专利名称：一种他克莫司粗品的精制方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫
司的精制方法，特别涉及通过反相高效液相制备色谱精制他克莫司的方法。
背景技术：
近十多年来，我国器官移植发展迅速，已跃居亚洲首位，世界第二。用于器官移植
后减少排异反应的免疫抑制剂类药物也呈现快速增长的趋势，普遍用于预防、抑制排斥的
免疫抑制剂是环孢菌素，但是其副作用大，给广大患者带来了一定的痛苦。 他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤泽制药公司于1984年是从土壤
放线菌中提取的一种大环内酯类抗生素，具有较强的免疫抑制特性，预防各种器官移植所
出现的排斥反应的效果明显优于环孢菌素。他克莫司能减少肝肾移植受体的急、慢性排斥
反应。他克莫司的患者，细菌和病毒感染率也较环孢菌素治疗者低，尤其是该药品有较强的
亲肝性，对肝移植的功效比环孢菌素高100倍，因而大大降低了临床使用剂量，可降低原治
疗费用1/3 1/2。他克莫司和环孢菌素合用具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不
仅可用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，如特
应性皮炎、风湿、类风湿性关节炎等，因此对防止器官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的
治疗具有重要意义。 由于他克莫司结构复杂，手性基团比较多，而且其发酵液中有很多异构体和类 似物，如二氢他克莫司、子囊霉素等，这些物质的存在使得他克莫司采用常规的分离纯 化方法无法完全分离而达到相应的纯度。关于他克莫司分离纯化的文献，主要是美国 专利U. S. 4， 894366， U. S. 6， 576， 135， U. S. 6， 881， 341， U. S. 7， 220， 357， W02005/010015， W0/2006/031664。这些专利报道了用吸附树脂或改性硅胶来精制他克莫司，纯化收率低，导 致工业化生产以后产品的成本很高，给患者造成沉重的负担。
发明内容
本发明的目的在于提出一种他克莫司的精制方法，克服了他克莫司现有的提取技 术的不足，提高了他克莫司的收率，降低了成本，从而提供一种稳定性好，分离效果显著，上 样量较大，能够实现工业化的纯化方法。 为了达到上述精细分离，保证一次分离纯度在98.5%以上并保证收率，本发明采 用制备色谱法纯化法。本发明在筛选多种色谱材料和优化色谱条件的基础上，确定了制备 色谱柱及色谱条件，并通过优化工艺路线，得到了如下一种他克莫司粗品的精制方法
1)室温条件下，用有机溶剂与水的混和溶液溶解他克莫司粗品；
2)采用反相液相制备色谱进行分离纯化； 3)合并收集液，减压浓縮，有机溶剂萃取，浓縮萃取液，重结晶，即得产品。 优选地，步骤1)所述有机溶剂为乙腈_水、乙腈_四氢呋喃_水、甲醇_乙腈_水
或异丙醇_水；进一步优选地，步骤1)所述有机溶剂水溶液的浓度为60-85%;进一步优选
3地，步骤1)所述有机溶剂水溶液的浓度为80-85%。 为了得到更好的分离效果，在反相液相制备色谱分离前可以对他克莫司粗品溶液 进行微滤膜过滤，微滤膜的孔径为0. 45 ii m。
优选地，上述步骤2)的色谱条件为 制备色谱柱C18反相色谱柱，内径10-50mm，长度250-300mm ; 流动相选自以下中的任意一种乙腈_水、乙腈_四氢呋喃_水、甲醇_乙腈_水
或异丙醇_水； 洗脱方式梯度洗脱；
流速20-50mL/min ;
柱温20-40。C;
最佳的检测波长为230nm。 如果制备色谱的流动相选择乙睛_水，则洗脱时用乙睛_水(75 : 25)洗脱2-3 个柱体积，再用乙睛-水(60 : 40)洗脱2-3个柱体积，再用乙睛-水(55 : 45)洗脱3_5 个柱体积，最后用乙睛-水(45 : 55)洗脱5-6个柱体积； 如果制备色谱的流动相选择乙腈_四氢呋喃_水，则洗脱时用乙腈_四氢呋喃_水 (40 : 40 : 20)洗脱2-3个柱体积，再用乙腈-四氢呋喃-水(30 : 35 : 35)洗脱2-3个 柱体积，再用乙腈-四氢呋喃-水(25 : 30 : 45)洗脱2-3个柱体积，最后用乙腈-四氢 呋喃_水(25 : 25 : 50)洗脱5-6个柱体积； 如果制备色谱的流动相选择甲醇-乙腈-水，则洗脱时用甲醇_乙腈-水 (40 : 45 : 15)洗脱2-3个柱体积，再用甲醇-乙腈-水(35 : 40 : 25)洗脱2-3个柱 体积，再用甲醇-乙腈-水(30 : 40 : 30)洗脱2-3个柱体积，最后用甲醇-乙腈-水 (30 : 30 : 40)洗脱6-8个柱体积。 如果制备色谱的流动相选择异丙醇-水，则洗脱时用异丙醇-水(70 : 30)洗脱 2-3个柱体积，再用异丙醇-水(60 : 40)洗脱2-3个柱体积，再用异丙醇-水(50 : 50) 洗脱2-3个柱体积，然再用异丙醇-水(40 : 60)洗脱2-3个柱体积，最后用异丙醇-水 (35 : 65)洗脱6-8个柱体积。 优选地，步骤3)所述有机溶剂优选为乙酸乙酯或乙酸丁酯。 另外，步骤3)重结晶时在浓縮后的萃取液中缓慢加入环己烷至有少量晶体析出， 然后将溶液置于1 l(TC继续析晶；优选4t:析晶。 本发明所述的他克莫司粗品来自于生物发酵后提取分离所得的他克莫司粗品，尤 其来自于链霉菌菌株发酵提取得到的粗品。 本发明与现有的分离技术相比，有以下的优点和效果 1、解决了他克莫司与子囊霉素，二氢他克莫司的分离难题，在制备色谱条件下，三 者可实现完全分离； 2、上样量较大，在实现完全分离的条件下，一次上样量可高达200mg ;
3、制备的他克莫司纯度高，获得他克莫司用HPLC检测纯度达98. 5%以上。
具体实施例方式
以下结合实施例进一步阐述本发明，应理解实施例并非用于限制本发明的保护范围 实施例使用的分析纯试剂有乙酸乙酯、环己烷、异丙醇、甲醇、乙醇、乙醚、正己烷；色谱纯试剂有乙睛、四氢呋喃(进口分装)；高压液相色谱仪和色谱柱(20X250mm)由大连依利特公司生产。
实例1 : 称取10g他克莫司粗品，溶解于50mL的乙腈-水(60 : 40)，然后用0. 45 y m的滤膜过滤。流动相为乙腈_水，流速为20mL/min，柱温25°C ，色谱仪用乙睛_水(75 : 25)平衡基线后，进样lmL，先以乙睛-水(75 : 25)洗脱2-3个柱体积，然后用乙睛-水(60 : 40)洗脱2-3个柱体积，然后用乙睛-水(55 : 45)洗脱3-5个柱体积，最后用乙睛-水(45 : 55)洗脱5-6个柱体积，根据出峰情况收集含有高纯度他克莫司的洗脱液。
合并收集液进行减压浓縮，直到无乙腈为止，浓縮液用乙酸乙酯萃取两次，萃取后的乙酸乙酯层减压浓縮至原体积的四分之一，然后在浓縮液中缓慢加入环己烷至晶体析出，放置4t:继续析晶，过滤得到的晶体用少量环己烷洗涤后烘干，用HPLC检测他克莫司的纯度达98. 6% ， 二氢他克莫司含量0.21%，子囊霉素含量0. 28% ，收率72% 。
实例2 : 称取10g他克莫司粗品，溶解于50mL的乙腈-四氢呋喃_水(40 : 40 : 20)，然后0. 45 ii m的滤膜过滤。流动相为乙腈-四氢呋喃_水，流速为15mL/min，柱温25°C ，检测波长为230nm。色谱仪用乙腈_四氢呋喃_水(40 : 40 : 20)平衡基线后，进样lmL，先以乙腈-四氢呋喃-水(40 : 40 : 20)洗脱2-3个柱体积，然后用乙腈-四氢呋喃-水(30 : 35 : 35)洗脱2-3个柱体积，然后用乙腈-四氢呋喃-水(25 : 30 : 45)洗脱2-3个柱体积，最后用乙腈-四氢呋喃-水(25 : 25 : 50)洗脱5-6个柱体积，根据出峰情况收集、合并含有高纯度他克莫司的洗脱液。 合并收集液进行减压浓縮，直到无乙腈和四氢呋喃为止，浓縮液用乙酸乙酯萃取两次，萃取后的乙酸乙酯层减压浓縮至原体积的四分之一，然后在浓縮液中缓慢加入环己烷至晶体析出，放置4t:继续析晶，过滤得到的晶体用少量环己烷洗涤后烘干，用HPLC检测他克莫司的纯度达98. 5 % ， 二氢他克莫司含量0. 24 % ，子囊霉素含量0. 34 % ，收率75 % 。
实例3 : 称取108他克莫司粗品，溶解于501^的甲醇-乙腈-水(40 : 45 : 15)，然后0. 45 ii m的滤膜过滤。色谱仪使用流动相为甲醇_乙腈_水，流速为15mL/min，柱温25°C ，检测波长为230nm。色谱仪用甲醇_乙腈_水(40 : 45 : 15)平衡基线后，进样lmL，先以甲醇_乙腈_水(40 : 45 : 15)洗脱2-3个柱体积，然后用甲醇_乙腈_水(35 : 40 : 25)洗脱2-3个柱体积，然后用甲醇-乙腈-水(30 : 40 : 30)洗脱2-3个柱体积，最后用甲醇-乙腈-水(30 : 30 : 40)洗脱6-8个柱体积，根据出峰情况收集、合并含有高纯度他
克莫司的洗脱液。 合并收集液进行减压浓縮，直到无乙腈和甲醇为止，浓縮液用乙酸丁酯萃取两次，萃取后的乙酸丁酯层减压浓縮至原体积的四分之一，然后在浓縮液中缓慢加入环己烷至晶体析出，放置4t:继续析晶，过滤得到的晶体用少量正己烷洗涤后烘干，用HPLC检测他克莫司的纯度达98. 5% ， 二氢他克莫司含量0.15%，子囊霉素含量0. 25% ，收率79% 。
实例4:
称取10g他克莫司粗品，溶解于50mL的异丙醇水(70 : 30)，然后用0. 45 y m的 膜过滤。色谱仪使用流动相为异丙醇水，流速为20mL/min，柱温25t:，检测波长为230nm。
色谱仪用异丙醇水(70 : 30)平衡基线后，进样imL，先以异丙醇水(70 : 30)洗脱2-3 个柱体积，然后用异丙醇水(60 : 40)洗脱2-3个柱体积，然后用异丙醇水(50 : 50) 洗脱2-3个柱体积，然后用异丙醇水(40 : 60)洗脱2-3个柱体积，最后用异丙醇水
(35 : 65)洗脱6-8个柱体积，根据出峰情况收集、合并含有高纯度他克莫司的洗脱液。
合并收集液进行减压浓縮，直到无异丙醇为止，浓縮液用乙酸丁酯萃取两次，萃取
后的乙酸丁酯层减压浓縮至原体积的四分之一，然后在浓縮液中缓慢加入环己烷至晶体析
出，放置4t:继续析晶，过滤得到的晶体用少量乙醚洗涤后烘干，用HPLC检测他克莫司的纯 度达99. 1 % ， 二氢他克莫司含量0. 26% ，子囊霉素含量0. 38% ，收率62% 。
权利要求
一种他克莫司粗品的精制方法，其特征在于，包括下列步骤1)室温条件下，用有机溶剂与水的混和溶液溶解他克莫司粗品；2)采用反相液相制备色谱进行分离纯化；3)合并收集液，减压浓缩，有机溶剂萃取，浓缩萃取液，重结晶，即得产品。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述有机溶剂水溶液的浓度为60-85%。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述有机溶剂水溶液的浓度为80-85%。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在反相液相制备色谱分离前对他克莫司溶液进行微滤膜过滤，微滤膜的孔径为0. 45 ii m。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)的色谱条件为制备色谱柱C18反相色谱柱，内径10-50mm，长度250-300mm ;流动相选自以下中的任意一种乙腈-水、乙腈-四氢呋喃-水、甲醇-乙腈-水或异丙醇-水；洗脱方式梯度洗脱；流速20-50mlVmin ;柱温20-40。C。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，检测波长为230nm。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，洗脱时用乙睛-水(75 : 25)洗脱2-3个柱体积，再用乙睛-水(60 : 40)洗脱2-3个柱体积，再用乙睛-水(55 : 45)洗脱3_5个柱体积，最后用乙睛-水(45 : 55)洗脱5-6个柱体积。
9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，洗脱时用乙腈-四氢呋喃-水(40 : 40 : 20)洗脱2-3个柱体积，再用乙腈-四氢呋喃-水(30 : 35 : 35)洗脱2-3个柱体积，再用乙腈-四氢呋喃-水(25 : 30 : 45)洗脱2-3个柱体积，最后用乙腈-四氢呋喃_水(25 : 25 : 50)洗脱5-6个柱体积。
10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，洗脱时用甲醇-乙腈-水(40 : 45 : 15)洗脱2-3个柱体积，再用甲醇-乙腈-水(35 : 40 : 25)洗脱2-3个柱体积，再用甲醇-乙腈-水(30 : 40 : 30)洗脱2-3个柱体积，最后用甲醇-乙腈-水(30 : 30 : 40)洗脱6-8个柱体积。
11. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，洗脱时用异丙醇水(70 : 30)洗脱2-3个柱体积，再用异丙醇水(60 : 40)洗脱2-3个柱体积，再用异丙醇水(50 : 50)洗脱2-3个柱体积，然再用异丙醇水(40 : 60)洗脱2-3个柱体积，最后用异丙醇水(35 : 65)洗脱6-8个柱体积。
12. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。
13. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)重结晶时在浓縮后的萃取液中缓慢加入环己烷至有少量晶体析出，然后将溶液置于1 l(TC继续析晶。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫司的精制方法，特别涉及通过反相高效液相制备色谱精制他克莫司的方法。本发明以他克莫司粗品作为原料，经过有机溶剂溶解，用C18反相制备液相色谱法实现他克莫司和子囊霉素、二氢他克莫司的分离纯化。本发明的精制方法采用合适的洗脱体系，稳定性好，在制备色谱条件下，杂质可实现完全分离，一次上样量可高达200mg，得到的他克莫司用HPLC检测纯度达98.5％以上，整个精制过程操作简单，通用性好，易推广，可以进行工业化生产。
文档编号C07D498/18GK101712685SQ200910146378
公开日2010年5月26日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者刘忠 申请人:鲁南制药集团股份有限公司