仿萃取相， 得稀氯仿萃取液；
(4) 浓縮稀氯仿萃取液将稀氯仿萃取液减压浓縮，得氯仿浸膏；
(5) 柱层析分离将氯仿浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200 300目，用石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓縮合 并类似洗脱流分，静置，过滤得雪花草丁素粗品。
(6) 单体化合物的纯化雪花草丁素粗品用丙酮反复重结晶得本发明
的雪花草丁素。
上述工艺步骤(1)中乙醇体积浓度为95% 85%。
上述工艺步骤(5)中洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯混合液，石油醚与乙酸乙酯的体积配比为l: 0或9: l或7: l或5: 1。
本发明产品经超导核磁共振波谱、质谱、傅立叶变换红外光谱等多种 手段检测，确定了雪花草丁素的分子式为(:2(扎。04，化学结构式
产品雪花草丁素为白色絮状固体，易溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲
醇等有机试剂，熔点为180 184°C;光学活性，[a],—62。 (c 0. 193， MeOH); UV (CH30H)入陋217nm; IR (KBr) v _3449 cnf1 (-OH) ， 1737cm—1 (-C二0)。
试验证明雪花草丁素在3. 14X10—8mol/L 3. 14X 1(Tmol/L时对小鼠肉 瘤细胞即S，细胞和小鼠肝癌细胞即H22细胞的生长均有明显的抑制作用， 其中雪花草丁素在3. 14X10—5mol/L时对小鼠肉瘤细胞即S自细胞的抑制作 用最高，抑制率为51. 54%; 3. 14X10—smol/L时对小鼠肝癌细胞即&2细胞的 抑制作用最高，抑制率为45.79%。可用作制备治疗癌症或肿瘤的药物。
图1为雪花草丁素的制备工艺流程示意图，


了雪花草丁素的
制备步骤为(1)乙醇回流提取；(2)浓缩稀乙醇提取液；(3)氯仿萃取; (4)浓縮稀氯仿萃取液；(5)柱层析分离；(6)纯化。
图2为紫外光谱图，说明了雪花草丁素结构中内酯环的存在；

图3为红外光谱图，说明了雪花草丁素结构中含氧官能团(-0H，-C二O)，
甲基及双键的存在；
图4为质谱图，说明了雪花草丁素的分子量及裂解方式；
图5为核磁共振'H丽R谱图，说明了雪花草丁素结构中氢(《{， -CH3， -CH(CH3)2等)的归属；
图6为核磁共振13C丽R谱图，说明了雪花草丁素结构中碳(-OO， -C=C-， -C-OH等)的归属；
图7为核磁共振DEPT谱图，说明了雪花草丁素结构中甲基，亚甲基， 次甲基，季碳的个数；
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于 说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简 单改进都属于本发明要求保护的范围。
旋光Rudolph-型旋光仪(美国鲁道夫公司)测定；核磁共振氢谱'HNMR， 核磁共振碳谱"C丽R和2D丽R由INOVA 400腿Z超导核磁共振波谱仪(美 国瓦里安公司)测定(四甲基硅醚TMS为内标)；电喷雾质谱ESIMS由5973 MSD质谱仪(安捷伦公司)测定；紫外光谱UV由HP8453紫外可见分光光度 计(惠普公司)测定；红外光谱IR由VECT0R22型傅立叶变换红外光谱仪 (德国BRUKER仪器公司，KBr压片)测定；熔点由XT-4双目显微熔点测定 仪(北京泰克仪器有限公司)测定；柱层析硅胶(200-300目)及薄层层析硅胶均为青岛海洋化工产；其它试剂均为分lf纯。
实施例1:冬凌草中松香垸型二萜化合物雪花草丁素的提取分离方法: 本发明实验药材于2006年10月采自贵州省龙里，由贵阳中医学院陈
德媛教授鉴定为冬凌草Zsoob/ 2Y/i^sc朋ce (Hemsl. ) Hara，植物标本存放
在贵阳中医学院中药研究所(标本凭证GY20061010)。 雪花草丁素的制备步骤依次如下
(1) 乙醇加热回流提取冬凌草叶经自然风干后粉碎，取粉碎的冬凌
草叶8.5Kg，用95%的乙醇加热回流提取3次，得稀乙醇提取液；
(2) 浓縮稀乙醇提取液将稀乙醇提取液减压浓縮得乙醇浸膏1100g， 在减压浓縮过程中回收乙醇；
(3) 萃取把乙醇浸膏溶于蒸馏水中，再用氯仿萃取3 4次，得稀 氯仿萃取液；
(4) 浓缩稀氯仿萃取液将稀氟仿萃取液减压浓縮得氯仿浸膏(53g)， 在减压浓縮过程中回收氯仿；
(5) 柱层析分离将氯仿浸膏与硅胶拌样，转入硅胶层析柱，硅胶粒
度200 300目，用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，石油醚与乙酸乙酯体
积比9: 1，将洗脱液进行薄层捡测，浓縮合并类似洗脱流分，静置，过滤
得雪花草丁素粗品；
(6) 单体化合物的纯化雪花草丁素粗品用丙酮反复重结晶得本发明 的雪花草丁素(1.5g)。
实施例2:松香烷型二萜化合物雪花草丁素结构鉴定
雪花草丁素的理化性状如下白色絮状固体，易溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇等有机试剂，熔点为180 184°C;光学活性，[a]u12—62° (c 0. 193， MeOH); UV (CH,OH)入隨217nm; IR (KBr) v _ 3449 cnf1 (-0H) ， 1737cm—1 (-C=0);电子轰击质谱给出分子离子峰m/z318[M]+， 300[M_H20]+， 256[M —H20—COJ +。泔与1:iCNMR数据见表1，同时，通过测定二维H-H相关谱(H-H COSY)、 H-C相关谱(HMQC)、 H-C远程相关谱(HMBC)以及旋转坐标系NOE 谱(ROESY)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结 构。化学结构式如下
表1雪花草丁素的氢谱和碳谱数据表(J (Hz)， CDC13)
位置
1 a
IP
2 a
4
5H (m，J，Hz)
1. 16(ddd， 13.6， 13.2， 4. 4) 1.71(dd, 5. 2， 1.2) 1.41(m)
2. 12 (m)
1. 16(ddd， 13. 6， 13.2， 4. 4) 1.45 (m)
5C(m)
24. 79 (t)
18. 08 (t)
41.26(t)
33. 45 (s)
105a1.93(dd， 1G. 0， 1.6)41.44(d)
6 a1.40 (m)19. 78(t)
631.83(m)
7a2.04(m)22. 15(t)
732, 18(ddd, 6.4， 5. 6， 2. 4)
8一81.04(s)
9一75. 16(s)
10一51.73(s)
lla1.58(dd，6.0，2. 0)26.65(t)
IIP1,67(dd， 5. 6， 1.6)
12 a1. 71(dd， 5. 2， 1. 2)28. 82(t)
12 P1.94 (m)
13一150. 64(s)
145. 27 5. 28 (br s)117. 72(d)
152.21 2. 26 (m)34.71(d)
161.03 (d，6. 8)20. 02 (q)
171.03 (d，6. 8)20. 70(q)
180. 91(s)21. 16(q)
190. 92(s)32. 07(q)
20-179. 67(s)
11注INOVA 400MHz; S化学位移单位ppm， ^-丽R和13CNMR分别以溶剂中残存的氯仿(SJ.26 ppm)和氘代氯仿为内标(Sc77.0 ppm);核磁共振信号的归属是在HMQC、 HMBC等二维谱基础上完成的。
实施例3:松香垸型二萜化合物雪花草丁素的体外抗肿瘤活性测试
肿瘤细胞抑制率《)=((对照组OD值-治疗组OD值)+对照组00值)+ 100%
测试原理MTT法活细胞的线粒体中存在着与NADP (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶n)相关的脱氢酶，可将黄色的噻唑蓝MTT (3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) _2，5-diphenyl tetrazolium bromide)还原为不溶性的蓝紫色甲臜(Formanzan)，死细胞中此酶消失，MTT不被还原。用DMSO (二甲亚砜)溶解甲臜后可用酶标仪在570nm处检测光密度(0D)，光密度值与活细胞数成正比。
所用细胞株为S180小鼠肿瘤细胞和H22小鼠肝癌细胞。实验方法MTT法按不同肿瘤细胞生成速率，将一定数量(1000-10000个)处于对数生长期的小鼠肿瘤细胞株接种于96孔培养板内，在37°C、5%C02条件下培养6-24小时，细胞贴壁后加入不同浓度的受试药物(即雪花草丁素先用DMSO溶解后，再用PBS (磷酸盐缓冲液)或者生理盐水稀释成不同浓度，因为DMSO对细胞是有毒性的，会产生假阳性)10ul/孔，加培养基至100ul/孔，每个浓度均为3-5个复孔，阴性对照(DMSO用PBS或者生理盐水稀释成不同浓度与受试药物中DMSO的浓度相对应)，阳性对照组(阿霉素)和空白组(只有培养基，无细胞)与受试药物组做相同的处理。肿瘤细胞在37。C、 5。/oC02条件下培养2-4天后，加PBS新鲜配制的5mg/mlMTT液20ul/孔；继续培养4小时后，弃上清液，加DMS0150ul/孔，震荡10min，使结晶物充分溶解，然后在570nm用酶标仪测定OD值。实验结果见表2.表2雪花草丁素对S，细胞和H22细胞增值的抑制作用
组别浓度(raol. l一1)对s^细胞的抑制率(。/。)对H22细胞的抑制率(y。)
雪花草丁素3. 14X10—440. 5733. 50
3. 14X10-551. 5445. 79
3. 14X10-636. 6238. 55
3, 14X10-733.3339. 50
3. 14X10—833. 7718. 69
总结雪花草丁素对S皿细胞和fe细胞均有抑制作用，可用于研制治疗癌症或肿瘤的药物。
1权利要求
1、从唇形科香茶菜属植物冬凌草(Isodon rubescence(Hemsl.)Hara)中分离到一种新的松香烷型二萜化合物，名称为雪花草丁素，化学名为8β，9α-二羟基-松香烷-13-烯-8，20-酯-20-酸，分子式为C20H30O3，其化学结构式如下
2、按照权利要求1所述的雪花草丁素的制备方法，其特征是制备步骤 依次如下(1) 乙醇加热回流提取阴干的冬凌草叶，经粉碎后用乙醇加热回流 提取，趁热过滤，得稀乙醇提取液；(2) 浓縮稀乙醇提取液将稀乙醇提取液减压浓縮得乙醇浸膏；(3) 萃取乙醇浸膏用蒸馏水溶解，再用氯仿萃取，保留氯仿萃取相， 得稀氯仿萃取液；(4) 浓縮稀氯仿萃取液将稀氯仿萃取液减压浓缩，得氯仿浸膏；(5) 柱层析分离将氯仿浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200 300目，用石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓縮合并类似洗脱流分，静置，过滤得雪花草丁素粗品。(6)单体化合物的纯化雪花草丁素粗品用丙酮反复重结晶得本发明 的雪花草丁素。
3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(1)中乙醇体积浓度为95°/。 85%。
4、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(5)中洗脱剂为石汕醚-乙酸乙酯，石汕醚与乙酸乙酯体积配比为1: 0或9: l或7: l或5: 1。
5、 按照权利要求1所述的雪花草丁素的用途，其特征是在制备抗肉瘤或抗肝癌药物中的应用。
6、 根据权利要求5所述的雪花草丁素在制备抗肉瘤和肝癌药物中的应 用，其特征是雪花草丁素在3. 14X 1(Tmol/L 3. 14X 10—4mol/L时对小鼠肉 瘤细胞即S，细胞和小鼠肝癌细胞即H22细胞的生长均有明显的抑制作用。
7、 根据权利要求5或6所述的雪花草丁素在制备抗肉瘤或抗肝癌药物 中的应用，其特征是雪花草丁素在3. 14X 10—5mol/L时对小鼠肉瘤细胞即S18。 细胞的抑制作用最高，抑制率为51.54%; 3. 14X10—5mol/L时对小鼠肝癌细 胞即H22细胞的抑制作用最高，抑制率为45. 79%。
全文摘要
本发明公开了一种新的松香烷型二萜化合物及其制备方法和用途，涉及医药技术领域，具体是从唇形科香茶菜属植物冬凌草(Isodonrubescence Hara)中，经一定的制备步骤分离到一种新的松香烷型二萜化合物，称为雪花草丁素，雪花草丁素经超导核磁共振波谱，质谱，傅立叶变换红外光谱等多种手段检测，确定其分子式为C₂₀H₃₀O₃，分子量为318，化学结构式为式(I)。本发明公开了雪花草丁素的制备方法，公开了雪花草丁素的理化性质，光学活性，并采用MTT法进行了体外活性筛选，结果表明对小鼠肉瘤细胞和小鼠肝癌细胞有明显的抑制作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可以作为研制治疗各种临床常见多发癌症的药物。
文档编号C07D493/00GK101633660SQ20091010273
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者李齐激, 潘炉台, 赵俊华, 娟 邹, 陈斗林 申请人:贵阳中医学院