专利名称：突出喹诺酮药品母核人工免疫抗原的制备方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术领域，特别涉及制备偶联小分子物质的人工抗原的方法。
背景技术：
抗原是能够刺激动物机体产生免疫应答的外源性物质。小分子物质(兽药、真菌 毒素等)由于分子量较小，免疫原性不足，需要把小分子化学偶联到蛋白质载体上， 合成人工抗原增加小分子物质的免疫原性，才能免疫动物产生针对小分子物质的抗体。
喹诺酮是一类强效、广谱的合成抗菌素，价格便宜、疗效确切，在畜牧、水产业 中超量使用的情况十分严重，由于其在动物体内降解缓慢，目前在肉类、水产品、乳 品中超量残留现象严重。如果获得针对这类药物共同结构的抗体，可以开发出能够检 测喹诺酮类药品残留总量的免疫检测试剂。
发明内容
本发明的目的是提出一种制备突出喹诺酮药品母核人工免疫抗原的新方法。
本发明以环丙沙星(图2)作为喹诺酮药品的代表，该药品哌嗪环上有一个活泼 的亚氨基，通过戊二醛连接试剂在碱性环境下可以连接到载体蛋白上。醛基在碱性条 件下与载体蛋白氨基形成Schieve键发生连接(图3a),同样道理，环丙沙星哌嗪环上 的亚氨基在碱性也可以连接到已经连接到蛋白的戊二醛上，合成突出喹诺酮母核的人 工免疫抗原(图3b)。
氨基是载体蛋白上最常用的与小分子物质偶联的基团，通常氨基数量多能提高载 体蛋白与小分子物质的连接效率。但是，当使用双功能试剂进行偶联反应时，载体蛋 白上过多的氨基会导致一系列的负面效果(图4 ):①戊二醛也能够分别与两个载体蛋 白分子上的氨基连接，导致蛋白质之间聚集，发生沉淀；②因副反应产生干扰性抗原 表位，影响特异性抗体的获得；③导致小分子物质/载体蛋白偶联比过高，亲水性下降, 使人工抗原免疫原性降低。
戊二醛是很活泼的连接剂，很容易与氨基发生缩合。每个天然牛血清白蛋白分子 含有99个氨基，如果不适当把一些氨基封闭，将很容易在戊二醋作用下造成蛋白聚集, 并且会造成每个蛋白质分子结合太多的环丙沙星，过高的药物/蛋白偶联比会导致人工 免疫抗原溶解性下降，不利于产生抗体(图4)。为了解决这个问题，本发明利用还原糖 上的醛基与氨基的反应，把蛋白上的部分氨基封闭，葡萄糖、乳糖是还原糖，都有一 个醛基，在偏碱性条件葡萄糖和乳糖会与牛血清白蛋白上的氨基縮合形成Schieff键， 把蛋白上的氨基封闭；既可以控制连接小分子的偶联比，又可以增加载体蛋白的亲水 性和整体免疫抗原的免疫原性。载体蛋白上的氨基被部分封闭，剩余的游离氨基位点 呈现随机组合，连接环丙沙星所制备的人工免疫抗原不仅偶联比适中、亲水性好、不 聚集，而且具有很丰富的表位结构，更加有利于激发免疫应答产生所需的抗体(图5)。 使用两种还原糖对蛋白进行修饰有以下几种好处①将天然BSA上的部分氨基封闭，减少戊二醛连接位点，降低BSA发生聚集的可能，并有效控制偶联比；②糖基是亲水 基团，蛋白上修饰了一定比例的糖基之后，有利于增加亲水性且不易变性，在修饰了
相对数量的环丙沙星之后，仍然具有良好的溶解性；③通过葡萄糖和乳糖随机修饰到
蛋白的表面，是蛋白的表面结构大大丰富，比天然蛋白的免疫原性大幅增强，易于产
生强免疫应答；
戊二醛连接剂是一种柔性手臂，在一定条件下是可以弯曲的。而环丙沙星结构上 有羧基，能够与蛋白质上的氨基形成氣键，导致环丙沙星弯曲结合到蛋白上，使免疫 抗原上的关键表位被封闭，不能得到所需的抗体。载体蛋白上的氨基被部分封闭，环 丙沙星结构上的羧基就不能够与蛋白质上的氨基形成氢键，确保喹诺酮母核结构向空 间伸展。
葡萄糖和乳糖分别是单糖和二糖，都是含有醛基的还原糖，在碱性条件下醛基会 与载体蛋白上的氨基结合形成Schieve键。被修饰后载体蛋白的每个氨基都有三种随 机存在状态①没有被修饰；②被单糖修饰；③被二糖修饰。如果天然载体蛋白有n 个氨基，被修饰后的载体蛋白就会有3n种被修饰状态，抗原表位被极大地丰富。部分 氨基被掩蔽之后，使用双功能试剂与小分子物质进行偶联反应时，载体蛋白之间发生 聚集的可能性降低，副反应减少，小分子物质/载体蛋白的偶联比能够控制在适当的范 围。
本发明是通过以下技术的技术方案实现的。
① 葡萄糖和乳糖等量，再按两者总量与载体蛋白以(20-25 ): 1的摩尔比混合， 调节pH到9.0-9.5,在40-42。C摇床反应2-4小时，还原糖全部通过形成Schieve键结 合到氨基上，完成对载体蛋白的修饰。
② 把载体蛋白、戊二醛、环丙沙星以l: (20-25): ( 90-120 )的摩尔比例混合，调 节pH到9.0-9.5, 40-42'C反应6-8小时，使环丙沙星通过双功能试剂连接到载体蛋白 上，使用0.01MPBS (pH7.2-7.4)充分透析，完成环丙沙星人工抗原制备。
本发明还涉及用以上抗原制备检测氟喹诺酮抗生素总量的单克隆抗体。 本发明使用还原糖对载体基团的氨基进行修饰掩蔽，减少了在人工抗原偶联小分 子物质的化学反应过程中产生的副反应，而使用还原糖与氨基反应修饰载体蛋白质， 使结合小分子的人工抗原成为免疫原性最强的糖蛋白，从而使人工抗原的免疫原性得 到增强，增加免疫过程中抗原提呈的效率，有利于产生高效价的特异性抗体。
载体蛋白糖基化修饰后，游离氨基位点呈现随机组合，所制备的人工免疫抗原具 有偶联比适中、亲水性好、不易聚集、表位结构丰富等优点。
附图1为突出喹诺酮药品母核结构的人工免疫抗原示意图。 附图2为环丙沙星的分子结构示意图，其中哌嗪环上亚氨基作为连接位点。 附图3a为戊二醛与蛋白的氨基结合的示意图。 附图3b为戊二醛与环丙沙星的亚氨基结合的示意图。附图4为戊二醛导致蛋白质聚集的示意图。
附图5为用还原糖修饰的蛋白载体通过戊二醛与环丙沙星连接的示意图。
具体实施例方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。 实施例。
① 葡萄糖和乳糖等量，再按两者总量与牛血清白蛋白以20: l的摩尔比混合，用 O.IM碳酸钠溶液调节pH到9.5，在42。C摇床反应2小时，还原糖全部通过形成Schieve 键结合到氨基上，完成对载体蛋白的修饰。
② 把修饰化牛血清白蛋白、戊二醛、环丙沙星以l: 25:卯的比例混合，用0.1M 碳酸钠溶液调节pH到9.5,在4'C反应6小时，使环丙沙星通过双功能试剂连接到载 体蛋白上。然后使用0.01MPBS(pH7.2)溶液在4。C透析3天，期间换液10次。完成环 丙沙星人工抗原的制备，环丙沙星/载体蛋白偶联比为9.3: 1。
权利要求
1、突出喹诺酮药品母核人工免疫抗原的制备方法，其特征是①葡萄糖和乳糖等量，再按两者总量与载体蛋白以(20-25)∶1的摩尔比混合，调节pH到9.0-9.5，在40-42℃摇床反应2-4小时，还原糖全部通过形成Schieve键结合到氨基上，完成对载体蛋白的修饰。②把载体蛋白、戊二醛、环丙沙星以1∶(20-25)∶(90-120)的摩尔比例混合，调节pH到9.0-9.5，40-42℃反应6-8小时，使环丙沙星通过双功能试剂连接到载体蛋白上，使用pH为7.2-7.4的0.01M PBS充分透析，制备出环丙沙星人工抗原。
2、 用权利要求l所述的抗原制备检测氟喹诺酮抗生素总量的单克隆抗体。
全文摘要
一种使用还原糖修饰载体蛋白制备突出喹诺酮药品母核人工免疫抗原的方法，①葡萄糖和乳糖等量，再按两者总量与载体蛋白以(20-25)∶1摩尔比混合，调pH到9.0-9.5，40-42℃摇床反应2-4小时，修饰载体蛋白；②把载体蛋白、戊二醛、环丙沙星以1∶(20-25)∶(90-120)摩尔比混合，调pH到9.0-9.5，40-42℃反应6-8小时，使用pH为7.2-7.4的0.01M PBS充分透析，制备出环丙沙星人工抗原，本发明使用还原糖对载体基团的氨基进行修饰掩蔽，减少了在人工抗原偶联小分子物质的化学反应过程中产生的副反应，而使用还原糖与氨基反应修饰载体蛋白质，使结合小分子的人工抗原成为免疫原性最强的糖蛋白，从而使人工抗原的免疫原性得到增强，增加免疫过程中抗原提呈的效率，有利于产生高效价的特异性抗体。
文档编号C07K14/765GK101654480SQ20091011582
公开日2010年2月24日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者何庆华, 李燕萍, 杨 许, 郭杰标, 黄志兵 申请人:南昌大学