具有形态形成活性和促进生长活性的新化学物质的制作方法

专利名称：：具有形态形成活性和促进生长活性的新化学物质的制作方法
技术领域：
：本发明涉及由微生物、其书f生物制得的新的类似维生素的活性物质，并涉及其制备方法及其应用。迄今为止已知，使用传统合成培养基在室内培养大型绿藻，如石莼科(Ulvaceae)和礁膜科(Monostromataceae)绿藻的过程中，随着纯化程度的提高，藻类可降解为纤维性或单胞状态(L.Provasoli,Ulva.Biol.Bull.,1958,114，375;M.Tatewaki,L.Provasoli和I丄Pintner,J.Phycol.，1983,19，409)。还已知，向已失去形态的藻类中加入新鲜海水、土壤提取物、红藻提取物、褐藻提取物或一些种类的海洋微生物培养液可使其恢复叶状体或促进生长(M.Tatewaki,L.Provasoli和I丄Printner,J.Phycol.,1983,19,409)。{旦是，室内无菌培养的大型绿藻，例如石i科和礁膜一牛绿藻一直4艮难进行长期的生理和生态学研究、培养或保存。
发明内容如果仅使用由已知成分组成的培养基就可长期无菌培养海洋大型绿藻，则此项技术可作为实际的培养技术应用于，例如，制备、维持和处理被培养物种(如食用礁膜科)的种子和幼苗，或用于保存绿藻的种子，此外还可对目标藻类进行生理和生态学研究。基于这种观点，本发明者发现了诱导海洋大型绿藻重建形态和促进生长的微生物(JP-A-2003-189845)。但是，由这种孩￡生物制得的活性成分和类似维生素的活性物质还属未知。本发明的目的是提供上述的类似维生素的新活性物质及其衍生物。如上所述，本发明者找到了新的活性成分。结果，本发明者从YM-2-23林的培养液中分离出了活性极强的活性物质(最初收录在高级工业科学和技术国家研究所(NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology(TsukubaCentral6,1-1-1Higashi，Tsukaba，Ibaraki,曰本))的InternationalPatentOrganismDepositary上，日期为2001年8月加日，登记号FERMBP-8417(于2003年6月25日接受按照布达佩斯条约将其由最初收录处转移收录的请求))，re/iac访flcw/"加属YM-1-69抹(最初收录在NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology(TsukubaCentral6，1-1-1Higashi，Tsukuba,Ibaraki,日本)的InternationalPatentOrganismDepositary上，日期为2001年8月加日，登记号FERMBP-8418(于2003年6月25日接受按照布达佩斯条约将其由最初收录处转移收录的请求))，和与上述菌林类似的菌抹，并发现这些化合物为新物质.这样就完成了本发明.至今为止，已报道类胡萝卜素类似物，如番茄紅素和玉米黄质是由YM-2-23林和/或黄杆菌属、Zo6e战a属或与YM-1-69林类似的re"flc访""toiw属制得的物质.但是，此前并没有成功的实施例,可分离此种可促进大型藻类生长或控制其形态的化合物.因此，这是世界上对其进行的第一次报导.也就是，本发明包括下列发明.l.一种新化学物质l,其具有下列物理化学性质(i)物质颜色无色(ii)分子量457(iii)质谦分析FABMS:m/z45M-Hr(图1)(iv)核磁共振信号1)'H-NMR(D2O-20mMNazHP04(pH9)，750MHz):(困2)5ppm0.818(3H，s)，0.837(3H，s)，0朋2(3H，s)，0.960(1H，m)，1.058(1H，m),1.167(1H，m),1326(3H，s)，1.37(1H，m)，1.38(1H，m)，1.40(1H，m)，158(1H，m)，1.61(2H，m),1.52(1H,brd,J-13Hz)，1.76(1H，brd，J"他)，2.024(1H，m)，2.181(1H，dd,J"，l他)，2.291(1H，dd，J-14,16.5Hz),7.698UH，d，J=7.5Hz)，7.845(1H，djJ頃7,5Hz)2)"C-N纖(D2O-20mMNa2HP04(pH9)，125MHz):(图3)5ppra15.236(q),19.037(t)，20.287(t)，20.955(q)，21.835(q)，25,987"),33.381(s)，33.636(q)，37308(s),39.5卯")，41.199(t)，42.346(t)，52.769(d),56.381(d),79.096(s)114.965(s),124.399(d)，139.004(s)，141.232(d)，150.282(s),152.6566(s)，172.081(s)，173.538(s)，174.661(s)2.—种新化学物质2，其具有下列物理化学性质(i)物质颜色:无色(ii)核磁共振信号'H画NMR(D2O-20mMNa2HP04(pH9),500MHz):(图4)5ppm0.815(3H，s),0.834(3H，s)，0.877(3H，s)，0.949(1H，m)，1.048(1H，m)，1.163(1H，ra)，1297(3H，s)，1.35"1.40(3H，m)，1.52-1.63(4H，m)，1.753(1H,brd,J=14Hz)，2.012(1H,迈)，2.158(1H，m),2.299(1H,m),7.646(1H，d，J-8.0Hz)，7.769(1H,d，J-8.0Hz)3.—种制备新化学物质1或2的方法，其中在培养基中培养可制备根据笫1项的新化学物质1的微生物，或在培养基中培养可制备根据笫2项的新化学物质2的微生物，新化学物质1或2在培养中产生并系积，并回收产生和累积的新化学物质1或2.4.根据第3项的制备方法，其中微生物为YM-2-23林(FERMBP-8417)，7fe加"'^cw,"w属YM-1-69株(FERMBP-8418)，或其类似的菌抹.5.海藻培养基，其包括作为活性成分的根据第1项的新化学物质1，或作为活性成分的根据第2项的新化学物质2.6.—种新化学物质1的单甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物，其通过用三甲基甲硅烷基重氮甲烷处理根据第1项的新化学物质1而7.—种化合物或其衍生物，其通过用硼氢化钠处理根据笫6项的三曱基化衍生物而获得.下面对本发明进行详细描述.可使用微生物制备根据本发明的新化学物质1或2.用于制备根据本发明的新化学物质的微生物并不受特別限制，只要其能够制备这种化学物质即可.其例子包括，属于噬纤维菌属-黄杆菌属-类杆菌(cytophaga-Flavoba-Cterimn-Bacteriodes)复合体的菌林，例如黄杆茵属、Zo6e肌a，或re/wc访flc"/tfm及其变体.其具体例子为YM-2-23林(FERMBP-8417)，7Wiac幼acw/"附属YM-1-69林(FERMBP-8418),及其变体，除了YM-1-69或YM-2-23抹，还可使用其类似的菌株."YM-1-69的类似菌抹"的例子包括这样的菌抹具有形成叶状体或促进海洋大型绿藻生长的活性，且在16SrRNA基因中具有V3区，而代表该16SrRNA基因的核苷酸序列中85%或更大部分，且优选95。/。或更大部分同源于SEQIDNO:l中所示的核苷酸序列，或在gyrB基因中具有V3区，而代表该gyrB基因的核普酸序列中72%或更大部分，且优选95%或更大部分同源于SEQIDNO:3中所示的核苷酸序列."YM-2-23的类似菌抹"的例子包括这样的菌林其显示有形成叶状体或促进海洋大型绿藻生长的活性，且在16SrRNA基因中具有V3区，而代表该16SrRNA基因的核苷酸序列中85%或更大部分，且优选95%或更大部分同源于SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列，或在gyrB基因中具有V3区，而代表该gyrB基因的核苷酸序列中72%或更大部分，优选80%或更大部分，更优选95%或更大部分同源于SEQIDNO:4中所示的核苷酸序列."YM-1-69的类似菌林"和"YM-2-23的类似菌抹"的例子包括YM2-10(MBIC04671)、YM2曙11(MBIC04672)、YM2-12(細IC04673)、YM2-13(MBIC04674)、YM1-66(MBIC04663)、YM2-24(MBIC04684)、YM1-51(MBIC04662)、ZWe///a(ATCC14397)、YMl-ll(MBIC04693)、T-588(MBIC05930)、YM2-22(MBIC04682)、YM2-27(MBIC04687)、YM2-6(MBIC04669)、YM1-68(MBIC04664)、YM1-38(MBIC04661)、YM2-4(MBIC04667)、YM2-5(MBIC04668)、YM2-7(MBIC04670)、YM2-21(MBIC04681)、YM2-1(MBIC04666)、T-565(MBIC05877)、T-424(MBIC05876)、噬细胞菌属UP7(MBIC01484)、T-551(MBIC05929)、Perfo&""A印d"Vt附(IFO12017)、T-561(MBIC05879)、海水环状杆菌(C^c/o6ac""'Mm加a"mi加)(LMGl3164)、噬细胞菌属(MBIC01539)、谊细胞菌属(MBIC01599)，和CA拟/ic^/ragap/"e"w's(DSM2588).对于上述菌抹，标记为"MBIC"的菌林可获得自MarineBiotechnologyInstituteCultureCollection(MBIC)(3-75-1Heita,爸石，Iwate,日本)(http:〃seasquirt.mbio.co.jp/mbic/index.phppage=top)标i&为"IFO"的菌株可获得自InstituteforFermentation,大^(IFO)(17-85，Juso-Honmachi2-chomeYodogawa-ku，大酸，日本).才示i己为"ATCC"的菌抹可获得自AmericanTypeCutureCollection(ATCC)(12301ParklawnDrive,Rockville,马里兰，20852，美国).标记为"DSM"的菌林可获得自DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)(MascheroderWeglb,38124Braunschweig,德国)标记为"LMG"的菌林可获得自BCC1VFM/LMGBateriaCollection(BelgianCo-ordinatedCollectionsofMicroorganisms,LaboratoriumvoorMicrobiologic，UniversiteitGent(RUG)，K丄丄edegancksfaat35，B隱卯00Gent,布香塞尔，比利时)，上迷的类似菌林中，特别优选的是其16SrRNA基因和/或gyrB基罔中，V3区的核苦^列与YM-1-69或YM-2-23林的相应核苷酸序列相同的菌株.通常将培养海洋细菌的一般培养技术应用于培养上述微生物.可以使用合成或天然的培养基，只要其包括足够量的微生物可吸收的碳源、氣源、无机物质等物质即可.碳源的例子包括葡萄糖、淀粉、糊精、甘露糖、果糖、蔗糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘M醇和糖浆.其可单独或结合使用，此外，取决于菌抹的吸收能力，还可使用糖类、醇类、有机酸等，氮源的例子包括氟化铵、硝酸铵、疏酸铵、硝酸钠、尿素、胨、肉汁、酵母抽提物、干酵母、玉米浆、大豆粉和酪蛋白氛基酸.其可单独或结合使用.此外，还可根据需要加入无机盐，例如氯化钠、氯化钾、疏酸镁、碳酸钙、礴酸二氮钾、八水合磷酸镁、碟酸亚铁、氯化钙、硫酸铨、硫酸锌或硫酸铜.可加入足量的促进所用菌林生长或促进本发明化学物质的制备的微量元素(如，糖类、氨基酸或无机盐).液体培养是最有效的技术，适宜的培养温度约30*C，培养基的pH水平通常为7-9，且优选7.5-8.使用氩氣化钠、盐酸水溶液等调节培养基的pH水平.当液体培养进行l-4天时，新化学物质l或2在培养液和菌株中产生并累积.当培养产物中产生的新化学物质的量达到泉大水平时优选终止培养.最优选在培养开始3天后终止培养，9根据从培养产物中分离和纯化微生物代谢产物的一般技术，从培养产物中分离和纯化新化学物质1或2.其一个实施例中，对培养产物进行过滤或离心以从菌抹中分离出培养物滤液，并借助于，例如曱醇水溶液或乙腈水溶液提取菌林.之后，使用旋转蒸发器或其它方式从提取物中减压除去有机漆刑，将此提取物和培养物滤液结合起来，使所得物质在聚苯乙烯等吸收剂(如，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)上进行吸附.漂洗被吸附的活性物质使其脱盐，并借助于，例如甲醇水溶液或乙靖水溶液对该活性物质进行洗脱.采用冻千法等方法减压浓缩洗脱液，使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、离子交换色谦法、凝胶过滤色详法或高效液相色详法，通过色谱法获得新化学物质1或2.新化学物质2为非常不稳定的化合物.将新化学物质2放置在强碱性水溶液，例如氩氣化钠水溶液和氨水溶液中时，其逐渐转变为新化学物质1.新化学物质1为非常稳定的化合物.用足够的甲基化试剂(如，三甲基甲硅烷基重氮甲烷)处理新化学物质1可获得新化学物质1的单甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物.可调节三甲基甲硅坑基重氮甲烷与新化学物质1的摩尔比，或者可选择适当的反应条件(如，反应温度或pH水平的设定，或在二甲基氨基硫三氟化物(DAST)存在下反应)，从而选择性地获得单甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物.此外，具有下述物理化学性质的MelH3可通过用硼氢化钠处理上迷三甲基化衍生物而获得.而且，改变反应溶剂的极性和反应温度可获得化合物MelHl，其为MelH3进一步还原所得的衍生物.甲基化衍生物MelHlMe或类似的坑基化衍生物可在强碱条件下，由RI(其中R代表C卜6坑基)所代表的烷基碘(如，碘代甲坑)与MelHl进行作用获得.有关此反应及其产物的信息在，例如，鉴定新化学物质1或2时特別有用.根据本发明的新化学物质1和2可用作海藻培养基的活性成分.其可单独或结合使用.上述培养海藻的培养基优选用于培养海洋大型缘藻.海洋大型绿藻的一种形式为属于石莼亚目的海洋藻类，其例子包括绿藻，例如，礁膜科和石莼科.属于礁腹科的海藻的具体例子包括礁膜(monostromanitidum)、尖种梯、膜(AT(rmorfM附ao;o^pe/7n"附)和袋确,膜(Monostromaangicave).属于石莼科的海藻的具体例子包括扁浒苔、肠浒苫、缘管浒苔、蛎菜和孔石莼.培养海洋大型绿藻的培养基可与常用培养技术中所用的、使海洋大型绿藻不利地成为羊细胞的培养基相同，只是该培养基中要包括新化学物质1和/或2作为活性成分.例如，可使用ASP7培养基、PES培养基、PESI培养基，或使用只进行了杀菌的海水.新化学物质1和/或2在培养基中的有效浓度并不受特别限制，只要可诱导叶状体形成即可.优选10"-10"Vg/ml.培养温度不受特别限制，只要海洋大型绿藻能在其中存活即可.温度适当为约15TC-25TC.附困简述困l为新化学物质1的质谱闺.图2为新化学物质1的iH-NMR详图.图3为新化学物质1的"C-NMR谱困.图4为新化学物质2的'H-NMR谱图.图5为实施例1的试验中未加入试样时，培养开始5天后，培养的尖种樣膜细胞的照片.图6为实施例l的试验中已加入试样时，培养开始5天后，培养的尖种礁膜细胞的照片.图7为Mel的iH-NMR谦困，困8为Mel的"C-NMR谦闺.图9为MelB的'H-NMR谦图.图10为MelH3的'H-NMR谦困困11为MelHl的H-NMR谦图.图12为MelHlMe的'H-NMR谦困.困13为实施例5中，培养开始10天后，7-步稀释的照片.困14为实施例5中，培养开始10天后，6-步稀释的照片.图15显示了实施例7中，使用孔石莼进行试验所得的结果.困16显示了实施例7中，使用肠浒苔进行试验所得的结果.闺17为YM-1-69抹、YM-2-23林及其类似菌抹的gyrBDNA系统树.困18为YM-1-69林、YM-2-23林及其类似菌株的16SrDNA系ii统树，以及这些菌株诱导大型绿藻形成形态的具体活性.本说明书包括日本专利申请号2002-203608的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，该专利申请为本申请的优先权文件.本发明的最佳实施方式下面将参考下列实施例对本发明进行更详细的描述，但本发明的技术范围并不限定于这些实施例中.参考实施例1微生物的分离按照下述方式分离本发明中使用的菌抹.将无菌海水(10ml)加入到约lg收集的新鲜海藻中，并将所得物质剧烈旋转约1分钟.使用无菌海水将上层清液进一步稀释10倍和100倍，将lOOpL该物质分注到1/10的海琼脂板上，并使用无菌Conradi棒将其分布于整个板上.该板在室温下放置2-3天，将生长的、显示出黄-红色的菌落单独接种在单独的海琼脂板上，并不断进行接种直至获得单一的菌落.将ASP7培养基(1或2ml)分注在24-孔或48-孔微板上，并向每个孔中加入约20个单细胞尖种礁膜细胞.使用无菌接种环或类似物，每次直接将各个分离菌林的菌落接种在2个孔中，该板在19-22t:下培养5天，每天由14小时的光照和10小时的黑暗組成，在倒置显微镜下观察到尖种礁膜叶状体的形成.并按照上述方法对形成叶状体的菌抹进行另外的测试，以确定叶状体的形成.经上述筛选步骤，结果YM-1-69和YM-2、23作为显示出形成叶状体活性的物质被分离出来，YM-l-69林分离自仙掌藻(纲绿藻纲，目松藻目)，YM-2-23林分离自礁膜(纲绿藻纲，目石莼亚目).参考实施例2微生物的鉴定确定参考实施例l所得的微生物中，16SrRNA基因和gyrB基因的V3区的DNA核苷酸序列，YM-1-69抹的16SrRNA基因和gyrB基因中，V3区的DNA核苷酸序列分别如SEQIDNO:l和SEQIDNO:3所示.YM-2-23林的16SrRNA基罔和gyrB基因中V3区的DNA核苷酸序列^^别如SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示.根据所得序列对数据库(DDBJT-fasta)进行检索.结果，发现这些序列与表1所示微生物的序列高度类似.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>195.26AB032505294.18M62799384.91AB032586478.18AB034224对YM-1-69和YM-2-23林的物理化学性质进行了考察，考察结果如表2所示.13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>+:阳性，-:阴性根据表1和2所示的结果，YM-1-69林鉴定为7fe/wc幼flc"/"m属，YM-2-23林鉴定为噬纤维菌属-黄杆菌属-拟杆菌复合体.实施例1培养尖种碟膜的试验经抗菌素等物质杀菌处理的尖种礁膜失去了叶状体形状，就如在合成培养基，如ASP7培养基中自然观察到的形状，而且其基本上变为单细胞状.将改性ASP7培养基(1ml)加至笫一排中，再将其O.Shnl加至笫io二排及随后的48-孔微板中，进行悬浮培养(Iwaki，下文缩写为"48-MTP")，将lljd的各个目标活性物质部分加至第一排中，并取lOOfil所得物质加至下一排中，同时用移液管进行充分搅拌*每一部分重复进行此步骤8-18次.这样就可制得8-18系列的lO-倍稀释液.弃去最后一排的剩余物(iooy).尖种礁膜的培养液稀释至最终浓度时，每ml该溶液中包括10-20个细胞，将该培养液加至48-MTP的每个孔中，每孔加入量为lOOjil，总量达到1ml.在221C只有光照的^ff下培养该48-MTP3-5天，并在倒置显微镜下评价叶状体的形成.巳形成叶状体的这些试样中，最低试样浓度确定为最小有效浓度5(MEC)，认为试样中的活性物质被浓缩到了最低MEC，并将其用作分离的指示器，图5显示未加入试样时，培养开始5天后培养的尖种礁膜细胞的照片.图6显示加入试样时，培养开始S天后培养的尖种碌膜细胞的照片.如困6所示，当活性物质存在时，观察到了叶状体的形成.ioASP7培养基的组成如下所示.表3改性ASP7培养基(l升，pH:7,8-8,0)蒸馏水950mlNaCl25gMgS04'7H209gKC1700mgCaCl2840mgTris■HC1lgNaN0350mgNa广丙三基P0420迈gNa2Si03.9H2070mg维生素B12l吗次氮基三乙酸70mg维生素混合物S3"10mlpn金属*230姐1S2金属*35ml15表4<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例2新化学物质1的分离和纯化使用YM-2-23抹(FERMBP-8417)作为种菌.使用海水肉汁(37.4g/l，Difco或按照预定成分将试剂混合起来制得)作为总培养的is培养基.30X:下，使用50ml海水肉汁，在100ml锥形烧瓶中振荡-培养(lOOrpm)该种菌24小时，全部培养产物再接种至含有450ml培养基的1升带挡板锥形烧瓶中，并在相同条件下培养24小时.对于该总培养，于U0rpm下在分别含有800ml培养基的16个1升带挡板锥形烧瓶中进行振荡培养，于100rpm下在分别含有450ml培养基的10个1升锥形烧瓶中进行另一组振荡培养.这种培养过程在30TC下进行3天.如此得到的约18升培养液进行离心作用.菌林在提取前保存于-20TC下，而培养物滤出液保存于41C下.由上述4个分別的总培养过程获得的菌抹(约72升)经1，200ml50%乙猜水溶液提取两次再进行浓缩.浓缩物与约72升的培养物滤出液结合，并使所得物质吸附在2，500ml苯乙烯-二乙烯基苯共聚物甲醛系树脂HP-20(MitsubishiChemicalCorporation)上，该树脂用6，000ml10%乙腈水溶液洗涤脱盐，并用6，000ml50%乙腈水溶液洗脱，以获得可诱导叶状体形成的部分.使活性部分吸附在ToyopearlJ)EAE-650(M)(Tosoh)上，用180mMNaCl-20%乙猜洗涤，并用450mMNaCl-20%乙猜水溶液洗脱.洗脱下来的部分经减压浓缩除去乙猜，再使其吸附在500ml甲搭系树脂HP-20(MitsubishiChemicalCorporation)上，并用l，000mll0%乙猜水溶液洗涂脱盐.这样，借助于l，OOOml50%乙猜水溶液得到了活性部分.减压浓缩后进行冷冻干燥，以获得诱导叶状体形成的部分.上述培养和分级分离过程重复两次(约140升细菌培养物)并结合起来.所得物质用凝胶过滤色谦(SephacrylS-100HR，25mm(内径)xl，200mm(长度)，AmershamBioscience)纯化，该色谦使用lOOmMNaCl-20mMNa2HPO4-20%^腈(pH9)水溶液作为流动相，得到了对促进叶状体形成显示出活性的部分.对所得活性部分进行浓缩、脱盐、冻千、用高效疼相色谱(3-mlRESOURCEPRC柱，2根6.4mm(内径)xioOmm(长度)的柱子彼此串联，AmershamBioscience)分离，该色谦柱使用14%-22%乙腈-5g0>^4)2<:03/升的水溶液作为流动相、冻干，然后再用高效凌相色谱(3-mlRESOURCEPRC柱，2根6.4mm(内径)xi00mm(长度)的柱子彼此串联，AmershamBioscience)分离，该色详柱使用5%-25%乙腈/l^NH3水溶液作为流动相纯化，这样，得到了约140fig根据本发明的、具有上述物理化学性质的新化学物质1.实施例3新化学物质2的分离和纯化已发现，根据实施例2中描述的步骤分离出的新化学物质1是新17化学物质2在强碱条件下(由于在最后纯化时使用了5%-25%乙請-1XNH3水溶液)的修饰衍生物.新化学物质1在纯化前与新化学物质2—起存在于培养物上层清液中.虽然新化学物质2在中性至弱碱性条件下非常不穗定，但碱性条件下形成的新化学物质1相对稳定，如果在实施例2的最后纯化步骤中使用髙效液相色详(3-mlRESOURCEPRC柱，2根6.4mm(内径)xi00mm(长度)的柱子彼此串联，AmershamBioscience)进行分离，且其流动相为17%乙精-5g(NH4)2C03+5ml1^3/升的水溶液，则可以得到具有困4所示的'H-NMR谦困的化学物质2.实施例4新化学物质1的曱基化衍生物及其进一步衍生物的制备，以及它们的物理化学性质将新化学物质l(约140叫)溶解在40jU曱酵中，向其中加入16(^1苯和100jil三甲基甲硅烷基重氮曱烷(10%,正己烷溶液，由东京KaseiKogyo有限公司制造)，充分搅拌该混合物，并使所得物质在室温下反应2小时.逐渐加入小部分乙酸直至重氮甲烷的黄色消失，使用蒸发器蒸馏除去溶剂，之后经高效液相色浙TSK凝胶ODS-80Ts,4.6mm(内径)xl50mm(长度)，Tosoh)分离，该高效液相色谦使用50%-100%乙猜-水作为流动相.结果，基本上定量(产率约152吗，"%)得到新化学物质1的三甲基化衍生物(下文中缩写为"Mel").该三曱基衍生物在NMR光谦的溶剂氘代甲醇中，由于氘代甲氧基(-OCD3)逐渐取代一个甲氧基(-OCH3)而成为MelB,将Mel(约152叫)溶解在200jd甲醉中，水浴条件下加入lmg硼氢化钠，并使所得物质还原1小时.反应溶液经高效液相色谱(TSK凝胶ODS-80Ts，4.6mm(内径)xl50mm(长度)，Tosoh)分离，该高效液相色谱使用50%-100%乙精-水作为流动相.结果，以髙产率(产率约l"ng,诉%)得到Mel的还原衍生物(下文缩写为"MelH3"),将上面获得的全部MelH3溶解在400jil干燥的乙醚中，室温下向其中加入100一溶于乙醇的硼氢化钠溶液(加mg/ml)，并使所得物质在室温下反应l知分钟.向其中加入饱和氯化钠水溶液UOOnl)，所得物质搅拌10分钟，再使用蒸发器蒸馏除去溶剂.用流动相为50%-100%乙腈-水的高效液相色谱(TSK凝胶ODS-80Ts,4.6mm(内径)xl50mm(长度)，Tosoh)分离反应溶液，结果，基本上定量(产率约123jig，99%)得到高度还原的Mel衍生物(下文縮写为"MelHl").另外，再将上面获得的全部MelHl溶解在400fU干燥的二甲基亚砜中，向其中加入lmg精细粉碎的氨氣化钠、40U埃扠曱烷，然后使所得物质在室温下反应30分钟.冰浴条件下加入蒸馏水(50(^1)以终止反应.此后，再用流动相为50%-100%乙腈-水的髙效液相色详(TSK凝胶ODS-80Ts,4.6mm(内径)xl50mm(长度)，Tosoh)分离该反应溶液.结果，基本上定量(产率约135jig，99%)得到高度还原的MelHl的甲基化衍生物(下文缩写为"MelHlMe").如此制得的化合物具有下列物理化学性质.Mel的物理化学性质1.物质颜色无色2.分子量:4993.质谦分析FABMS:m/z500M+H+4.核磁共振信号1)'H-NMR(氛代甲醇，500MHz):(图7)5ppm0.916(3H，s),0.941(3H，s),0.973(3H，s)，1.086(1H，ddd，J-3.5，12,5,13.0Hz)，1.136(1H，dd，J一2.0,12jOHz)，1.271(1H，ddd，J-4.0,13.0，14.0Hz)，1.380(3H，s)，1.47(2H，m)，1.50(1H，m)，1.65(1H,m)，1.69(2H，m)，1.73(1H,m),1,84(1H,m)，2.130(1H,ddd，J-3.5,7.0，12.5Hz),2.34(2H,m),3.488(3H，s)，3.914(3H,s),4.034(3H，s)，7.911(1H，d，J-8.0Hz)，8.258(1H，d,J-8,0Hz)2)13C-NMR(氛代甲醇，125MHz):(图8)5ppm15.413(q)，19.559(t)，20.797(t)，20.961(q),21.981(q)，28."6")，33.855(q)，34.164(s)，37.928(s),4(K356(t),41.722(t)，42.996(t)，52.266(q)，53.255(q)，52,255(q)，53328(d)，57.432(d),79.291(s)，120.0(s)，127.392(d),140.407(d),141.6(0，146.659(s)，149.8(s)，164.761(s)，166.027(s)，167.402(s)5.溶解度几乎不溶于水和DMSO，溶解于含水溶剂，如50%-100%曱醇水溶液或50%-100%乙猜水溶液中，几乎不溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氣仿中.MelB的物理化学性质1.物质颜色无色2.分子量5023.质详FABMS:m/z503[M+H+4.核磁共振信号1)!H-NMR(氛代甲醇，500MHz):(围9)5ppm0.916(3H,s),0,941(3H，s),0.973(3H，s),1.086(1H，ddd，J-3.5，12.5，13.0Hz)，1.136(1H,dd，J-2.0,12jOHz)，1.271(1H,ddd,J-4.0，13.0,14.0Hz)，1.380(3H，s),1.47(2H，m)，1.50(1H,m),1.65(1H，m)，1.69(2H，m)，1.73(1H，m)，1.84(1H，m),2.130(1H，ddd，J3.5，7.0,12.5Hz)，2.34(2H,m)，3.488(3H，s)，3.914(3H,s)，7.911(1H，d，J=8.0Hz)，8.258(1H，d，J8.0Hz)5.溶解度几乎不溶于水和DMSO，溶解于含水溶剂，如50%-100%曱醇水溶液或50%-100%乙腈水溶液中，几乎不溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氯仿中.MelH3的无力化学性质1.物质颜色无色2.分子量4713.质详FABMS:m/z4M+H+4.核磁共振信号1)力-醒R(DMSO-d6,500MHz):(困10)5ppm0.802(3H，s)，0,810(3H，s),0.885(3H，s)，0.951(1H，m)，1.018(1H，m)，1.150(1H，m)，1254(3H，s),1.35(1H，m)，1.36(1H,m)，1,37(1H，m)，ISO(1H，m)，1.54(1H，m)，1.57(1H，m)，1.58(1H，m)，1.688(1H，m)，1.984(1H，m)，2.174(2H，brd，J-8.5Hz)，3.399(3H，s),3,741(3H，s)，4.570(2H,brd，J豕5.5Hz)，5.495(1H，brt，J=5.5Hz)，7.587(1H，d，J8.0Hz)，7.722(1H，d，J=8.0Hz)2)13C-NMR(氛代曱醇，基于HMBC(异核多重键相关谱)和HSQC(异核单量子相关详)光详确定化学位移)5ppm14.2(q)，17.7(t),19.0(t),20.0(q)，21,1(q)，26.720(t)，33.0(q),33,3"),36,1(s),38.3(t)，40.1(t)，".l(t)，51.2(q),51.2(d),52.0(q),55.2(d),63.7(t)，76力(s)，119.2(s)，121.8(d),134.1(s),138,3(d)146.2(s),159.8(s)，162.8(s)，166.2(s)5.溶解度几乎不溶于水和100%甲醇，溶解于含水溶刑，如50%的甲醇水溶液或50y。的乙腈水溶液中，溶于DMSO,几乎不溶于弱极性有机溶刑，如己烷或氯仿中.MelHl的物理化学性质1.物质颜色无色2.分子量4153.质谦FABMS:迈/z41M+H厂4.核磁共振信号1)'H-NMR(氘代氣仿，500MHz):(图11)5ppm0.842(6H,s)，0.918(3H，s),0.97(1H，m)，1.04(m，m)，1，18(1H，m),1.327(3H，s)，136(1H，m)，1.42(m，m)，1.4S(1H,m)，1.55(1H，m)，158(1H，m)，1.64(1H，m)，1.667(1H，dd，J-5.5,12Hz),1,78(1H,m),2.02(2H,m)，2,05(1H，m)，3,650(2H，d，J=12Hz)，4.647(2H,d，J-14Hz)，4.801(2H，brs),7.226(1H，d，J-8.0Hz)，7.474(1H，d,J=8.0Hz)2)"C-NMR(氛代氯仿，基于HMBC(异核多重鍵相关详)和HSQC(异核单量子相关详)光谱确定化学位移)5ppm15.1(q),18.4(t)，19.8(t),20.9(q)，21.5(q),25.1(t)，33.2(s),33.3(q),36.8(s)，39.2(t)，40.7(t)，41.7(t)，52.5(d),56.0(d),60.61(t)，62.33(t)，64.73"),77.0(s)，106.0(s)，119.8(d)，133,2(s)，139.7(d),148.0(s)，156,2(s)5.溶解度几乎不溶于水，溶解于含水溶剂，如10%-100%的曱醉水溶液或10%-100%的乙猜水溶液中，溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氯仿中.MelHlMe的物理化学性质1.物质颜色无色2.分子量4573.质谦FABMS:m/z458M+H+4.核磁共振信号1)'H-NMR(氖代氯仿，500MHz):(困12)5ppm0.847(6H,s)，0,921(3H,s),0.96(1H,m)，1.05(1H，m)，1.18(1H，m)，1.331(3H,s)，136(1H，m)，1.41(1H,m),1.43(lft，m)，1.57(1H，m)，159(1H，m)，1.67(1H，m)，1.68(1H，m)，1,77(1H，brd，J-13Hz)，2.00(1H，m)，2.09(1H，m)，2.16(1H，m)，3.19(3H，brs),3.45(3H，brs)，3.509(3H,s)，3.564(2H，d,J-12Hz),4.419(2H，dd，J=8.5,10.5Hz)，4.644(2H，brs),7.356(1H，d，J=7.0Hz)，7.488(1H，d，J=7.0Hz)2)13C-NMR(氖代氯仿，确定基于HMBC(异核多重键相关)和HSQC(异核单重子相关)光诤确定化学位移)5ppm15.0(q),18.7(t)，20.0(t)，20.6(q)，21.7(q),26.2(t),33.2"),33.5(q)，36.9(s)，39.4(t)，41.0(t),42.0(t)，52.8(d)，56.2(d)，58.4(q)，59.0(q)，59.1(q)，70.2(s)，74.0(s),75.6(s),76.9(s)，109.9(s)，120.5(d)，135.1(s),139.2(d)，145.7(s)，155.1(s)5.溶解度几乎不溶于水，溶解于含水溶剂，如30%-100%的甲醉水溶液或30%-100%的乙腈水溶液中，溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氯仿中.实施例5新化学物质1最小有效浓度(MEC)的检测按照与实施例l相同的方式，对在48-MTP上分离和純化的新化学物质l进行16-步稀释，稀释开始于最终浓度lng/m1.这种情况下，lml培养基中约包括20个尖种樣膜细胞.稀释时，随着稀释步猓的进行，移液管末端进行交换.提供了其3个系列的试样，并按照实施例l的情况培养3天.其显示达到U-步稀释的排同时，尖种礁膜形成了叶状体，这说明新化学物质1的MEC为l叫/mlxlO-"=lag/ml.当该培养持续进行很长一段时期时，新化学物质1被生长的尖种礁膜消耗，则叶状体开始降解.困13显示了培养开始(新化+物摩1的最终浓度lxlO->g/ml)10天后，7-步稀释的照片.虽然在某些程度上保持了叶状体的最初形式，但仍观察到了叶状体的降解。图14显示22了培养开始(新化学物质l的最终浓度lxl(TVg/ml)IO天后，6-步稀释的照片.叶状体还保持未降解，培养开始10天后的MEC为lxlO-Vg/ml-lpg/ml.在实施例1所述的条件下，尖种礁膜每天约进行两次有丝分裂.如果初始细胞数量为20，则根据计算，3天后的细胞数量为20x(2x2)3=1，280个细胞，而10天后的细胞数量为20x(2x2)1()-20，971，520个细胞.也就是说，培养开始10天后的细胞数量与培养开始3天后相比，增加至10,000倍或更多，而MEC根据细胞数量和培养天数会发生显著变化.更具体地说，取决于培养天数和细胞生长数量，需要加入充足的新化学物质1.实施例6新化学物质l及其衍生物的活性按照与实施例5相同的方式，测定新化学物质1及其衍生物的最小有效浓度.得到下面所示的结果.表7最小有效浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>当新化学物质l进行了甲基化时，其活性降低至1/108,这说明，如实施例4中所迷的，被甲基化试剂，如三甲基曱硅烷基重氮曱坑甲基化的官能团对于活性来说是非常重要的.实施例7培养孔石莼和肠浒苔的试验利用趋光性，在包括抗菌素混合溶液的ASP7培养基中洗涤源自孔石莼和肠浒吝(收集于Miho、SWmizu、Shizuoka，日本)的游动细胞.将洗涤后的细胞加入到覆盖有无菌盖片的正方形器皿中，然后将细胞杀菌5天.当游动细胞沉积在盖片上并开始生长时，将各个盖片放置在6-MTP的各个孔中，并加入lOml不含抗菌素的ASP7培养基.将新化学物质1以lng/mg的量加入到试验试样中，而不向对照试样中加入任何物质，按照与实施例l相同的条件培养7天.10天之后，在已加入相同培养基的培养试管中对试验试样和对照试样的盖片进行再次培养，再次培养另外进行7天.困15显示了对孔石蔬进行试验的结杲，困16显示了对肠浒苜进行试验的结杲.由试验试样和对照试样的比较显而易见可知，对照试样中只有假根异常生长，并没有形成正常的叶状体.与之相比较，加入新化学物质1时，沉积后可观察到叶状体的正常生长和形成.上迷包括抗菌素混合溶液的ASP7培养基这样制备向ASP7培养基中加入2%的抗菌素混合溶液，该抗菌素混合溶液具有下列组成表8抗菌素混合溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例8促进大型绿藻形态形成的特定活性按照与实施例5中相同的方式，测定如困17中所示的YM-1-69林、YM-2-23林和类似菌林的最小有效浓度.得到如闺18所示的结果.水平轴代表由类似菌林培养物上清液活化的尖种礁膜培养液的量.例如，lnlYM-2-23株的培养物上清液可活化约8,000ml困18中的尖种礁膜培养溶液.所有本文中？1用的出版物、专利和专利申请的全部内容均结合至本文中作为参考.工业实用性本发明提供一种利用新化学物质培养海洋大型绿藻，如石莼科和礁膜科绿藻的新技术.该技术使实验室无菌培养或安全维持和处理种子及幼苗成为可能，并使海洋大型绿藻在海中牧场或其它地方稳定生产和生长成为可能.序列表<110>MARINEBIOTECHNOLOGYINSTITUTECO.,LTD.<120>具有形态形成活性和促进生长活性的新化学物质<130>PH-1841-PCT<150>JP2002/203608<151>2002—07-12<160>4<170>PatentlnVer,2.1<210>1<2]1>190<212>脆<213>Tenacibaculum属<400〉1CCmCGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGCGCGTGTAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTTTACGTGTAGAGGCTTGACGCTACCATAAGCCGCGGTAATTCAATGGAGGCMCTCTGAACCAGCCATGC60AAACTACTTTTATATGGGAAGAAACCCCTC120AATAAGCACCGGCTMCTCCGTGCCAGCAG180190<210>2<211>189<212>DNA<213>未知<400>2CCT紅GGAGGC紅AGTCAGGAATATTGGCGC&TGCGGGAAGAAGGCCCTATGGGTCGTUCGTGTAGGGTACTGACGGTACCGTAAGACGCGGTAATACAATGGGCGGGAGCCTGATCCAGCCATGC60AAACCGCTTTTATACGGGAAGAAACCACCC120ATAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGC180189<210〉3<211〉1173<212>DMA<213>Tenacibaculuui属<400>3GTATCTGGAGGTTTACACGGAGTTGGTGTATCTTGTGTGAATCCACTTTCACATCATTTA60AAAGCTACAGTTCACAGAGAAGGTMAATATGGGAACAAGAGTATGAACGTGGTAAMCA120CTTTATCCTGTAAAMCTGTAGGTGAMCTGATATAACTGCTACAGAAGTAACTTTCTTA180CCAGACAAAAGTATTTTCCAACAAACCACAGMTATMTTACGAAACGTTAGCTACACGT240ATGCGTGAGTTAGCGTATCTTAATAAAGGAATCACGATTACGTTAACAGATMGCGTAAT300AAAGATGATCAAGOAAATTTTATTGCTCAAACTTTCCACAGTAACGAAGGATTATCTGAA360TTTGTTAAATATTTAGATAGTACTCGTACTCCTGTTATTCAGCATGTAATTTCAATGGM420GGTGAGMAAACGGAATTCCTCTTGAGGTTGCAATGATTTATAATGATTCATATGCTGM480AATTTACATTCTTATGTMATAACATTAATACTCACGAAGGAGGAACACATTTATCAGGA540TTTAGAAOAGGTTTAACAAGTACTTTAAAGAAA窗GCAGATACTTCTGGATTACTAAAGSOOAACGTTAAGTT微GATTTCTGGAGATCATTTCC&Tr掘GTTTMCGGCAATTGTATCT660CTAAAAGTAGCTGAACCTCAGTTTGAAGGACAAACAAAMCAAM窗GAAACAGAGM720GTTACTTCTGCAGTATCGCAAGCTGTAGCAGMATGTTAACTGATTATTTAGAGGAAAAT780CCTAATGATGCTAAAACGATTGTACAAAAAGTAATTCTTCCAGCTCAAGCGCGTCACGCA840GCTCGTAAAGCMGA&AAATGGTGCAACGTAAMCAGTAATGAGTATTGGAGGTTTACCT900r'GTAAACTATCTGATTGTTCTCAAACTCATCCAGCAGTTTGTGAAATTTTCTTAGTCGAG960GGAOATTCGGCAGGTGGAACTGCAAAACMGGTCGTGATCGTAATTTCCAAGCAATTTTA1020CCCTTACGTGGTAAGATTCTTAACGTAGAAAAAGCGATGCAGCATAAAGTTTTTGAGMT1080GAAGAAATCAAAAACATGTTTACGGCTTTAGGAATCACTATCGGAACAGAAGMGATCCA1140AGAGCATTAAACTTATCMAATTA旭ATATCAT1173〈210〉4〈211>1173<212〉DNA<213〉未知<4O0〉4GTATCCGGTGGTTTGCACGGGGTAGGTGTTTCTTGTGTGAACGCCCTTTCCAATCATCTT60AAAGCTACCGTACATAGAGATGGGAAACTTTGGGAACAGGAATATGAACGGGGTAAATCC120CTTTATCCCGTAAAAAGTGTTGGGGAGACCGATGMACTCGAACCATTGTTACCTTCATA180CCAGATGATTCAATCTTTACCCAAACAACAGAGTATAGTTATGAGACCCTTGCCAACAGA240ATCCGTGAGCTTTCGTTCTTGAACMAGGGGTTACCATTAGCATTACGGACAAAAGAGTA300AAGGATAA化AAGGG&AGTACCTTTCTCAAACTTTTTATTCCGATGCTGGACTAAGTGAA360TTTGTTAAGTTCTTGGATGGTACCCGTGAACCTTT&ATTCAAGGGGTTATCGCGATGGAA420GGGGAGAAAAATGGTATCCCTCTCGMGTCGCMTGGTTTACAACACCAGTTACACGGAG480A.ATTT織TTCCTATGTGAATAACATTAACACGCACGAAGGGGGTACGCATCTTTCCGGT540TTTAGAAGGGGATTGACCTCTACTTTAAAGAAATACGCAGATTCTTCTGGAATGCTCGA&6D0AAATTGAAGTTTGAGGTTCAGGGAGATCATTTCCGTGAAGGACTTACAGCAATTCTTTCC660GTTAAGGTCGCAGAACCT(:AATTTGMGGTCAGACGAAAACCAAGCTTGGAMCCGCGAG720CTTTCTTCTGCGGTGAGCCAAGCTGTTTCTGAMTGCTCACGGATTATTTGGAGGAGCAT780CCAGATGATGCCAAGGTTATTGTTCMAAAGTTATCCTTGCCGCTCAGGCCAGACATGCC840GCTACAAAGGCCCGTGAMTGGTACAGCGTAAGACGGTAATGAGTATTGGTGGGCTACCT9D0GGAAAATTGTCCGATTGTTCTGAGCAAGATCCTGCGCAATGTGAAGTATTTCTTGTAGAG960GGAGATTCTGCAGGTGGTACGGCAAMATGGGCCGGGACCGAAAATTTCAGGCCATTCTT1020CCACTAAGGGGTAAAATCTTGAACGTGGAAAAAGCCATGCAGCACAAGGTTTTTGAAAAT1080GAGGAAATAAAGAATATTTATACGGCCCTAGGGGTTACTATTGGAACGGAAGAAGATAGTU40AAGGCCTTCAACCTGGAAAAATTAAGATATCAT117权利要求1.一种新化学物质1，其具有下列物理化学性质(i)物质颜色无色(ii)分子量457(iii)质谱分析FABMSm/z456[M-H]-(iv)核磁共振信号1)1H-NMR(D2O-20mMNa2HPO4(pH9)，750MHz)δppm0.818(3H，s)，0.837(3H，s)，0.882(3H，s)，0.960(1H，m)，1.058(1H，m)，1.167(1H，m)，1.326(3H，s)，1.37(1H，m)，1.38(1H，m)，1.40(1H，m)，1.58(1H，m)，1.61(2H，m)，1.52(1H，brd，J＝13Hz)，1.76(1H，brd，J＝14Hz)，2.024(1H，m)，2.181(1H，dd，J＝4，14Hz)，2.291(1H，dd，J＝14，16.5Hz)，7.698(1H，d，J＝7.5Hz)，7.845(1H，d，J＝7.5Hz)2)13C-NMR(D2O-20mMNa2HPO4(pH9)，125MHz)δppm15.236(q)，19.037(t)，20.287(t)，20.955(q)，21.835(q)，25.987(t)，33.381(s)，33.636(q)，37.308(s)，39.590(t)，41.199(t)，42.346(t)，52.769(d)，56.381(d)，79.096(s)，114.965(s)，124.399(d)，139.004(s)，141.232(d)，150.282(s)，152.656(s)，172.081(s)，173.538(s)，174.661(s)。2.根据权利要求l所述的化学物质，该化学物质是从YM-2-23林培养物中通过分离和纯化获得的。3.根据权利要求1所述的化学物质，该化学物质是通过包括以下步骤的方法从YM-2-23林培养物中分离和纯化获得的培养YM-2-23林，通过过滤或离心从培养菌抹中分离出培养物滤液，借助于甲醇水溶液或乙腈水溶液提取菌林，在减压下，从提取物中除去溶剂，将此提取物和培养物滤液合并一起，使所得物质在聚苯乙烯吸收剂上进行吸附，通过漂洗将被吸附的活性物质脱盐，借助于曱醇水溶液或乙腈水溶液对该活性物质进行洗脱，减压浓缩洗脱液，和使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法或高效液相色谱法并且使用5%-25%乙腈/lWNH3水溶液作为流动相，将浓缩物纯化.4.一种新化学物质2，其具有下列物理化学性质(i)物质颜色无色(ii)核磁共振信号!H-匪R(D2O-20mMNa2HP04(pH9)，500MHz):5ppm0.815(3H，s)，0.834(3H，s)，0.877(3H,s)，0.949(1H，m)，1.048(1H，m),1.163(1H，m)，1.297(3H，s)，1.35-1.40(3H，m)，1.52-1.63(4H，m)，1.753(1H，brd,J=14Hz)，2.012(1H，m)，2.158(1H，m)，2.299(1H，m)，7.646(1H，d，J=8.0Hz)，7.769(1H，d，J-8.0Hz)'5.根据权利要求4所述的化学物质，该化学物质是从YM-2-23抹培养物中通过分离和纯化获得的。6.根据权利要求4所述的化学物质，该化学物质是通过包括以下步骤的方法从YM-2-23林培养物中分离和纯化获得的培养YM-2-23林，通过过滤或离心从培养菌林中分离出培养物滤液，借助于甲醇水溶液或乙腈水溶液提取菌抹，在减压下，从提取物中除去溶剂，将此提取物和培养物滤液合并一起，使所得物质在聚苯乙烯吸收剂上进行吸附，通过漂洗将被吸附的活性物质脱盐，借助于甲醇水溶液或乙腈水溶液对该活性物质进行洗脱，減压浓缩洗脱液，和使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法或高效液相色谱法并且使用17°/。乙腈-5g(NH4)2C03+5mlNHs/升的水溶液作为流动相，将浓缩物纯化.7.制备权利要求1~3中任意一项所述的化学物质的方法，其中在培养碁中培养能够产生所述化学物质的微生物，所述化学物质在培养物中产生并累积，并回收产生累积的所述化学物质。8.根据权利要求7所述的方法，其中微生物为YM-2-23林或readflc/w属YM-1-69林。9.制备权利要求4一中任意一项所述的化学物质的方法，其中在培养基中培养能够产生所述化学物质的微生物，所述化学物质在培养物中产生并累积，并回收产生累积的所述化学物质.10.根据权利要求9所述的方法，其中微生物为YM-2-23林或reflc/Aflc/w/属YM-1-69林。11.海藻培养基，其包括作为活性成分的权利要求l-3中任意一项所述的化学物质。12.海藻培养基，其包括作为活性成分的权利要求4-6中任意一项所述的化学物质。13.权利要求1~3中任意一项所述的化学物质的单曱基化、二甲基化或三曱基化衍生物，其通过用三曱基曱硅烷基重氮曱烷处理权利要求1~3中任意一项所述的化学物质而获得-14.一种化合物，其通过用硼氢化钠处理权利要求13中的三甲基化衍生物而获得.全文摘要本发明涉及一种诱导海洋大型绿藻形态形成和促进海洋大型绿藻生长的新化学物质，涉及一种使用微生物制备该新化学物质的方法，以及包括该新化学物质的、用于培养绿藻的培养基。文档编号C07D487/04GK101580523SQ200910128890公开日2009年11月18日申请日期2003年7月11日优先权日2002年7月12日发明者松尾嘉英申请人:三得利控股株式会社;学校法人北里研究所