纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用的制作方法

专利名称：纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白制备与应用，目的促进骨和软 骨种子细胞与支架材料复合的粘附，属于组织工程领域。
背景技术：
种子细胞在材料表面上的粘附过程，可分为四个连续发生并相互重叠的变化时相，即 细胞附着、细胞伸展、肌动蛋白细胞骨架的组织以及粘附斑的形成。细胞粘附涉及多种生 物分子，包括细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白以及细胞骨架蛋白的相互联系和相互作用。细 胞和材料的粘附是一个包括多因素的复杂过程，受多种因.素的影响。细胞、材料及其二者 所处的环境，都不同程度地影响细胞与材料的粘附。从材料方面来说，材料表面的理化特 性、几何形状及表面能以及材料的降解活性，都对细胞粘附起关键性作用。如何有目的的 进行组织工程材料的表面修饰以利于种子细胞粘附、增殖及分化是组织工程骨和软骨构建 中要解决的关键问题。
细胞表面的粘附受体，主要包括参与同种细胞间粘着结合的表面受体转粘蛋白，主 要以同嗜性方式与细胞一细胞识别相关；整合素以异嗜性方式和细胞一细胞及细胞一细胞 外基质结合有关，由a和p亚基以非共价方式组织成活性二聚体；此外还有选择素和免疫 球蛋白类。在骨细胞和培养的成骨细胞可表达整合素亚单位a2以及纤维连接蛋白受体ci3 ^、 a5e^t1ave3。软骨细胞表面可表达a 5 ^， a ! e卜"0^， a6
h， ave3等整合素受体，与纤连蛋白(Fibronectin， FN) ， II型、W型胶原，层粘连蛋 白的以及玻基结合素和骨桥蛋白相结合。整合素在介导锚定过程的同时，还介导跨膜信号 的传递，在粘附斑形成后， 一系列的酶会被激活，包括粘附斑激酶、胞外信号调节酶、有 丝分裂原激活蛋白激酶途径的某些因子等，启动了胞内外信号的传递，触发了细胞的增殖、 迁移、分化、分泌等功能活动，使种子细胞能获得良好的生物学特性。而作为asei配体 的FN属于多糖蛋白，具有粘附细胞的能力，对骨和软骨形成有着重要作用。FN作为ECM 中重要的一种整合素配体，参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连，维持细胞正常形态， 促进细胞分化。FN可与胶原结合调节细胞粘附，同时促进成骨细胞系细胞增殖分化并使 成熟成骨细胞存活时间延长。FN还可以与羟基灰石结合调节钙代谢及细胞粘附，对矿化 过程起调节作用。FN在成骨细胞分化时及以后持续表达。有实验证实，FN对磷酸钙陶瓷
4的表面修饰能明显提高大鼠成骨细胞的贴附率，有利于成骨细胞的生长及成骨表型。因而 在材料表面接上FN的特异性功能片段，将有助于通过RGD-ash相互作用，促进细胞的粘附。
FN与a 5 0 i的结合需要其9号III型重复序列(FNin)的PHSRN基序和9号III型重 复序列的RGD基序参与，这两个基序每一部分对应的连接力较低，但联合作用生物学效 应显著，可以提供稳定的粘附。除了增强细胞-支架的粘附，种子细胞在材料表面的密度决 定着下步分化及成熟的能力，因此需要把把FN片段与已知三维结构并且具有明确粘附功 能和成骨/软骨效应的分子上，而钙粘附蛋白-11 (Cadherin-ll，縮写Cad-11)为一种较佳 的选择。Cad-11属II型钙粘附蛋白，是一种钙离子依赖性介导细胞-细胞间粘附的单链跨膜 糖蛋白，与胚胎肢节形成、骨组织的形成等关系密切，因其最早在成骨细胞系中克隆而来， 所以又称之为成骨细胞型钙粘附蛋白(OB-cadherin)。目前己有学者进行了 Cad-11连接和 粘附特性的精确亚结构域结构的研究。人Cadherin-11是一种由796个氨基酸残基组成的蛋 白质(Okazaki M.， J. Biol. Chem. 1994， 269:12092-8.)，其分子量约为88.0KD。 Cadherin誦ll 在细胞中是以一种含22个氨基酸残基的信号肽和31个前肽的原肽形式合成的，信号肽和 前肽在转运和分泌过程中被切除。在成骨细胞持续表达Cadherin-ll，在胚胎期，Cadherin-ll 限制性的在间质细胞表达。Cadherin-ll最早从原肠胚期仅在中胚层表达，至体节分化后仅 在生骨节表达，影响着成骨细胞分化过程中的细胞排列、聚集及分离，显示Cadherin-ll 在骨骼形成的凝聚中发挥重要功能。2005年Matsusaki等在生长面的软骨细胞中发现了 Cadherin-ll的表达；2007年Agarwal等在小鼠的滑膜囊内发现了 Cadherin-ll的表达，表 明了 Cadherin-ll在软骨形成中也起着重要作用。X线衍射晶体分析法确定了 Cad-11胞外 结构域中Ed区编码蛋白决定粘附的相互作用，即II型的识别特异性主要是在Ed区，Ed 也是钙粘附蛋白单体的重要界面，介导了细胞粘附。
基于以上考虑，本发明将含有PHSRN和RGD基序的FNIII卜k)片段与Cadherin-ll的 胞外结构域Ed.2的融合蛋白进行生物支架材料的表面修饰，充分考虑粘附的"同嗜性" 和"异嗜性"，并兼顾种子细胞的粘附和成骨，建立组织工程生物材料的表面仿生微环境， 为组织工程骨和软骨的构建提供有力的支持。

发明内容
本发明为解决现有技术的不足提供一种促进骨和软骨种子细胞与支架材料复合的粘附
5分子的设计和应用方法，它可在组织工程化骨、软骨的构建中使用，为生物支架材料的表 面仿生微环境的建立提供了一种有效技术方法。 本发明的技术解决方案如下
本方法以含有PHSRN和RGD基序的纤连蛋白的FNIII7—K)片段与钙粘附蛋白-ll的胞 外结构域Ed.2的融合蛋白Cad-ll-Ed.2 /FNIII7-1Q，进行生物支架材料的表面仿生微环境 建立，促进种子细胞与组织工程生物支架材料的粘附，步骤如下
(1) 融合蛋白的构建将含有PHSRN和RGD基序的FNlIl7-u)片段与成骨细胞特异性钙 粘蛋白胞外结构域Ed.2制备融合蛋白Cad-ll-Ed.2 /FNIII7—10，采用的是EC,-2- (GlySer) n -FNIII7—1G， (GlySer)n是中间所加的一段柔性肽，n为l一3的整数。经生物信息学分析，该
融合蛋白中保留了 FNIII7-K)片段与成骨细胞特异性钙粘蛋白表位特征，钙离子结合区保持
稳定，各自的空间结构不受影响。融合蛋白具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列和SEQIDNO: 2的核苷酸序列。
(2) 融合蛋白的表达、纯化及活性分析Cad-ll-Ed-2/FNHl7—K)表达重组体pet22b-fn-cad 转化入改良大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)，通过氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素4 种抗生素筛选。经过IPTG诱导表达3h，取样行SDS-PAGE电泳分析，分析重组蛋白表达 率和融合蛋白表达形式后，用Ni+珠一步法亲和层析纯化。
(3) 融合蛋白在生物支架材料的表面仿生微环境建立将具有生物活性的融合蛋白 Cad-ll-Ed.2/FNni7,进行支架材料表面的附载，常用方式为涂层。本发明中所述涂层可 以采用浸涂和喷涂两种方式进行，对于多孔性骨和软骨材料可以采用浸涂方式，以免造成 喷涂的浪费，而对平面材料表面可以采用喷涂，防止因为浸涂而引起的挂膜。
(4) 种子细胞在生物支架材料表面的粘附将种子细胞种植在前述融合蛋白修饰的支架 材料上，进行静态或者动态培养，促进细胞在生物支架材料表面的粘附。 本发明的有益效果
本发明针对目前的组织工程骨和软骨研究中种子细胞与生物支架材料的粘附问题，进 行一种促进种子细胞与材料粘附的融合蛋白的制备，建立生物支架材料表面的仿生微环境。 通过制备含有PHSRN和RGD基序的纤连蛋白的FNIII7-H)片段与钙粘附蛋白-11的胞外结 构域Ed.2的融合蛋白Cad-ll-ECw /FNin7-10，经过融合蛋白的构建、表达、纯化及活性 分析后，进行生物支架材料的表面仿生微环境建立，将骨髓骨髓间充质干细胞作为种子细 胞进行与经过改建的生物材料表面复合，增强了种子细胞与材料的粘附率，在特定分化环
6境下，增强了种子细胞的成骨和成软骨定向分化能力。本发明所提供的融合蛋白对生物支 架材料进行必要的涂层和表面修饰，提高了表面生物活性，解决了生物支架材料亲水性差， 细胞吸附力弱，不利于细胞在材料上的粘附，进而影响细胞的增殖和分化难题。本发明适 用于组织工程骨和软骨产品的构建及附载细胞的整形材料制作，具有广阔的临床应用前景。


图1示出了单独的Cad-ll Ed.2的蛋白结构模式图； 图2示出了单独的FNlIl7-u)片段的蛋白结构模式图3示出了 Cad-ll-Ed.2 /FNIII7-k)融合蛋白结构模式图1为EC1; 2为EC2; 3为 (GlySer)3柔性肽；4为FN7; 5为FN8; 6为FN9; 7为FN1(); 8为PHSRN基序；9为RGD
基序；
图4示出了 Cad-ll-Ed.2/FNni7-u)融合蛋白载体构建模式图5示出了 Cad-ll-￡(:1.2化]^1117-10融合蛋白SDS-PAGE电泳结果图
1道为marker; 2-4道分别为PET22b、 PET22b/Cad-Ed.2、 PET22b/FN7.10、 PET22b/
Cad-ll-ECw /FNIII7—io未加IPTG诱导；6-9道分别为PET22b、 PET22b/Cad-EC"2、
PET22b/FN7.1()、 PET22b/ Cad-ll-EC^ /FNlH7_io加IPTG (终浓度0.4mM)诱导4h后。 图6示出了 Cad-ll-EC^ /FNIII7—10融合蛋白抗HIS免'疫印迹:l为PET22b/Cad-ECL2上
清；2为PET22b/Cad-EC"2沉淀;3为PET22b/FNwo上清;4为PET22b/FNwo沉淀;5为PET22b/
Cad-ll-EC卜2 /FNIII7-k)上清;6为PET22b/ Cad-ll-ECw /FNIII7—io沉淀.
图7示出了 Cad-ll-Ed.2/FNHl7—u)融合蛋白对骨髓间充质干细胞粘附的影响.
具体实施方式
以下结合实施例详细说明本发明的构建过程 实施例1、 FNni7-u)片段和Cad—11的Ed.2片段的克隆
1.人FNIII7-k)片段的克隆
用总RNA提取试剂盒，从人成纤维细胞HFL-I(上海细胞所)中提取总RNA，按照
RT-PCR试剂盒的方法，进行反转录反应。以获得的反转录产物为模版进行PCR获得FN
ni7-lcCDNA，所用引物Pl和P2用寡核苷酸合成仪合成。
Pl(5，-3，) acgcgtcgacccattgtctccacca(25bp ，下划线的碱基序列为Sail酶切位点)P2(5，-3，):aaggaaaaaag￡gg￡￡g￡taatgttcggtaattaatgga (39bp，下戈'J线的碱基序歹iJ为Notl酶切 位点)
PCR的方法为
① 50pl反应体系包括10XPCR反应缓冲液5pl，dNTP5Ml，Pl引物、P2引物各2pl， 模板cDNAlnl， pfu酶1.0^1，无DNA酶水34.5)xl。
② 扩增条件为94度5分钟一94度1分钟，59度1分钟，72度1.5分钟，35循环一 72度IO分钟。
通过凝胶电泳显示一大小为1.4kb的条带，利用PCR产物回收试剂盒回收，克隆至 pGEM-T载体的多克隆位点后，转化JM109感受态细菌，蓝白斑筛选到阳性克隆后，常规 方法抽提质粒，进行测序，证实获得了与天然FNIIl7-u)片段cDNA序列一致的克隆。 2.人Cadherin-ll的胞外结构域信号肽和Ed.2区的克隆
从正常骨折病人骨组织中分离正常人成骨细胞，经纯化和培养后，用总RNA提取试
剂盒从成骨细胞中提取总RNA，按照RT-PCR试剂盒的方法，进行反转录反应。以获得的
反转录产物为模版进行PCR获得Cadherin-ll胞外结构域信号肽和Ed.2区片段的cDNA，
所用引物P3和P4用寡核苷酸合成仪合成。
P3(5，-3，) acgcgtcgacatgaaggagaactactgt(28bp，下划线的碱基序列为Sail酶切位点) P4(5，-3，) aaggaaaaaagcggccgcctttggtgggttgtc (33bp，下划线的碱基序列为Notl酶切位
点)
PCR的方法为
① 50pl反应体系包括10XPCR反应缓冲液5pI，dNTP5^il，P3引物、P4引物各2^1， 模板cDNAlpl， pfo酶1.0^1，无DNA酶水34.5^1。
② 扩增条件为94度5分钟一94度1分钟，61度1分钟，72度1分钟，35循环一72
度10分钟。
通过凝胶电泳显示一大小为0.8kb的条带，利用PCR产物回收试剂盒回收。克隆至 pGEM-T载体的多克隆位点后，转化JM109感受态细菌，蓝白斑筛选到阳性克隆后，常规 方法抽提质粒，进行测序，证实获得了与天然Cadherin-ll的胞外结构域信号肽和ECw区 片段cDNA序列一致的克隆。
实施例2、本发明融合蛋白的表达
为了将FNlIl7,片段和Cad—11的Ed.2片段以融合蛋白形式从大肠杆菌分泌表达，如附 图4所示，选择利用分泌型载体pET-22b (+)作为载体(NovagenCorp. USA)。在该载体 的多克隆位点区域中，含有SalI酶切位点(179)和NotI酶切位点(166)，便于融合蛋白
8的克隆。为了使表达的两个片段的空间构象尽量与天然产物相近，以保持其最大的生物学 活性，在引物中设计引入亲水性和低电荷效应的氨基酸序列作为接头(GlySer) n，因为甘 氨酸结构简单，对融合蛋白的立体构象影响较小。利用重叠PCR方法，进行带有编码含 (GlySer)n柔性接头肽的Cad-ll-Ed.2/FNffl7—k)融合蛋白克隆，n可以是l-10的整数。当n-3
时，可合成如下寡聚核苷酸引物，所用引物P5、 P6、 P7和P8用寡核苷酸合成仪合成。
P5(5，-3，) acgcgjeg^j^aaggagaactactgt(28bp)(黑色下划线部分显示的是上游引物中引 入SalI酶切位点，黑体斜字显示是起始密码子)
P6(5，-3，):tggtggagacaatggagaaccagaaccagaacc ctttggtgggttgtc(48bp)(黑色下戈'J线部分显 示的是柔性接头肽段(GlySer)3序列) 一
P7f5，-3，):gacaacccaccaaagggttctggttctggttct ccattgtctccacca(48bp)(黑色下划线部分显示 的是柔性接头肽段(GlySer)3序列) 一
P8f5，-3，):aaggaaaaaagcggccgc似fltgttcggtaattaatgga (39bp)(黑色下划线部分显示的是下游 引物中引入NotI酶切位点，黑体斜字显示是终止密码子)
重叠延伸PCR.-
混合此4个长片段寡核苷酸后，将实施例1构建的FNIIIwo PCR产物和Cad-ll PCR 产物为模板，进行第一次PCR，把第一次PCR产物作为模板，使用两末端引物继续进行 第二次PCR.扩增条件为第一次PCR:①94度5分钟；②94度1分钟，68度1分钟， 72度2分钟，IO循环；第二次PCR:①94度5分钟；②94度1分钟，55度1分钟，72 度2分钟，25循环；③72度10分钟。用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的结果。
PCR扩增后，在cDNA的5' —端(Cad-ll片段)引入.一个Sall，同时在3'端(FNm7.10 片段)引入NotI位点。二者之间为柔性接头肽段(GlySer)3序列。通过凝胶电泳分析反应 物显出一预期大小(2.24kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用Sail 和NotI酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，与用SalI和Notl酶切酶切后的pET-22b (+)载体连 接(实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公 司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)，形成pET-22b (+) /Cad-ll-Ed.2/FNIIl7-H)。 DNA测序结果表明序列正确。将质粒pET-22b (+) / Cad-ll-Ed-2/FNlIl7-u)转化感受态菌 株Rosetta-gami(DE3)(德国Merck公司)，获得pET-22b ( + ) / Cad-ll-EQ-2 /FNlIIno/ Rosetta-gami(DE3)表达菌种。融合蛋白Cad-ll-Ed.2/FNin7-10的核苷酸序列如SEQIDNO: 2 所示，其具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列。SEQIDNO: 1中，129-131氨基酸(Gin-Ala-Vol) 是Cad-ll-Ed.2片段特异性结合区，决定着粘附特性；508-512氨基酸(PHSRN基序)和 625-627氨基酸(RGD基序)是FNm7-1()的重要的特异性结合区。实施例3、本发明融合蛋白的诱导表达和纯化 将鉴定正确的阳性克隆菌株pET-22b ( + ) / Cad-11-EC1-2 /FNIII7 — 10/ Rosetta-gami (DE3)，接种到含有35 u g/mL氯霉素、四环素12. 5 y g/raL和卡那霉素100 u g/mL的5 mL LB培养基中，在37 。C以180 r/min培养过夜，.次日以l : 1 OOO转接，振荡培养 至A600值达0. 6时加入IPTG至终浓度0. 5 mmol/L， 30度。C， 400rpm/min诱导表达3h。取适 量菌液在4t:条件下，5000 r/rain条件下离心5 min，菌体沉淀用l mL细菌裂解液(50 mmol/L Tris2HCl， pH=7.2， 50 mmol/L NaCl)重悬。重悬液用超声法破碎细胞，裂解菌体再在13 000 r/min条件下离心5min。分别取菌体裂解上清液(可溶蛋白部分)和沉淀重悬液(不可溶蛋白 部分)各10uL， SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。用灰度扫描分析，表达的融合蛋白约占 菌体总蛋白的43.7%。
包涵体的纯化如下(1)超声破碎获得包涵体:用裂解缓冲液(50mmol/LTris HC1, 1 mmol/LEDTA， 100 mmol/L NaCl)重悬收集的细菌沉淀，溶菌酶冰上作用2 h，冰浴超声 裂菌15min。将超声破碎后的菌体悬液以5 000r/min离心5min。重复上述步骤3、 4次， 至离心后的上清液清亮不粘稠为止。收集上清液，同时准备不同浓度的尿素洗漆沉淀。(2) 洗涤包涵体。将沉淀用4 mol/L尿素洗涤，4°C ， 12 000 r/min离心20min，沉淀用8 mol/L 尿素溶液重悬，4'C下静置溶解。用Ni2+-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀，分别使用 浓度为25和300mmol/L的咪唑进行洗脱。将纯化后的蛋白进行梯度复性，最后以pH7.0 的水透析，冻干后以10ml生理盐水复溶，用SDS-PAGE分析。经SDS-PAGE电泳分析， 融合蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在，细菌的裂解上清中(可溶性表达部分)仅存在 微量目的蛋白。灰度扫描分析蛋白纯度95%。
融合蛋白的Western blot分析蛋白纯化产物经SDS-PAGE电泳分离后，将融合蛋白 转移至NC膜上，5g/L脱脂奶粉室温封闭lh，加入抗His单抗，4'C孵育过夜。PBST洗 膜4次，每次10 min，再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG， 37'C温育1 h， PBST和PBS先 后洗膜4次后，ECL化学发光显色。如图6所示在分子量75000Da处有一条带，与融合蛋 白预期分子量相符，目的蛋白与抗His标签抗体有良好的反应性。
实施例4、本发明融合蛋白的活性鉴定
将纯化的融合蛋白稀释成不同的浓度，以0， 100, 200, 400， 800jag/ml的浓度，分别
10铺衬在96孔培养板中，4度过夜，1%BSA封闭2h，并以单纯的FNIII7-1()、单纯的Cad-l 1-Ed.2 蛋白及未处理作对照。按常规方法，分别进行骨髓间充质干细胞的培养，用含10MFBS的 培养液将细胞数1.0X104个/孔接种在前述的96孔培养板。置于37°C、 5%(302培养箱中 培养3h。用PBS缓冲液进行轻冲培养板，然后于高倍镜下计数培养板中的细胞数量。也 可通过MTT法，对支架种植细胞进行检测调整细胞密度至5.0Xl(^个/cm2 ，滴加至涂 层后培养板，分别在37'C、 5%C02培养箱孵育4h后作MTT检测。结果发现与对照相比， 如图7所示，融合蛋白铺衬可以明显提高前述细胞的粘附，其中100-200pg/ml作用最佳 (P<0.01))。当种子细胞为成骨细胞或者软骨细胞时，也获得相类似的结果。这表明大肠 杆菌表达的融合蛋白具有一定的活性。
实施例5、融合蛋白在生物支架材料的表面仿生微环境建立
将具有生物活性的纯化的融合蛋白Cad-ll-Ed.2/FNlIl7-H)进行支架材料表面的附载， 常用方式为涂层。本发明中所述涂层可以采用浸涂和喷涂两种方式进行，对于多孔性骨和 软骨材料可以采用浸涂方式，以免造成喷涂的浪费，而对平面材料表面可以采用喷涂，防 止因为浸涂而引起的挂膜。如在多孔双相钙磷陶瓷(BCP)材料采用浸涂方式先将支架 材料与10mg/ml的交联剂硫磺基-6 (3' -2-吡啶二硫-丙酰胺)-己酸酉旨(Sulfo-LC-SPDP)溶液 室温反应36h，再与200pg/ml的融合蛋白溶液反应36h，三蒸水漂洗5次，4。C保存。SEM 观察BCP表面形态，融合蛋白Cad-ll-Ed.2/FNlIl7-u)进行支架材料表面的附载，与单纯的 FNniwo、单纯的Cad-l卜Ed.2蛋白附载的材料及未处理的材料相比，支架材料的表面形态 均无明显不同，表明本发明的融合蛋白在支架材料的改性，不会改变材料的物理形态。这 对于经过设计和制备的具有确定的分化诱导性的支架材料而言，是十分重要的。不会对生 物支架材料的孔隙率、孔隙大小、泡孔均匀性及泡孔间连续性产生影响。同时由于在支架 表面植入特殊位点与细胞起特异性反应，对不同类型细胞起选择粘附的作用。其中，FNIII 7.Kj的PHSRN和RGD基序可以提供对骨髓间充质干细胞、成骨细胞或者软骨细胞的特异性 粘附；Cadherin-ll的Ed.2既可以提供细胞-细胞、细胞-材料间的粘附，也可提供使种子细 胞分别向成骨或者成软骨定向分化的分子机制。用本发明所提供的融合蛋白进行涂层的材 料，能使细胞有效地粘附和进行生命活动。通过在材料表面引入能促进细胞粘附、生长和 诱导分化作用的蛋白质，在材料表面构建仿生微环境。实施例6、种子细胞在生物支架材料表面的粘附
以BCP为例，将种子细胞种植在实施例5中提及的融合蛋白修饰的支架材料上，进行静 态或者动态培养，促进细胞在生物支架材料表面的粘附。将分别经融合蛋白、单纯的FNIII 7-10、单纯的Cad-ll-EQ.2蛋白及未处理的BCP材料作对照。在直径0.5cm、厚度0.3cm的圆 柱形BCP材料中，调整种子细胞密度至5.0Xl()S个/cm2，每个样品滴加细胞悬液0.1ml，在 37°C+5%C02培养箱孵育24h，加培养基0.5 ml轻轻冲洗材料，使未粘附细胞落在培养板 底部。取出材料，0.25%胰酶充分消化所粘附细胞，细胞计数板计数。结果发现在经过融 合蛋白涂层的材料表面粘附的细胞量显著性高于其它对照(PO.Ol)。
种植7d后，通过DNA含量分析样品中细胞量通过反复冻融法使细胞裂解，以去离 子水冲洗使细胞脱离材料，离心收集细胞成分，加入lmlTRIZOL试剂充分研磨，收集液体 至1.5mlEP管，室温静置5分钟，4°C 12 OOOXg离心lO分钟移除不溶性物质；加入氯仿O. 2ml，摇晃混匀，室温静置3分钟，4'C12 000Xg离心15分钟；上层水相物作总RNA提取， 余下中间相和有机相加无水乙醇0.3m成分混匀，室温静置3分钟，4°C 2 000Xg离心5分钟; 弃上清，沉淀用0.1mol/L柠檬酸钠溶液反复洗涤，4°C 2 000Xg离心5分钟;弃上清，加入 75。/。乙醇1.5ml， 4'C 2 000Xg离心5分钟，风干后加入8mmol/L氢氧化钠溶液(pH =8. 0) 500 yl溶解，4°C 12 000Xg离心10分钟，取上清液，紫外分光光度计测定260nm吸光度，计 算DNA含量。结果显示，在经过融合蛋白涂层的材料表面粘附的细胞量显著性高于其它对 照(PO.Ol)。显微镜下观察细胞生长情况，表征支架材料的细胞相容性。可发现细胞能 进入支架材料的孔隙中生长，且分泌出大量的细胞外基质，说明经本发明提供的融合蛋白 涂层的材料生物相容性较好，能为细胞提供一个模拟生物体内的生长环境以供其贴附、生 长、增殖和分化。
取融合蛋白修饰的BCP材料，以及前述的单纯的FNlIIwo、单纯的Cad-ll-Ed.2蛋白 及未处理的BCP材料作对照，置12孔培养板中。取第三代骨髓间充质干细胞，调整细胞密 度为5.0X105个/cm2，接种在材料上，用含成骨补充成分(含10'SM地塞米松、10'31^卜甘 油磷酸、50mg/L抗坏血酸)的培养基培养。分别在培养詹第7d、第14d、第21d各取出3个 各组材料，PBS冲洗3次，胰酶消化细胞，收集在Ep管中，加入lml裂解液(含25mMTris、 015%TritonX2100)，反复吹打，并置37'C过夜，镜下观察已无完整细胞，按ALP试剂盒
(南京建成公司)说明操作，520nm处测吸光度，计算各管中ALP活性。结果显示在经过 本发明所提供融合蛋白涂层的材料表面粘附的细胞，其ALP显著性高于其它对照(PO.Ol)。
12这提示种子细胞在本发明所提供融合蛋白涂层的材料表面，具有明确的成骨分化效应。
取融合蛋白修饰的BCP材料，以及前述的几种材料作为对照，置12孔培养板中。取第 三代骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为5.0Xl()S个/cm2，接种在材料上，添加无血清软骨 诱导液进行单层细胞诱导培养(含10ng/mlTGF-(51， O.lpM地塞米松，50pg/ml抗坏血酸， lxITS+l)。分别在培养后第7d、第14d、第21d各取出3个各组材料，PBS冲洗3次，胰酶消 化细胞，收集在Ep管中，提取细胞总RNA。采用一步法RT-PCR法检测可聚蛋白多糖
(aggrecan) mRNA表达，引物由北京赛百盛公司合成，序列为引物l:5，-cgc ttg cca ggg gga gtt gta ttc曙3 ，；弓I物2 : 5 ， -ggaggc cag ggt agc att ttg agc-3 ， ； 405bp) ， GAPDH为内参。反应 条件为:50。C， 30min; 15°C， 15min; 94°C, lmin;退火(aggrecan为55。C)， 45s; 72°C， lmim30 循环；72°C， 10min。产物用2.0 %琼脂糖凝胶电泳，图象分析软件进行条带灰度分析。结 果显示在经过本发明所提供融合蛋白涂层的材料表面粘附的细胞，其aggrecan表达量显著 性高于其它对照(PO.Ol)。这说明种子细胞在本发明所提供融合蛋白涂层的材料表面，呈 现明确的成软骨分化效应。序列表
〈110〉中国人民解放军第三军医大学
<120〉纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用
<160>2
<210>1
<211〉641
<212>PRT <213〉人属人
〈400>1
Met Lys Glu
1
Leu Cys His
Pro Ser Phe 35
Gin Arg Ser 50
Glu Tyr Thr 65
lie Asp Ser
Ala Gly Thr
Thr Lys Thr 115
Gin Ala Val
130 Phe lie Val 145
His Glu Thr
Ser Val lie
Asn Ser Ala 195
Ser Val Glu
210 Asp Arg Glu
(Homo sapiens)
Asn Tyr Cys Leu 5
Ser His Ala Phe 20
His Gly His His
Lys Arg Gly Trp 55
Gly Pro Asp Pro 70
Gly Asp Gly Asn 85
lie Phe Val lie 100
Leu Asp Arg Glu
Asp Arg Asp Thr 135
Lys Val Gin Asp 150
Tyr His Ala Asn 165
Gin Val Thr Ala 180
Lys Leu Val Tyr
Ala Gin Thr Gly 215
Ala Lys Glu Glu
Gin Ala Ala Leu Val Cys Leu Gly Met
10 15 Ala Pro Glu Arg Arg Gly His Leu Arg
25 30 Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gin Val Leu 40 45 Val Trp Asn Gin Phe Phe Val lie Glu 60
Val Leu Val Gly Arg Le'u His Ser Asp
75 80 lie Lys Tyr lie Leu Ser Gly Glu Gly
90 95 Asp Asp Lys Ser Gly Asn lie His Ala
105 110 Glu Arg Ala Gin Tyr Thr Leu Met Ala 120 125 Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu 140
lie Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Leu 155 160 Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly Thr
170 175 Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly
185 190 Ser lie Leu Glu Gly Gin Pro Tyr Phe 200 205 lie lie Arg Thr Ala Leu Pro Asn Met 220
Tyr His Val Val lie Gin Ala Lys Asp225 230 235
Met Gly Gly His Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr
245 250 Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys
260 265 Ser Pro Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu
275 280 Thr Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser
290 295 Thr Gly Tyr Arg lie Thr Thr Thr Pro Thr Asn 305 310 315
Ser Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gin Ser
325 330 Asn Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser
340 345 Asp Asp Lys Glu Ser Val Pro lie Ser Asp Thr
355 360 Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie
370 375 Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp 385 390 395
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp
405 410 lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr
420 425 Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr
435 440 Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu
450 455 lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 465 470 475
Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg lie
485 490 His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val
500 505 Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr
515 520 lie Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro
530 535 Gin Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 545 550 555
Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Asp Ala
565 570 Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly
240
Thr Lys Val Thr lie 255
Gly Ser Gly Ser Gly 270
Glu Ala Asn Pro Asp 285
Thr Thr Pro Asp lie 300
Gly Gin Gin Gly Asn 320
Ser Cys Thr Phe Asp 335
Val Tyr Thr Val Lys 350
lie lie Pro Ala Val 365
Gly Pro Asp Thr Met 380
Leu Thr Asn Phe Leu 400
Val Ala Glu Leu Ser 415
Asn Leu Leu Pro Gly 430
Glu Gin His Glu Ser 445
Asp Ser Pro Thr Gly 460
Thr Val His Trp lie 480
Arg Hfs His Pro Glu 495
Pro His Ser Arg Asn 510
Glu Tyr VaJ Val Ser 525
Leu Leu lie Gly Gin 540
Glu Val Val Ala Ala 560
Pro Ala Val Thr Val 575
Gly Asn Ser Pro Val
15580 585 590
Gin Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly
595 600 605
Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly
610 615 620
Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 625 630 635 640
Thr 641
<210>2
<211>1954
<212>DNAT
<213>人属人(Homo sapiens) <400>2
ACGCGTCGAC ATGAAGGAGA ACTACTGTTT ATACCACAGC CAGGCGTTTG CTCTGGAGCG ACACCATGAG AAGGGCAAGG AGGGGCAGGT GAACCAATTC TTTGTGATAG AAGAGTACAC TCATTCTGAC ATTGACTCCG GTGATGGGAA GGGAACCATT TTTGTGATTG ATGACAAATC CCGAGAGGAG AGAGCCCAGT ACACACTGAT ACCACTGGAG CCACCTTCAG AATTCATTGT AGAGTTTCTG CATGAAATCT ATCATGCCAA AGTTATCCAA GTGACAGCCT CTGATGCAGA AGTGTATAGC ATCCTTGAAG GACAACCCTA CAGGACAGCC CTTCCCAATA TGGACAGAGA GGCCAAGGAC ATGGGTGGAC ACATGGGTGG TCTGACTGAT GTCAACGACA ACCCACCAAA ACCAACAAAC TTGCATCTGG AGGCAAACCC GAGGAGCACC ACCCCAGACA TTACTGGTTA GCAGGGAAAT TCTTTGGAAG AAGTGGTCCA CCTGAGTCCC GGCCTGGAGT ACAATGTCAG TGTCCCTATC TCTGATACCA TCATCCCAGC CAACATTGGT CCAGACACCA TGCGTGTCAC CAACTTCCTG GTGCGTTACT CACCTGTGAA TTCTCCTTCA GACAATGCAG TGGTCTTAAC GAGTGTCTCC AGTGTCTACG AACAACATGA AGGTCTTGAT TCCCCAACTG GCATTGACTT GCACTGGATT GCTCCTCGAG CCACCATCAC CTTCAGTGGG AGACCTCGAG AAGATCGGGT
ACAAGCTGCCCTGGTGTGCCTGAGCATGCT60
ACGAAGCCACCTGCATCCCTCTTTCCATGG120
GCTGCAACGCTCCAAGAGAGGCTGGGTCTG180
CGGGCCTGACCCTGTGCTGGTGGGCAGGCT240
CATTAAATACATTCTCTCAGGTGAAGGAGC300
AGGGAACATTCATGCCACCAAGACATTGGA360
GGCTCAGGCGGTGGACAGGGACACCAACAG420
taaggtccaggacatt:aatgacaaccctcc■
TGTGCCTGAGAGGTCCAATGTGGGAACATC540
TGATCCCACCTATGGAAATAGTGCCAAGTT600
TTTCTCGGTGGAGGCCCAAACAGGTATCAT660
AGCCAAGGAGGAGTACCACGTGGTGATCCA720
ACTCTCAGGGACAACCAAAGTGACGATCAC780
GGGTTCTGGTTCTGGTTCTCCATTGTCTCC840
TGACACTGGAGTGCTCACAGTCTCCTGGGA900
TAGAATTACCACAACCCCTACAAACGGCCA960
TGCTGATCAGAGCTCCTGCACTTTTGATAA1020
TGTTTACACTGTCAAGGATGACAAGGMAG1080
TGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCAC1140
CTGGGCTCCACCCCCATCCATTGATTTAAC1200
AAATGAGGAAGATGTTGCAGAGTTGTCAAT1260
AAATCTCCTGCCTGGT-ACAGAATATGTAGT1320
GAGCACACCTCTTAGAGGAAGACAGAAAAC1380
TTCTGATATTACTGCCAACTCTTTTACTGT1440
TGGCTACAGGATCCGCCATCATCCCGAGCA1500
GCCCCACTCTCGGAATTCCATCACCCTCAC1560
16CAACCTCACT CCAGGCACAG AGTATGTGGT CAGCATCGTT GCTCTTAATG GCAGAGAGGA 1620
AAGTCCCTTA TTGATTGGCC AACAATCAAC AGTTTCTGAT GTTCCGAGGG ACCTGGAAGT 1680
TGTTGCTGCG ACCCCCACCA GCCTACTGAT CAGCTGGGAT GCTCCTGCTG TCACAGTGAG 1720
ATATTACAGG ATCACTTACG GAGAAACAGG AGGAAATAGC CCTGTCCAGG AGTTCACTGT 1800
GCCTGGGAGC AAGTCTACAG CTACCATCAG CGGCCTTAAA CCTGGAGTTG ATTATACCAT 1860
CACTGTGTAT GCTGTCACTG GCCGTGGAGA CAGCCCCGCA AGCAGCAAGC CAATTTCCAT 1920
TAATTACCGA ACATAAGCGG CCGCAAGGAA AAAA 195权利要求
1、一种纤连蛋白与钙粘附蛋白-11融合蛋白，所述融合蛋白采用含有PHSRN和RGD基序的FNIII7-10片段与钙粘附蛋白-11制备融合蛋白，进行生物支架材料的表面修饰，建立骨和软骨组织工程生物材料的表面仿生微环境；所述融合蛋白命名为Cad-11-EC1-2/FNIII7-10，其具有SEQ ID NO1的氨基酸序列和SEQ ID NO2的核苷酸序列。
2、 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的Cad-ll-Ed.2/FN1117—u)采用将 含有PHSRN和RGD基序的FNIII7—1()片段与成骨细胞特异性钙粘蛋白胞外结构域Ed.2制 备融合蛋白，采用的是Ed.2-(GlySer)n-FNIIl7-K)， (GlySer)n是中间所加的一段柔性肽， n为l一10的整数;SEQIDNO: 1中，129-131氨基酸(Gln-Ala-Val)是Cad-ll-Ed.2片段 特异性结合区；508-512氨基酸(PHSRN基序)和625-627氨基酸(RGD基序)是FNIII7-U)的特异性结合区。
3、 根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述n为3。
4、 权利要求1或2所述纤连蛋白与钙粘附蛋白-11融合蛋白的制备方法，步骤如下-(1)融合蛋白的构建以含有PHSRN和RGD基序的FNHl7—u)片段与成骨细胞特异性钙粘蛋白胞外结构域EQ.2制备融合蛋白Cad-ll-Ed.2/FNni7—K)，采用的是Ed.2-(GlySer)n-FNniwo，(GlySer)n是中间所加的一段柔性肽,n为1—10的整数，融合蛋白具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列和SEQID NO: 2的核苷酸序列；(2)融合蛋白的表达、纯化及活性分析将Cad-ll-Ed.2 /FNIII7-K)表达重组体pet22b-fn-cad转化入改良大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)，通过氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素4种抗生素筛选，经过IPTG诱导表达3h，取样行SDS-PAGE电泳分析，分析重组蛋白表达率和融合蛋白表达形式后，用Ni+珠一步法亲和层析纯化。
5、 权利要求1或2所述融合蛋白的应用，其特征在于，将所述融合蛋白Cad-ll-ECw/FN 1117-1()进行生物支架材料的表面仿生微环境建立，方法是以涂层的方式进行支架材料表面 的附载；将种子细胞种植在前述融合蛋白修饰的生物支架材料上，进行静态或者动态培养， 促进细胞在生物支架材料表面的粘附。
6、 根据权利要求5所述融合蛋白的应用，其特征在于，所述的生物支架材料为人工合 成可降解聚合物聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚酯尿垸、聚酸酐亚胺共聚物、聚羟丁酯 及其共聚物或聚羟基丁酸已酯，或为天然高分子聚合物胶原、纤维蛋白、壳聚糖、藻酸盐 或天然珊瑚，或为由上述多种材料构成的复合材料。
7、根据权利要求5所述融合蛋白的应用，其特征在于，所述种子细胞，对于组织工程骨是骨髓间充质干细胞或成骨细胞；对于组织工程软骨是骨髓间充质干细胞或软骨细胞。
8、 根据权利要求5所述融合蛋白的应用，其特征在于，所述涂层采用浸涂或喷涂两种方式进行，对于多孔性骨和软骨材料采用浸涂方式，对平面材料表面可以采用喷涂。
9、 根据权利要求5所述融合蛋白的应用，其特征在于生物支架材料的表面修饰，是指粘附蛋白在材料表面的种植或交联。
全文摘要
本发明涉及一种纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用，目的是提供一种可以促进骨和软骨种子细胞与支架材料的粘附的融合蛋白，属于组织工程领域。所述融合蛋白采用将含有PHSRN和RGD基序的FNIII_7-10片段与钙粘附蛋白-11胞外结构域EC_1-2制备融合蛋白，进行生物支架材料的表面修饰，充分考虑种子细胞的粘附的“同嗜性”和“异嗜性”，并兼顾种子细胞的粘附和成骨或成软骨分化，建立骨和软骨组织工程生物材料的表面仿生微环境。本发明适用于组织工程骨和软骨产品的构建及附载细胞的整形材料制作。
文档编号C07K19/00GK101463090SQ200910103100
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月20日 优先权日2009年1月20日
发明者强 向, 跃 周, 应大君, 瑗 张, 波 杨, 董世武 申请人:中国人民解放军第三军医大学