专利名称：：针对抗原表位-抗体可变区的结构信息设计蛋白类药物的方法
技术领域：
：本发明涉及针对抗原表位-抗体可变区的结构信息设计蛋白类药物的方法。具体而言，本发明通过在计算机上构建抗原和抗体可变区的理论构象，在此基础上建立抗原表位一抗体可变区复合物的理论构象，并通过实验验证该表位，根据该抗原表位的结构特征以及抗体可变区结构信息设计新的蛋白类药物分子。本发明中使用的抗原实例是肿瘤坏死因子(TNFcO，抗体实例是从杂交瘤细胞中筛选获得的抗TNFa单克隆抗体Z12，利用这一对抗原抗体相互作用区域的构象及结构信息，借助计算机辅助设计的方法，获得替代抗体Z12的蛋白类分子。
背景技术：
：由于蛋白质类药物制备难度大，需要更多的分子生物学技术、手段，同时由于难以释放、吸收，在用药过程中只能通过注射的方式进行。蛋白质类药物分子量大、柔韧性大，存在多个不同的结合表位，在治疗的同时可能会激活其它致病基因而产生意想不到的副作用。抗体类药物作为近年来发展迅猛的蛋白药物，已引起人们的广泛关注。然而，鼠源抗体引发的"人抗鼠抗体(HAMA)"反应限制了其临床应用；人鼠嵌合抗体在长期给药的过程中可以引发人抗嵌合抗体(HACA)反应；利用人-人杂交瘤技术制备的单克隆抗体尽管能克服了上述鼠源抗体及嵌合抗体的缺点，但是人单抗的制备存在产量低、不稳定、亲和力低等问题，以致于不能达到相应的治疗目的。更为重要的是，在治疗类风湿关节炎(RA)等疾病时，一次剂量需要l-10mg/kg抗TNF抗体或16mg/n^可溶性受体，疗程需持续几个月至半年以上。由于用药量大，蛋白质类药物的副作用就更加明显。EFintanWalton(精通广泛生物
技术领域：
的专家)曾指出，"从重组蛋白获得具有轰动性的药物的机会是十分有限的"。蛋白质难于制备，难于释放，并且容易产生副作用，而小分子药物具有专一性，能够以片剂、胶囊形式存在，使得小分子药物替代蛋白分子成为当前分子设计、合理药物设计的热点，MoffatAS于1993年即提出"回到小分子化合物合成时代(Goingbacktotheftiturewithsmallsyntheticcompounds)，，。近年来发展迅猛的计算机辅助药物设计，无论是理论、技术，还是相关的方法都具备了相当雄厚的基础，并有效地服务于实验，为新药设计和合成提供依据、理论思路，同时也縮短了新药的研发周期。结合计算机药物辅助设计方法，无疑将加速具有特定靶向的先导化合物的研发，大大提高新药研制的成功率。利用计算机辅助药物设计方法获得候选化合物进入临床研究的成功小分子药物很多，如HoffmannLaRoche公司利用凝血酶的晶体结构模型，优化候选化合物在酶催化中心的疏水区域结构，设计、获得凝血酶抑制剂Ro46-6240，现已进入抗凝血的临床实验；Merck研究室综合运用碳酸酐酶(CA)的晶体结构和量子化学构象分析，确定己知CA抑制剂与CA结合的活性构象，在此基础上进行结构改造获得Trusopt(MK-507),现在已作为治疗青光眼疾病的药物上市。目前，国际上基于蛋白质空间构象设计小分子化合物取得较大的进展，然而利用抗原一抗体复合物模型设计抗体模拟物才刚刚开始。TakahashiM等借助抗原结合抗体高变区(CDR)位点，利用计算机辅助设计获得了卟啉结合肽，经实验验证具有生物学功能；利用二维1H核磁共振技术揭示12肽与卟啉结合的构象特征，利用计算机辅助设计、构建更短肽段一9肽，并最终获得成功。国内近年来也开展了基于大分子结构设计小分子药物，并在理论模型、计算方法上取得了一定的进展，与国际上在该方面的研究接轨。然而基于抗原一抗体作用复合物，针对抗原表位一抗体高变区CDR作用模式设计小分子药物却尚未开展。hTNF-a是由单核细胞与巨噬细胞产生的具有多功能的细胞因子，能够杀伤或抑制肿瘤细胞，具有提高中性粒细胞吞噬能力等重要的生物学活性。但是，近年来随着对hTNF-a生物学活性研究的深入，发现各种原因引发的感染性休克、炎症、自身免疫性疾病均表现为TNF表达水平过高，大量的研究结果表明，TNF-(x参与诸如脓毒症、感染、自身免疫疾病、移植物排斥、移植物抗宿主病等多种人类疾病。因此，关于hTNF-a拮抗物及其机理的研究逐步深入，尤其是抗TNF抗体对动物模型的效应研究和临床研究更是方兴未艾。由于hTNF-oc在人体免疫紊乱中的有害作用，目前已着手设计治疗策略以抑制或抵消hTNF-a的活性。其中，国内外正在开展的寻找中和hTNF-a的抗体、可溶性TNF受体作为抑制hTNF-a活性的手段具有更广泛的发展前景。近年来，抗hTNF-a抗体、可溶性TNF受体己获得FDA批准，并用于治疗RA、节段性回肠炎。相对于早期的治疗药物(如DMARD)，获得FDA批准的抗hTNF-a抗体、可溶性TNF受体具有更优的治疗效果，耐受性、临床缓解作用更佳。大量的分子生物学实验表明，不论是中和抗体，还是可溶性hTNF-a受体，只要能够阻断TNF活性，对上述疾病就有一定的治疗作用。该发明选择TNF-a作为研究对象，结合本实验室近十年来在TNF抗体方面的分子生物学研究成果，有针对性地通过计算机辅助设计方法构建抗体与hTNF-a作用的复合物模型；通过分子生物学实验，结合理论模拟确定的结构数据修正研究，进而利用同源模建、分子对接理论设计修饰复合物模型；结合分子动力学方法动态模拟复合物作用构象的变化，确定抗体结合的抗原表位空间构象特征；通过全新药物设计的方法合理设计TNF抗体模拟肽。
发明内容本发明的基于抗原一抗体作用的立体结构信息设计新型药物分子的方法，包括以下步骤(1)基于抗原和抗体的一级结构序列，构建抗原和抗体可变区的理论构象；(2)根据抗原和抗体可变区的理论构象，构建抗原一抗体复合物的理论构象；(3)识别抗原中结合抗体的表位；(4)实验验证抗原中结合抗体的表位；(5)根据上述表位的序列，设计能够影响其与抗体结合的分子。本发明采用以结构生物学、分子生物学、生物信息学相结合的方法，以TNF-a为实例，理论与实验相结合确定抗体Z12特异性识别的TNF-a抗原表位。针对从杂交瘤细胞筛选获得的具有中和活性的抗体Z12，结合TNF-a晶体结构，利用同源模建、分子对接的方法获得抗原一抗体作用的复合物理论模型。通过计算机图形学技术，借助分子间氢键形成理论、反应自由能理论、泛德华作用及静电作用从理论上初步确定抗体Z12特异性识别TNF-a抗原表位的空间结构。利用分子生物学技术，设计TNF-a缺失突变体，通过ELISA、Western-Blot等生物学手段进行检测，从而从实验中确定理论预测结果的可靠性。本发明通过上述方法证实理论预测的正确性，并确定Z12抗体识别TNF-(x抗原表位的位置。本发明借助确定的Z12特异性识别TNF-a的表位结构及物理化学性质特征，利用计算机辅助分子设计原理，从理论上设计能够模拟抗体Z12的短肽。利用生物学手段，对短肽进行生物学评价。本发明通过上述策略获得了对抗原(TNF-a)—抗体(Z12)的特异性结合具有显著抑制作用的Z12拮抗肽。本发明的方法可参见所附流程图(图7)。图1.1抗体Z12的RT-PCR扩增产物。其中M:DL2000;l:Fd片断基因；2:k链基因。图1.2含Fd和k链基因的重组子Z12的酶切鉴定。其中M:DL2000;l:pGEM-TEasy(Fd)/^/zoI+5^I;2:pGEM-TEasy(k)/iSacI+^YZal。图1.3Fd段测序结果。图1.4抗体Z12的k链测序结果。图2.1利用x|/、w及主链C原子旋光性C对抗体Z12重、轻链的二级结构进行预测结果。图2.2利用Ramachandran图对构建的重、轻链可变区空间结构进行合理性检测。图2.3利用分子对接，借助分子力学、分子动力学模拟获得的抗体Z12重、轻链相互作用的复合物稳定空间构象。图中绿色部分代表抗体重链框架区(FR)，红色部分代表抗体轻链框架区(FR)，紫色、橘红色、淡兰色分别代表重链CDR1、CDR2、CDR3,黄色、深兰色、灰色分别代表轻链CDR1、CDR2、CDR3。图3.1分子力场下的TNF-cx三维构象。红、绿、紫色飘带分别代表TNF-a三联体的每条单链，球体代表分子生物学实验中获得的TNF-cx突变点。图3.2抗体Z12可变区基因CDR区表观静电分布。抗体Z12可变区基因CDR区表观静电分布(蓝色代表正电区，红色代表负电区，白色代表非电区)图3.3理论模拟获得的TNF-ot与Z12作用的稳定空间构象。理论模拟获得的TNF-a与Z12作用的稳定空间构象(黄色、红色、灰色分别代表TNF的三联体模式；绿色、紫色代表抗体Z12可变区基因的FR，其中绿色代表轻链，紫色代表重链；橘红、浅蓝代表抗体Z12可变区基因的CDR，其中橘红色代表轻链，淡蓝色代表重链)图4.1TNF-a与Z12作用复合物关键部位的确定。TNF-a与Z12作用复合物关键部位的确定(黄色线图代表抗体Z12，绿色线图代表TNF-a;球状物代表作用区域，紫色球代表抗体CDR，绿色球代表TNF-a的141-146)。图4.2参与结合Z12的TNF-a识别区域模式图。图4.3hTNF-a的大肠杆菌偏性密码表及其对应的氨基酸序列(SEQIDNO:28禾卩SEQIDNO:29)。图5.1pUTNF92-157重组质粒构建示意图。图5.2pUTNFD53-91重组质粒构建示意图。图5.3pGEX-2T与不同hTNF-a缺失体基因重组示意图。①插入的外源基因为hTNF-a或hTNF92-157或hTNFD53-91或hTNFD29-88的编码基因；②插入的外源基因为hTNFl-91编码基因。图5.4重组质粒的酶切鉴定。(A)pUTNF92-157;(B)pUTNFD53-91;(C)pUTNFD29画88;1:重组质粒pUTNF92-157;2:pUTNF92-157/&oNI;3:pUTNF國a/I;4:pUTNF92-157/历"cll;5:pUTNF-a////"cII;6:pUTNF92-157////"dill;7:pUTNF-a////"dlII;8:pUTNFD53-91/7VcoI+///"dIII9:pUTNFD29-88/7VcoI+///"dill;10:pUTNF-a/肠I+倫亂图5.5PCR扩增hTNF-a及其缺失体基因。M:DL20001:PCRproductsofhTNF92画157(254bp)2:PCRproductsofhTNFD29画88(347bp)3:PCRproductsofhTNFD53國91(410bp)4:PCRproductsofhTNF-a(527bp)。图5.6重组质粒的酶切鉴定。M:DL20001:pGTNF92-157/￡coRI+&慮I2:pGTNFD29-88/jEcoRl+B，Hl3:pGTNFt)53-91/￡coRl+5amHl4:pGTNF-a/￡coRI十S鍾HI图5.7pGTNFl-91重组质粒的构建与鉴定。Ml:DL2000;M2:人DNA/历"d1111:hTNF國a/5awHI+///肌1101产物；2:hTNF-aPCR产物；3:pGEX-2T/SamHII;4，5:pGTNFl-91/5amHI+￡coRI。图5.8hTNF-a缺失体基因测序图。图5.9经IPTG诱导表达的融9合蛋白的电泳分析。(A)M:蛋白质分子量标记;2:GST/hTNF92-157(33kDa);4:GST/hTNFD53陽91(39kD);(B)M:蛋白质分子量标记;2:GST/hTNF92國157(33kDa);GST(26kDa);GST/hTNFD29-88(37kDa);GST/hTNF-a(43kDa)GST(26kDa);GST/hTNFl-91(37kDa);4:GST/hTNF-a(43kDa)。图5.10Z12抗体的亲和层析纯化。(A)洗脱图谱(B)蛋白电泳分析。图5.11融合蛋白的电转移及与Z12抗体作用的Western-blot分析。(A):蛋白电泳及转移(B):Western-blotM:蛋白质分子量标记；1:GST(26kDa);2:GST/hTNF92-157(33kDa);3:GST/hTNFD29國88(37kDa);4:GST/hTNFD53-91(39kD);5:GST/hTNF-a(43kD)。图5.12融合蛋白的电转移及与Z12抗体作用的Western-blot分析。(A):蛋白电泳及转移(B):Western-blotM:蛋白质分子量标记；1:GST(26kDa);2:GST/hTNF92-157(33kDa);3:GST/hTNFl画91(37kDa);4:GST/hTNF-a(43kDa)。图5.13Z12抗体与hTNF-ctN端和C端片段作用关系的ELISA检测。图5.14—步反向PCR法构建hTNF-a缺失体示意图。图5.15PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。M:XDNA-HindIII片段；1:引物1PCR扩增；2:引物2PCR扩增。图5.16重组质粒的酶切鉴定。1:pUTNF-a////"cn+///"dIII;2:pUTNFD141-146////"cII+倫孤；3:pUTNF-a/脸oI十幼."cII;4:pUTNFD29-36/脸oI十飾cll。图5.17hTNF-a缺失蛋白表达的蛋白电泳分析。1,2:hTNF-a(17kDa);3，4:hTNFD141陽146(16kDa);5,6:hTNFD29-36(16kDa);7,8:pUC18。图5.18hTNF-(x及其缺失体对L929细胞的毒性检测。图5.19Z12抗体与hTNF-a缺失体相互作用的ELISA分析。图6.1计算机辅助设计短肽与(TNF)3相互作用的复合物模型。图7基于抗原一抗体作用空间结构信息进行新型药物分子设计的流程图。具体实施方式包括以下7个部分1、TNF-a功能抗体Z12可变区基因的获取2、抗体Z12可变区基因序列空间构象的模拟3、抗体Z12可变区基因与TNF-a作用复合物的获得4、抗体Z12可变区基因识别TNF-a抗原表位的确定5、利用分子生物学实验对理论结果的验证6、计算机辅助设计新型药物分子7、竞争结合实验及其它功能试验1、抗TNF-a功能抗体Z12可变区基因的获取1.1材料PCR产物克隆载体pGEM-TEasy购自Promega公司，克隆菌株JM109由本室冻存。1.2杂交瘤细胞总RNA的提取及cDNA的合成复苏杂交瘤(Z12)细胞，长成单层后，将其轻轻吹下，置于15ml试管中，在低速离心机上1000r/min离心10min，用生理盐水洗涤两次。加4ml生理盐水重悬细胞，分装于灭菌Ep管中。离心弃上清，加入lmlTRIzolReagent溶液(Gibco公司)，使细胞裂解混匀，室温静置15-20min。每管加入0.2ml氯仿，振荡混匀，室温静置10min。4°C12000r/min离心10min，小心吸取上层水相(含有细胞总RNA)置于另一灭菌Ep管中，加入0.5ml异丙醇混匀后室温静置lOmin。4°C12000r/min离心lOmin，弃上清，沉淀用lml75Q/。无水乙醇洗两遍。让沉淀在室温自然干燥(切勿抽干)，用20^1无RNAase的灭菌去离子水重悬RNA沉淀，置于冰浴立即用于cDNA的合成。取约l-5吗细胞总RNA，加入随机引物0.5吗，200jiMdNTP，5x反转录酶反应缓冲液4)al，用水补足使体积达18|_il。将以上混合液于水浴中煮沸5min，并立即置于冰浴中冷却，加入5UAMV反转录酶(Promega公司)。为防止RNA酶污染引起的RNA降解，在反应体系中加入RNAii酶抑制剂Rnasin10-20U。将以上反应体系混匀，42。C延伸lh后，于水浴中煮沸10min，离心待用。1.3PCR扩增抗体Fd和k链基因取上述合成的cDNA产物4)al作为模板，取用鼠抗体Fd和K链基因的上下游引物各luM，dNTP200uM，10xTaqbuffer5^1，lUTaq酶，用水补足至50^d。PCR扩增条件为95°C5min;94。Clmin，53°Clmin，72。Clmin30个循环；72°C10min。扩增用鼠抗体重链Fd段基因的5'端混合引物(共8条)序列如下5'—ACTCCCAGCTCGAGCTG(T)GTGC(G)AGTCA(T)GG—3'(SEQIDNO:1)其中含有内切酶^zoI的识别序列(划线部分)。扩增用鼠抗体重链Fd段基因的3'端引物序列如下5'—AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT—3'(SEQIDNO:2)其中含有内切酶5^el的识别序列(划线部分)。扩增用鼠抗体TC链基因的5'端混合引物(共7条)序列如下5'—CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT—3'(SEQIDNO:3)5'—CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC—3'(SEQIDNO:4)5'—CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA—3'(SEQIDNO:5)5'陽-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA—3'(SEQIDNO:6)5'—CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA—3'(SEQIDNO:7)5'陽陽CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA—3'(SEQIDNO:8)5'—CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA—3'(SEQIDNO:9)其中含有内切酶S"d的识别序列(划线部分)。扩增用鼠抗体k链基因的3'端引物序列如下5'—GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA—3'(SEQIDNO:10)其中含有内切酶^al的识别序列(划线部分)。1.4PCR产物的回收/纯化使用北京鼎国生物公司的DNA片段快速纯化/回收试剂盒，按其产品说明书进行。1.5Fd和K链基因的克隆与序列测定将Fd和k链基因分别连入pGEM-TEasy载体，连接反应体系如下回收纯化的PCR扩增产物3pl，pGEM-TEasy载体l(il，T4DNA连接酶lpl，2xT4DNA连接酶buffer5|il。将反应溶液混匀，瞬时离心，室温放置2h，便可用于转化。将连接反应产物10^1，转化于大肠杆菌JM109中，涂板，37。C培养16-20h。挑取单克隆菌落，置4mlAmp+LB培养基中37'C培养过夜。提取菌液质粒。分别用^zoI+S/^I和&cl+^al双酶切重组质粒，鉴定切出的片段大小正确后，将菌液送上海博亚生物公司测序。1.6抗体重、轻链可变区及CDR区序列的确定登录美国国立生物信息中心(NCBI)的BLAST(基本局部对比搜索工具，BasicLocalAlignmentSearchTool)序列检索网站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，由剪贴板分别向文本框中粘贴Fd和k链测序基因，选择nr数据库(包括GenBank、EMBL和DDBJ所收录的所有非冗余序列，排除了EST、STS、GSS部分)，使用blastn程序进行序列相似性检索。査询序列相似性较高的基因(Query怖DNA序列文献，根据CHI和CL基因相对保守的特性，确定目的基因(Sbjct)CHI或CL编码区，然后查找目的基因头部5'端引物序列所在位置，两者之间的碱基序列基本就是编码可变区氨基酸的基因序列。可通过已知同源基因的DNA序列记录中的CDS(CodingSequence,编码序列)注释，确定起始氨基酸。将编码可变区基因序列翻译成氨基酸序列，以此序列为探针，在PDB数据库中检索，査询序列相似性较高的蛋白(Query)的结构特征，同时结合在Kabat免疫球蛋白氨基酸序列数据库中的手工检索结果，确定抗体的CDR区序列以及其它结构特征如二硫键。1.7RT-PCR扩增结果从分泌抗hTNF-a抗体的Z12杂交瘤细胞提取总RNA，经RT-PCR扩增，可得到700bp左右大小的条带(见图1.1)，与Fd和K链基因的大小一致。1.8含Fd和K链基因的重组子的酶切鉴定在Taq酶催化下，进行PCR扩增得到的产物带有poly(A)尾，利用此特点将扩增得到的抗体Fd和k链基因产物直接连入pGEM-TEasy载体中。连接子转化JM109，扩增培养，并提取质粒。由于用于扩增Fd和k链基因的上下游引物的5'端分别带有^wl和Spel(Fd)、5*^1和^al(K链)酶切位点，利用这两组酶分别切割相应的重组质粒，均切出约700bp大小的条带(见图1.2)，与PCR扩增产物的大小一致，证明为正确的重组子。1.9测序结果将经酶切鉴定正确的重组质粒送公司测序，测序报告见图1.3、1.4。具体的核苷酸序列见下面1.10节。1.10抗体重轻链可变区基因的确定将Fd测序序列通过NCBI的BLAST命令检索nr数据库，并进行同源性分析，检索程序为blastn，即核酸序列对核酸数据库的检索。检索出来的前100条基因均为鼠(MusMusculus)抗体(IgGl/antibody)重链可变区(heavychainvariableregion)或Fd区(VH+CHl)基因(mRNA)，序列相似性均在93%以上。査询其中一些己公开的DNA序列文献，以检索号为AB048527、gi号为13359422的核苷酸序列(SEQIDNO:11)为例，将该CDS中"C_region，，(murineantibodyheavychainCHIregion)指示的核苷酸序歹ij对应到目的基因中(见下页Fd测序基因中的斜体字母)，发现二者之间此部位序列完全一致。鉴于cm区比较保守，从而确定了目的基因的CHi编码区，在此之前的序列即是VH区编码序列。「1:AB048527.MusmusculusmRNA...[gi:13359422]LOCUSAB048527675bpmRNAlinear丽27-MAR-2002DEFINITIONMusmusculusmRNAforantibodyheavychainFdfragment'partialcds,clone:5G.ACCESSIONABCH8527VERSIONAB048527.1GI:13359422KEY丽DS.SO匿EMusmusculusORGANISMMusmusculusEukaryota;Metazoa;Chordata;Craniata;Vertebrata;Euteleostomi二Mammalia;Eutheria二Rodentia;Sciurognathi:Muridae,Murinae,Mus.Vregion1.,360/evidence=not—experimentalorimer——bind1.,30/note="syntheticoligonucleotideprimersequence"C—region361..>675/note="murineantibodyheavychainCHIregion"/evidence=not—experimentalprimer—bind553.■675/note="syntheticoligonucleotideprimersequence"BASECOUNT151a202c179gU3tORIGIN1g3ggtgC3gCtgctcgsggsgtctgggggaggctcagtgcagcctggasggtccctgasa61ctctcctgtgcagcctctggattcactttcagtaactatgccatggcctggattcgcceig121actccggagaagaggctggagtgggtcgccaccattagtagtggtggtagtt8CSCC83C181gtgtgasgggtcgattcaccatctecagag241tacctgcas3tgagC3gtctgaggtctgagcgtattactgtgC33g3Cgt301gagtatagttacgactstgct3tgg3CtgCtggggtcasggaacctcagtC3CCgtctcC361stctgtctatccactggccctgcccaaact42133ctccatggtgsccctgggatgcctggtcasgggctstttccctg3gccagtgacagtg481acctggaactctggstccctgtccsgcggtgtgcscaccttcceagctgtcctgcagtct541gacctctacsctctgagcagctcagtgactgtcccctccagcscctggcc601gtcacctgcaacgttgcccacceggccagcagcaccsaggaattgtgccc661agggattgtactsgt在测序基因头部搜索出5'端引物序列(引物通过PCR扩增，被直接连入pGEM-TEasy载体中)用阴影表示，黑框中字母代表5'端引物中的限制酶识别序列。结合同源基因CDS记录中的VH编码信息，确定VH起始核苷酸，从而确定VH编码区(用浪线表示)。Z12抗体Fd(VH+CHl)测序基因(594bp):15GOV(SEQIDNO:12)同样地，先确定K链CL编码区，然后确定编码可变区基因。Z12抗体k链(VL+CL)测序基因(593bp):CC(SEQIDNO:13)将编码可变区的核苷酸序列翻译成相应的氨基酸序列。抗hTNF-a单克隆抗体(Z12)重轻链可变区序列VHSequenceLength:360bp(SEQIDNO:14)120aa(SEQIDNO:15)1QELVEsGGGVKSG1546T卯16GSLKScAASGFAFN3091TG13531NYDMSwVRQTPERR45136GAGTGGGTCGCATACATTAATACTGGTGGTGGTTACACCTACTAT18046EWVAYINTGGGYTYY60181CCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCiCC22561PDTVKGRFTISRDNA75226AAGAATACCCTGTACC丁GCAGATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGAC27076KNTYQMSSRSED卯271ACAGCCATGTATTACTGTGCA'AGCGAAAGG'TAC,GACGGACTTTAC31591TAMYYCASERYDGY105316TATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCC360106YAMDYWGQGTSVTVS120(VHS叫uence3-9位碱基为A%oI识别序列CAGC'7U04GCTT)VLS叫uenceLength:339bp(SEQIDNO:16)113aa(SEQIDNO:17)1451ELQMTQsPSSAVSA1546卯16GEKVTMscKSSQSL3091:'A,AGTAGAACC:CGAAAGAACTAC'TTGGCTTGGTACCAG..CAGAAA13531NSRTRKNYAwYQQK45136G18046PGQSPKIYwAsTR60181GAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGA丁CTGGGACA22561ESGVPDRFTGsGsGT75226GATTTCACTCTCACCATCAGCGGTGTGCAG'樣CT'GAAGAC—GTA:GCA'27076DFTTISGVQAEDA9027.1:..GTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTTGGG"TGGACG.'FTCGGT31591VYYcKQSYNPWTFG105316GGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA339106GGTKLEIK113(VLS叫uence1-6位碱基为Sacl识别序列'G^GCrTC)1.11抗体重、轻链CDR区的确定根据Kabat分类方案，对钓取的Z12抗体可变区基因轻、重链的CDR区进行分析。2、抗体Z12可变区基因空间构象模拟利用www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST以及www.nih.gov/FASTA序列比较方法，通过蛋白质结构数据库(PDB)检索，获得序列相似性高于75%的抗体Z12可变区基因重链序列的同源模板蛋白(PDB注册号1AR1(83%)、1IGT(81%)、1HFN(78%)、1KFA(77%)、IOPG(76%)、1QKZ(76%)，括号内的百分数代表与Z12重链的序列相似性程度)以及序列相似性高于80。/。的抗体Z12可变区基因轻链序列的同源模板蛋白(PDB注册号1H3P(88%)、1A3R(84%)、1A5F(83%)、1AP2(830/。)、1SRS(82%)、1MCP(82%)、1IFH(81%))。利用序列分析结果，通过二面角(V、OD)的统计分析对抗体Z12重、轻链二级结构进行预测分析。图2.1给出了利用v、co及主链C原子旋光性；对抗体Z12重、轻链的二级结构进行预测的结果。借助图形工作站Octane2(R12000)，利用Insight11(2000)程序包的Homology模块，以上述具有晶体结构的抗体分子为模板，构建Z12抗体可变区重、轻链的三维构象。在CVFF、Gromos力场下，依次利用最陡下降(收敛步骤10,000步，收敛判据0.01KJ/mol)、共轭梯度(收敛步骤20,000步，收敛判据0.01KJ/mol)、牛顿力学(收敛步骤25,000步，收敛判据0.001KJ/mol)三种分子力学方法对获得的Z12重、轻链的初始构象进行优化。利用Ramachandran图对优化获得的抗体Z12重、轻链空间构象进行合理性检测，图2.2给出了检测结果。图中以颜色差异标注残基构象的合理性程度:由于甘氨酸(Gly)柔韧性大，没有侧链，脯氨酸(Pro)为转角氨基酸，在评价过程中不考虑上述两种氨基酸构象的合理性；图中红色区域代表构象匹配最佳区，深黄色区域代表残基构象允许区，土黄色区域代表残基构象尚可，白色区域代表残基构象为可能误差较大的区域。从图中可以看出，获得的预测结构是合理的重链可变区所有残基构象均模拟合适，轻链构象稍有缺陷，其中的7个残基构象不确定，然而整个构象还是趋于合理的。利用抗体可变区基因重、轻链作用模式，通过CDR区、表面结构特征，结合单链抗体ScFv结构特征，通过分子对接的方法获得了抗体重、轻链相互作用的复合物模型，在相关力场(CVFF、Gromos)下，通过分子力学、分子动力学常温模拟获得抗体Z12重、轻链相互作用的复合物稳定空间构象。图2.3给出了抗体Z12重、轻链相互作用的复合物结构。3、抗体Z12与TNF作用复合物空间构象的获得以TNF-a晶体结构(PDB号ltnf)为模板，选择与抗体模拟时相同的力场参数，构建理论的TNF-a结构。结合分子生物学突变实验，对TNF-a的实验突变点进行空间定位。图3.1给出了理论模拟获得的TNF-a空间构象。以模拟的TNF-a三维构象、Z12抗体可变区空间结构为模板，利用分子对接的方法从理论上模拟TNF-a与Z12抗体相互作用的复合物模型，在分子对接的过程中，考虑溶剂效应的影响。通过分析TNF-a突变点的空间定位、表观静电分布、可及性表面积等参数，考察抗体Z12可变区基因CDR区相关参数(图3.2)，通过动态模拟，以形成分子间氢键数目多、相互作用能低为评价标准，从理论上构建TNF-a与Z12相互作用的复合物结构。获得的初始复合物模型，选择CVFF/Gromos力场，依次经过最陡下降(收敛判据0.05KJ/mol,收敛步骤40，000步)、共轭梯度(收敛判据0.01KJ/mol，收敛步骤60，000步)、牛顿力学(收敛判据0.005KJ/mol，收敛步骤80，OOO步)进行构型能量最小化处理；在考虑溶剂效应的情况下，利用常温分子动力学优化的方法，对其进行模拟优化处理。图3.3给出了TNF-a与Z12抗体作用的复合物空间构象。4、抗体Z12可变区基因识别TNF-a抗原表位的确定利用分子间氢键理论对TNF-a与抗体Z12相互作用的复合物模型进行分析，表4.1列出了参与形成抗原一抗体作用复合物分子间氢键的给体(Donor)、受体(Acceptor)、距离(A)以及所成的角度。表中不同的背景颜色将抗体的CDR区进行了分类。抗体可变区基因重链CDR2、轻链CDR3参与同抗原TNF-a的作用；TNF-a的135-148位残基主要参与结合抗体重链CDR2，TNF-a的84-92位残基主要参与结合抗体轻链CDR3。为了进一步探讨TNF-a与抗体Z12的相互作用，通过反应自由能理19论对其作用能进行计算，结果列于表4.2中。其中VanderWaals能量由排斥能及色散能组成，静电能仅为VanderWaals能的一半，抗原TNF-a与抗体Z12的作用以疏水作用、极性作用及盐桥作用为主，结合表4.1可以看出，抗体重链CDR2与TNF-a的135-148位残基恰好以上述方式作用。进一步利用计算机图形学技术、距离几何学方法，从TNF-a与Z12作用复合物模型可以获得TNF-a与Z12作用的主要区域位于141-146。图4.1给出了TNF-a与Z12作用的模式图，图中的球状体为TNF-a与Z12作用的关键部位。针对TNF-a与Z12作用模式，通过亲疏水性对TNF-a参与作用的区域进行分析，图4.2给出了抗原TNF-a参与作用区域的分布模式。可以进一步确定，TNF-a的141-146位为Z12抗体特异性识别的重要区域。5、利用分子生物学实验对理论结果的验证首先通过缺失方法将hTNF-a分段表达，根据Western-blot和ELISA实验结果确定Z12抗体识别的hTNF-a片段。虽然用这种方法确定的抗原表位区域较大，但它可为进一步的表位研究工作提供有利的参考。5.1材料与方法5.1.1材料质粒pUTNF-a"1是由本实验室根据已发表的hTNF-a的氨基酸和核苷酸序列，用大肠杆菌偏性密码人工合成其全长CDNA(见表5.1)，再克隆到pUC18质粒载体上，将此重组子命名为pUTNF-a。克隆及表达宿主菌均为五.co//JM109或DH5a。以上质粒、菌株及载体均由本室冻存。融合表达载体pGEX-2T及菌株&co"BL21(DE3)由本室冻存，诱导表达的药物IPTG购自Sigma公司。工具酶限制性内切酶均购自BioLab公司。￡.co/z'Klenowpol购自TaKaRa公司。T4DNALigase购自Gibco公司。ELISA所用试剂包被液0.015mol/LPH9.6碳酸盐缓冲液(NaCO3:1.59g，NaHC03:2.93g，H20定容至1L)。封闭液10%牛血清蛋白。辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体(HRP-RAM)由本实验室制备并纯化。显色底物邻苯二胺(OPD)购自Sigma公司。终止液2mol/LH2S04。5.1.2基本实验操作质粒提取(1)碱裂解法，参照《分子克隆实验指南》第二版(第一章第三节)。(2)质粒快速提取试剂盒，博大公司产品，按说明书进行。质粒的酶切(1)单酶切质粒DNA25吗，10x酶切反应缓冲液2pl，限制性内切酶10U，灭菌去离子水补足至20pl。37°C温育13h。(2)双酶切质粒DNA25昭，10x酶切反应缓冲液2(il，两种限制酶各IOU，灭菌去离子水补足至20^d。37°C温育13h。应选两种酶均合适的缓冲液。在进行双酶切实验前，先行单酶切反应，琼脂糖凝胶电泳观察结果，确保两个酶在同一缓冲液中单独能将质粒消化完全。菌落PCR在对单菌落进行扩增、提取质粒做酶切鉴定之前，先行菌落PCR，挑取阳性克隆再进行酶切鉴定，可减少酶切实验的盲目性。使用200|a1无菌吸头挑取分散良好的单克隆菌落，将其置于1.5ml微量离心管中，加入50(al无菌的去离子水，用旋涡振荡器充分混匀。取5pl混合液用于25plPCR反应，其余置于4r冰箱保存。反应体系菌混合液5gl1、、,日a去她《.H2014，}混合，煮沸5醒dNTP(2.5mM)2^1引物(50uM)各0.5^110XTaqbuffer2.5Taq(5U/ul)0.21总体积25uL一旦电泳结果显示为可疑的阳性菌落，将剩余的菌液于3ml含Amp的LB培养基中振荡培养过夜，然后提取质粒DNA进行酶切鉴定。DNA片段的回收/纯化使用北京鼎国生物公司的DNA片段快速纯化/回收试剂盒，按其产品说明书进行。3'凹端的补平反应3'凹端产物(载体大片段)0.51吗，10x幻enowbuffer2[xl，五.co//Klenowpol1^1(5U)，dNTP(2.5mmol/L)lpl，灭菌去离子水补足至20|il。37°C，反应30min。7(TC5min或在反应液中加入lpl0.5mol/L的EDTA溶液，以灭活Klenow，终止反应。连接反应(1)分子内连接具有双平滑末端的大分子DNA6|il(约50-100ng)，5xT4连接酶buffer3[il，T4连接酶1^1(IOU)，灭菌水5pl。室温连接2h或更长时间。(2)分子间连接:载体3^iK约30-60ng)，DNA片段5pl(约60-120ng)，5xT4连接酶buffer3^1，T4连接酶(IOU)，灭菌水3pl。室温连接2h或更长时间。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞，参照《分子克隆实验指南》第二版(第一章第五节)。将盛有感受态细胞的冻存管先放入冰中，置4'C冰箱中过夜，之后再置-7(TC液氮中保存，可产生高频转化效率。转化时，lOO)al感受态细胞中加入质粒0.5jal或加入DNA连接产物8^1。蛋白电泳、转移及Western-blot参照《分子克隆实验指南》(第二版)相关章节。电转移所用仪器为'Bio-RadPowerPAC200'。5.1.3hTNF-a缺失体及C端片段基因的克隆hTNF92-157(只保留hTNF-aC端92-157位氨基酸)基因的克隆在pUTNF-a质粒中，起始密码ATG位置处有A^I酶切位点，平端切割酶///"ell的识别部位恰好在编码hTNF-a第92位氨基酸的密码子之前(见图5.1)。用上述两个酶共同消化pUTNF-a质粒，回收的大片段只保留了hTNF-a92-157位氨基酸的编码基因。利用Klenowpol将I切割产生的3'凹端补平，恰好获得起始码ATG。在T4DNALigase的催化下，两平端首尾连接，使ATG后面接上hTNF-a92-157位氨基酸的编码基因，将其重组质粒命名为pUTNF92-157(见图5.1)。hTNFD53-91(缺失hTNF-a中间53-91位氨基酸)基因的克隆其原理及操作过程与上述pUTNF92-157重组子基本一致。用￡coNI和///"cll双酶切pUTNF-a质粒，五.co/z'Klenowpol补平￡coNI消化后产生的3，凹端，进行分子内连接，从而去除hTNF-a53-91位氨基酸的编码基因。将此重组质粒命名为pUTNFD53-91(见图5.2)。hTNFD29-88(缺失hTNF-a中间29-88位氨基酸)基因的克隆应用一步反向PCR方法构建hTNFD29-88基因与pUC18的重组质粒，将其命名为pUTNFD29-88。操作步骤及原理示意图参见第二部分二、1.8节。对以上重组质粒进行酶切鉴定及测序。5.1.4pGEX画2T与hTNF画a、hTNF92画157、hTNFD53國91和hTNFD29-88融合重组子的构建hTNF-a在pUC18载体上无需诱导便可获得高表达，而上述缺失体即使在诱导的条件下也不能表达。因此，将缺失体基因重组到pGEX-2T融合表达载体上，获得缺失蛋白的表达。在hTNF-a及上述缺失体与pUC18重组的质粒中，编码基因的起始码之前、终止码之后的序列完全一致，因此参照起始码和终止码附近的序列，设计一对引物，同时扩增hTNF-a及其缺失体基因。引物序列如下上游引物5，一CGCGGATCCGAGGAAAAAACCATG—3，(SEQIDNO:18，划线部分为5amHI酶切位点)。下游引物5，_CCGGAATTCAAGCTTGGCTGCAGT—3，(SEQIDNO:19，划线部分为五coRI酶切位点)。取质粒0.2|11，上下游引物各l一，dNTP200pM，10xPyrobestbuffer5|al，lUPyrobest，用水补足至50pl。PCR扩增条件为:95°C5min;94°C45s，52°C45s，72°C45s，30个循环；72°C5min。回收的PCR产物经&mHI和&oRl双酶切，与经同样处理的pGEX-2T载体连接，从而将外源基因连在GST编码基因的尾部(见图5.3中①)。重组质粒分别命名为pGTNF-a、pGTNF92-157、pGTNFD53-91禾口pGTNFD29-88。5.1.5pGEX-2T与hTNFl-91(只保留hTNF-aN端1-91位氨基酸)融合重组子的构建平端切割酶///"cII的识别位点恰好在编码hTNF-a第91位氨基酸的碱基末端，而pGEX-2T载体的多克隆位点中也有另一平端切割酶I的识别位点，用SawHI和/Z/"cI1同时切割扩增hTNF-a全长基因的PCR产物，与经5"mHl和Swal处理过的载体片段进行平-粘端连接，从而构建pGEX-2T/hTNFl-91重组质粒(见图5.3中②)，将其命名为pGTNFl-91。5.1.6融合蛋白的诱导表达将上述重组子转化Kco//DH5a宿主菌，提取的质粒经酶切鉴定及测序正确后，转化五,co/!'BL21(DE3)宿主菌，用转化pGEX-2T空载体的菌株作对照，在lmmol/L的IPTG诱导下进行小量表达实验，并用12%的SDS-PAGE检测表达情况。挑选表达量最高的菌株进行大量表达。将菌体培养至A6。(T0.30.6时，用终浓度为lmmol/LIPTG于37t:诱导4h，8000r/min离心10min收获菌体，超声破碎后，8000r/min离心30min，收集上清，采用紫外吸收法定量蛋白质，按以下公式计算蛋白含量(mg/ml):(1.45xA28(r0,74xA^)x稀释倍数。5.1.7抗hTNF-a单抗Z12的制备与纯化将稳定分泌抗hTNF-a单抗Z12(属IgGl亚类)的杂交瘤细胞扩大培养后，接种于BLAB/c小鼠腹腔，一周后收集腹水，间隔2-3天待腹水积聚后再次抽取。用0.45pm孔径的微孔膜过滤腹水，除去较大的固体颗粒、纤维蛋白凝块及脂肪滴。然后，12000r/min离心15min，除去细胞残渣以及小颗粒物质，收集上清，备用。取经上述预处理的小鼠腹水Xml，加等量生理盐水稀释，冰浴下，滴加饱和硫酸铵2Xml使达50%饱和度，边滴加边搅拌。将溶液置4°C2h以上。室温平衡后，3000r/min离心30min，弃上清，沉淀用2Xml生理盐水溶解，逐滴加入饱和硫酸铵Xml，边滴加边搅拌，使达33%饱和度，置4'C2h以上。室温平衡后，离心处理，沉淀用少量PBS溶解，此种盐析后所得物质即为IgG粗提物。IgG粗提物对O.lmol/LPB(PH8.0)透析后，上样于ProteinA-SephoraseCL-4B亲和层析柱，用相同PB缓冲液洗脱杂蛋白后，用PH6.0的O.lmol/L柠檬酸缓冲液洗脱目的蛋白(IgGl)，收集该洗脱峰的流出液，并立即用10mmol/LPBPH8.0缓冲液中和并对其透析。浓縮纯化的样品。5.1.8Z12抗体识别hTNF-a缺失体的Western-blot分析hTNF-a缺失体蛋白经SDS-PAGE，电转移到硝酸纤维素滤膜上，剪下Marker,置氨基黑溶液中显色。将转印有蛋白的滤膜用5%脱脂奶粉封闭，4'C过夜。倒掉封闭液，用TBS-T充分洗涤滤膜3次，每次10min。24将滤膜放入比其稍大一些的塑料袋中，按每平方厘米0.1ml的量加入5pg/mL的Z12抗体溶液，用塑封机将袋口封闭，于室温平缓摇动lh。取出膜，用TBS-T洗涤，加入二抗(HRP-RAM)，于室温平缓摇动40min。立刻用清水洗去丽春红，使膜恢复到染色前的颜色，并进行封闭。TBS-T洗涤后，用DAB显色。5.1.9Z12抗体识别hTNF-a缺失体的ELISA分析(1)将抗原溶液用包被液稀释成不同浓度，96孔板上每孔加50pl，重复3个孔，用包被液做空白对照，湿盒中4"C过夜或37'C2h。倒掉板子中的反应液，在每一次加入下一步实验所用试剂前，用PBS-T充分洗涤，除去未吸附的抗原或抗体，尽可能降低非特异性反应。(2)每孔加200|1110%小牛血清(FCS，用PBS稀释)，进行封闭，37°Clh或4。C过夜。(3)加入纯化的Z12抗体(5吗/mL)，每孔50[al，37°Clh或4。C过夜。(4)加入HRP-RAM二抗，每孔50|^1，37。C或室温40min。(5)用OPD做底物显色，避光5-10min至反应孔变为黄色，并以空白对照孔不变色为准，立即用50(il2NH2SO4终止反应，此时反应孔变为橙红色。在490nm波长下测定A值。5.2结果5.2.1hTNF-a缺失体基因(pUC18)的酶切鉴定与表达构建正确的pUTNF92-157质粒，脸oI和历"cII酶切位点消失；在被去除的编码hTNF-a1-91位氨基酸的碱基序列中，含有￡coNI识别序列，因此￡coNI酶切位点也相应消失。分别用￡coNI和///加II切割pUTNF92-157，得到的产物将成质粒的条带形状。由于历mffll酶切位点依然存在，因此被其消化后，pUTNF92-157同pUTNF-a—样呈现一条线形条带(见图5.4A)。在pUTNF-a质粒中，编码基因的起始码之前和终止码之后分别有A^oI和///"dlll酶切位点，用它们同时消化可得到494bp的小片段。pUTNFD53-91和pUTNFD29-88重组子分别缺失39aa(117bp)和60aa(函p)，因此用7VcoI和历"din双酶切分别得到377bp(见图5.4B)和314bp(见图5.4C)的小片段。酶切结果均与预期的相符，证实获得了正确的重组子。测序结果表明，缺失体基因完全正确(图略)。将重组质粒分别转化五xo//JM109和DH5a感受态细胞，在无诱导或IPTG诱导的条件下，以上hTNF-a缺失基因在pUC18载体中均无表达(图略)。5.2.2融合重组子的构建与鉴定由于构建在pUC18载体上的hTNF-a缺失基因无法获得表达，因此将以上基因转移到pGEX-2T载体中，期望以融合方式获得表达。设计一对通用引物，同时扩增保存在pUC18载体上的hTNF-a、hTNF92-157、hTNFD53-91和hTNFD29-88基因(见图5.5)。利用限制性内切酶BamHI和&oRl，将以上基因插入到pGEX-2T载体中，并用这两个酶鉴定，1°/。琼脂糖电泳结果表明均切出了预期大小的片段(见图5.6)，获得了正确的重组子。按5丄5节所述方法构建pGTNFl-91重组质粒首先以5awHI和///"cII切割hTNF-a全长基因的扩增产物，切胶回收294bp的片段，与经S"wHI和5>"I切割并纯化的载体大片段进行平-粘端连接反应，转化Eco/z'JM109，挑取单菌落，扩增培养，提取质粒，以I和I双酶切鉴定，切出了297bp的小片段(图5.7)，证实获得了正确的重组子。对以上所有重组子进行测序，结果表明基因完全正确(图5.S)。5.2.3融合蛋白的诱导表达将5.1.3和5.1.4节中的融合重组子转化E.BL21(DE3)，以IPTG诱导表达，用适量的PBS悬浮离心后的菌体沉淀，反复冻融后进行超声破碎。12%SDS-PAGE结果表明，几种融合蛋白均获得了可溶性的高表达，且经IPTG诱导后4h，融合蛋白的表达量达到最大值，进一步延长诱导时间并不能提高表达效率。空载体经诱导，自身表达分子量在26kDa的谷胱苷肽S转移酶(GST)，而hTNF-a、hTNFD53-91、hTNFD29-88、hTNF92-157和hTNFl-91与GST融合的分子量分别为43、39、37、33和37kDa(见图5.9)。5.2.4Z12抗体的纯化ProteinA-SepharoseCL画4B干粉在0.1mol/LPB(PH8.0)中溶涨30min，然后装入层析柱中，用同样缓冲液平衡。PH为8.0时，A蛋白只与小鼠IgG结合，从而与其它类别的Ig和杂质分开。待杂蛋白峰回复到基线后，换用PH6.0的柠檬酸buffer洗脱，并收集此洗脱峰的流出液。在PH6.0时，IgGl首先被洗脱下来，从而与其它亚类(IgGh、IgG2b和IgG3)分开。此后用PH3.0洗脱条件，将所有吸附在A蛋白上的IgG类物质洗脱下来，使亲和层析柱获得再生，用于下一次纯化(见图5.10A)。收集液对50倍其体积的O.Olmol/LPB(PH8.0)透析1224h，其间换液23次。将样品冻干，取少量干粉，溶于适量PBS(PH7.0)中，在紫外分光光度计上测定OD28o值，按下面公式计算抗体溶液浓度(mg/ml):(OD280+1.4)x稀释倍数。取少量样品行腦SDS-PAGE，电泳结果显示，纯化的Z12抗体分子量在120150kDa，纯度在90%以上(见图5.10B)。此后所有使用Z12抗体的实验中，所用抗体试剂均为同一批次纯化的样品。5.2.5Z12抗体识别hTNF92陽157、hTNFD53-91和hTNFD29誦88的Western-blot分析融合蛋白经12%的SDS-PAGE，电转移(40V，恒压，65min)到硝酸纤维素滤膜上。用丽春红染膜，显色结果表明蛋白转移比较完全。剪下Marker,置氨基黑溶液中显色。立刻用清水洗去丽春红，使膜恢复到染色前的颜色，并进行封闭。按照Western-blot操作步骤，进行免疫印迹分析，最终用DAB显色。结果表明Z12抗体特异性识别含有hTNF-a、hTNF92-157、hTNFD53-91和hTNFD29-88的融合蛋白，而同空载体自身表达的GST无交叉反应(见图5.11)。这几个融合蛋白的共同部位是hTNF-a92-157区，提示Z12抗体识别的抗原决定簇位于hTNF-a92-157区中。5.2.6Z12抗体不识别hTNFl-91的Western-blot分析通过前面的工作，我们认为Z12抗体识别的抗原表位位于hTNF-aC端92-157区，反过来讲，若将hTNF-aN端1-91区单独表达，抗体应该是不识别的。Western-blot结果(图5.12)表明Z12抗体不识别GST与hTNFl-91组成的融合蛋白，从反面证实了上面的结论，即Z12抗体特异性识别hTNF-a92-157区。5.2.7Z12抗体与hTNF-aN端和C端片段作用关系的ELISA检测ELISA结果(图5.13)与前面Western-blot结果一致，证实Z12抗体识别hTNF-aC端92-157区，而不识别N端1-91区。5.3Z12抗体识别的抗原表位的确定27前面的实验研究使我们确定了Z12抗体识别的抗原区域位于hTNF-aC端92-157区。利用计算机模拟方法预测的抗体识别表位(hTNF-a141-146位氨基酸，SEQIDNO:30)恰好在此区域中，初步验证了预测结果的可靠性。利用反证法，即将hTNF-a141-146位氨基酸残基缺失掉，检测缺失蛋白与Z12抗体之间相互作用关系的变化，从而确定hTNF-a141-146部位是否是Z12抗体识别的抗原表位。5.3.1材料与方法5.3.1.1材料缺失蛋白的克隆、表达载体均为pUC18，宿主菌为￡.//〗]^109。工具酶限制性内切酶均购自BioLab公司。T4DNALigase购自Gibco公司。高保真DNA扩增酶PyrobestTM及其相关试剂购自TaKaRa公司。T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)和ATP购自TaKaRa公司。Z12抗体的制备与纯化参见5丄7节。HRP-RAM二抗由本实验室制备并保存。L929细胞由本室冻存。放射菌素D购自Fluka公司。其它试剂均为国产或进口分析纯。5.3.1.2寡核苷酸引物的分析与合成利用Goldkey软件分析设计好的引物，确保引物内无发夹结构，引物间无二聚体形成，引物与模板其它部位无特异性结合。之后，将引物序列送上海生工生物工程有限公司合成。引物1P5:5，一TCTGGTCAGGTTTACTTC—3，(SEQIDNO:20);引物1P3:5,—GTCAGGACGGTTGATTTC—3，(SEQIDNO:21)引物2P5:5,—CTGGCTAACGGTGTTGAA—3,(SEQIDNO:22)引物2P3:5，一CCACTGCAGCTGACCTTC—3，(SEQIDNO:23)引物1用来制造hTNF-a第141-146位缺失突变体(以下称hTNFD141-146，其重组质粒用pUTNFD141-146表示)扩增产物长度约2660bp;引物2用来制造hTNF第29-36位缺失突变体(以下称hTNFD29-36，其重组质粒用pUTNFD29-36表示)，扩增产物长度约2650bp。5.3.1.3PCR扩增反应体系模板0.1ug，上下游引物各lpmol/L，dNTPs200^imol/L，10xPyrobestbuffer5^1，Pyrobest1U，灭菌去离子水补足至50^1，力[]50ul石蜡油于反应液表面。反应条件95。C变性5min;94°Clmin，56°Clmin，72。C3min(按lkbDNA72。C延伸lmin计算)扩增35个循环；72°。延伸10min。5.3.1.4PCR扩增产物的回收/纯化使用北京鼎国生物公司的DNA快速纯化/回收试剂盒，按产品说明书进行。5.3.1.5PCR产物5，末端磷酸化回收纯化的PCR产物0.5吗，200mmol/LATP0.5(J，10xT4PNKbuffer2.5^1，T4PNK5U，灭菌去离子水补足至25|id。将反应液混匀，置37°C水浴中30min，之后68°C10min灭活T4PNK。5.3.1.6线性DNA的自身环化取经1.4步骤处理的PCR产物5|uL(约O,lpg)，T4DNALigase5xBuffer3W，T4DNALigaselpL(5U)，灭菌去离子水6fiL，使反应总体积为15pL。室温或4"C连接过夜。5.3.1.7DNA的转化、提取和酶切鉴定参照《分子克隆实验指南》相关章节。5.3.1.8hTNF-a缺失体重组质粒的构建与表达引物1、2分别以pUTNF-a环形质粒为模板，在Pyrobest催化下沿相反方向进行PCR扩增。回收纯化PCR产物，使其实现5'末端磷酸化，之后利用T4DNALigase使N端已行磷酸化的线性分子实现分子内连接(见图5.14)。转化E.co//JM109感受态细胞，作菌落PCR初步筛选可疑菌。扩增培养，提取质粒后酶切鉴定，测序。将酶切及测序正确的质粒重新转化、涂板，挑单克隆在Amp抗性的LB培养基中37'C培养过夜，用转化pUTNF-(x质粒的菌株作阳性对照，用转化pUC18空载体的菌株作阴性对照。离心收获的菌体沉淀，用适量PBS溶液悬浮，超声破碎，离心收获上清，采用紫外吸收法定量上清中蛋白29含量(mg/ml):(1.45xA28o-0.74xA26Q)x稀释倍数。5.3.1.9hTNF-a及其缺失体生物活性的测定复苏L929细胞，待其长满单层后，用0.025%胰酶消化，重悬细胞于RPMI-1640培养液中，调细胞浓度为3xl0V孔，接种到细胞培养板中，每孔80pl。分别向每个孔中加入10W放射菌素D(终浓度为2pg/ml)和10^1待测样品(含有hTNF-a、hTNFD141-146和hTNFD29-36的超声上清液)，设4个样品浓度1、0.1、0.01禾n0.001mg/ml，并设3个复孔。同时设只加放射菌素D而不加样品的阳性对照，和只加L929细胞而不加放射菌素D和样品的阴性对照。将培养板置5c/。C02孵箱内37t:培养24h，倒掉混合培养液，并用PBS-T洗涤。每孔中加入lOpl0.5%结晶紫，室温染色10min后用蒸馏水轻轻洗净细胞外结晶紫。常温干燥后，每孔加入100pl33%醋酸，待细胞完全融解后，用自动读数酶联仪测定570nm下吸光度A值。用细胞毒百分率表示样品活性，计算公式(l-b/a)xioo%，ab分别为对照组和实验组的光密度值。5.3.1.10Z12抗体与缺失蛋白相互作用的ELISA检测ELISA操作步骤参见5.2.1.9节。5.3.2结果5.3.2.1hTNF-a缺失体重组质粒的构建首先，用稀释的引物溶液以pUTNF-a环形质粒为模板进行PCR扩增，反应体系和反应条件如材料和方法中所述。0.8%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增产物的大小与预期的2660bp和2650bp相符(见图5.15)。切胶回收PCR产物，行N端磷酸化，连接，从而完成重组质粒的构建。5.3.2.2hTNF-a缺失体重组质粒的酶切鉴定限制酶WcoI、历miIII、历wcll的酶切位点分别在编码hTNF-a的起始密码前一位、终止密码后15位和第91位氨基酸残基末端。pUTNF-a质粒经历"dIII和历"cll的联合消化，会切下一条216bp的小片段；hTNFD141-146缺失6个氨基酸(18bp)，因此其重组体经此两酶切产生的小片段大小应为198bp。同样，pUTNF-a禾BpUTNFD29-36质粒经iVcoI//7///"cl1的联合消化，分别会被切下大小分别为277和253bp的小片段。酶切反应的结果与预期的相符，见图5.16。将酶切验证正确的重组质粒送上海博亚公司测序，结果完全正确(图略)。5.3.2.3hTNF-a缺失体重组子在大肠杆菌中的表达将测序正确的重组质粒重新转化E.co//JM109，挑取的单菌落在LB培养基中37。C振摇过夜，离心收获的沉淀用PBS(菌培养液1/10体积)悬浮，超声破碎后，离心收获上清，取少量样品行18%SDS-PAGE，考马斯亮兰染色(图5.17)。5.3.2.4hTNF-a缺失体的生物学活性分析L929细胞悬液调成3xl04/ml，接种到96孔板，每孔80ul。hTNF-a及其缺失体按一定比例稀释后每孔10ul与放射菌素D(0.1ug/3xl04)共同加入。37。C5。/。C02孵箱培养24小时，0.5%结晶紫染色，测570nmOD值。按公式(l-b/a)><100%计算细胞毒性，a、b分别为对照组和实验组的光密度值。用hTNF-a标准品检验系统的灵敏度和准确度，绘制标准曲线，表明结果可靠。以hTNF-a上清液的细胞毒性作基数(100%)，hTNFD141-146、hTNFD29-36的相对细胞毒性分别为23.47%和17.80%(平均值，见图5.18)，说明这两个缺失体的生物活性均明显降低，表明141-146和29-36区是hTNF-a的活性部位，为其发挥生物学作用所必须。5.3.2.5Z12抗体与缺失蛋白相互作用的ELISA检测将含有hTNF-a、hTNFD141-146和hTNFD29-36的超声上清，用包被液稀释成IOO、50、10、lpg/ml等4个不同浓度进行包被。根据预实验所作的抗体识别抗原的饱和曲线图，当hTNF-a超声上清浓度在10010(ag/ml时，纯化的Z12抗体与抗原反应的最佳浓度为210pg/ml，因此以5pg/ml的抗体浓度进行ELISA检测。结果表明Z12抗体识别完整hTNF-a及其29-36位缺失体的能力基本相同，而识别141-146位缺失体的能力与前两者相比几乎丧失。证明hTNF-a141-146部位是Z12抗体识别的抗原表位(见图5.19)。6、计算机辅助设计新型药物分子根据获得的抗体(Z12)与抗原(TNF-a)相互作用的复合物构象，结合实验确定的与理论模拟相同的结论，利用计算机辅助设计的方法设计获得以下三条短肽(PT3:INYTGEPTYSQSVSNVVWY(SEQIDNO:24);PT4:YTYYPTVNENRSQSVSNVF(SEQIDNO:25);PT6:YINTGYDGLYYNSMD(SEQIDNO:26))。模拟肽设计过程模拟抗体Z12识别的TNF-a表位141-146(实验及理论模型均提示该区域为抗原参与结合抗体的重要结构域)，设计的多肽满足相应的柔韧性及易折叠的特征，同时为满足其疏水性质，引入相应的疏水残基；为保证其静电性及相应极性，引入相关的亲水性残基。为进行对比，针对作用模式设计无关肽PT1(GGYTYYTHSNV，SEQIDNO:27)。依据从头搭建的方法，对四条短肽进行结构模拟。选择CVFF/Gromos力场，依次经最陡下降(收敛判据0.01KJ/mo1，收敛步骤5000步)、共轭梯度(收敛判据0.005KJ/mo1，收敛步骤5000步)、牛顿力学(收敛判据0.001KJ/mol，收敛步骤8000步)，对短肽进行分子力学的构象优化，获得稳定构象。进而利用分子动力学方法进行动态模拟，确定常温稳定构象。选择前面构建的TNF-(x理论模型，利用分子对接的方法搭建短肽PT3、PT4、PT6与TNF-a相互作用的复合物模型。结果提示，其中前两条PT3、PT4具有如图6.1(a)所示的构象特征，第三条PT6具有如图6.1(b)所示的结构特征。7、竞争结合实验7.1肽合成对设计获得的PT1、PT3、PT4、PT6等4条多肽分子进行合成，全部由美国GenenmedSynthesis,Inc合成纯化，四条肽的纯度分别为99.90/o、99.90/0、81.4%、92.8%。7.2ELISA竞争结合实验本专利应用EILSA竞争结合实验方法，对以上所设计与合成的短肽是否可与抗TNF-a抗体竞争结合TNF-a分子进行了验证。方法100^1TNF-a/孔(终浓度2pg/ml)包被％微孔板，4"C过夜或37"C孵育2小时。PBS-T洗板3-4遍，200^1/孔4%酪蛋白封闭，37'C孵育30分钟；PBS-T洗板3-4遍，用甲酰胺溶解肽后，再用PBS分别稀释肽和Z12-HRP(辣根酶标记的小鼠抗人TNF-a单克隆抗体)，取100pl的肽(终浓度分别为0.047、0.236、1.180、4.720mmol/L)和Z12-HRP(终浓度为1:600)加入每孔，4。C孵育过夜。PBS-T洗板3-4遍，OPD底物显色，2NH2S04终止反应，490nm波长下测定OD值。32结合率计算公式-结合率(%)=，."Xl00实验组肽+Z12-HRP;对照组Z12-HRPPT3、PT4、PT6随剂量的增加，与Z12抗体竞争结合TNF-a的作用明显增强(表3)，而作为无关对照肽的PT1随剂量增加未显示出与Z12抗体竞争结合TNF-a作用，结果提示以上所设计的三条短肽均具有与Z12抗体特异性竞争结合TNF-a的作用。7.3中和TNF-a生物活性分析应用中和细胞毒性实验方法分析PT3、PT4、PT6对hTNF-a所介导生物活性的作用。取L929细胞(3xl0V孔)接种到96孔培养板，同时加或不加TNF-al0'2昭/3xl0V孔与放射菌素D0.1pg/3xl04/L，分别不加或加入不同稀释度的短肽，37°C、5%(302培养24小时，0.5%结晶紫染色，测570nmOD值。TNF-a中和活性计算公式(1)TNF-a对细胞增殖的抑制率计算抑制率(。/。)=(1—，，⑧)x100实验组细胞+TNF-a+放线菌素D;对照组细胞+放线菌素D(2)肽对TNF-cc对细胞增殖抑制作用的中和效率计算TNF-禱效率(%)=(1—gl^l)x圃实验组抑制率细胞+TNF-a+放线菌素D+肽；对照组抑制率细胞+TNF-a+放线菌素D;表4结果提示PT3、PT4、PT6对TNF-a介导的细胞毒性分别显示出不同的剂量中和效应，PT3、PT4中和TNF-a介导的细胞毒性的效率明显优于PT6。EILSA竞争实验和TNF-a中和实验的结果证实了本专利中根据抗体所识别的TNF-a表位所设计的短肽具有生物活性。表1TNF-a与Z12复合物分子间氢键给体(Donor)、受体(Acceptor)、距离(A)及形成角度(°)DonorZWZ12VH—VL:Asn30:HD22(TNF)3:GluBl46:HN(TNF)3:;heB144:HN(TNF)3:AlaB145:HN(TNF)3:ThrA79:HGl(l'NF)3:AsnA137:HD21(TNF)3:ArgA138:HH12(TNF)3:Ar多A138:NE2rei2冊jrft細载襄:i)2:'ZfZl2衡VU鹰g6ll鹏:，'(TNF)3:TyrB115:HH(TNF)3:LysB65:HZ2(TNF)3:GnB21:HE21(TNF)3:ArgB32:HH11(TNF)3:SerB147:HG(TNF)3:GliA88:HNZWZ12VHVL:ALal07:HN(TNF)3:ThrA89:HGl(TNF)3:G]nA88:HE22ZWZ12冊J/L'丄ys36B:HZlZWZ12冊一VL:Lys36B:股2(TNF)3:〖ysA90:HN(TNF)3:GluA135:HE2Z界Zl2翔二札:fan996:Hfe22:考ZfZl2VH—VL:咏ulO郎:細|(TNF)3:AsnA92:llD21Acceptor(TNF)3:GlnB21:()El(TNF)3:GlnB149:0El(TNF)3:AlaB145:NZ拳复札:由5SiQ.,Z緣i2Vft—VL:Glk5、0':''|,旭譜牆.:力细:彌%(TNF)3:GluA135:OEl(TNF〉3:.UeA136:0鄉,ji^ipll介、'MZ旦效lm:As齒2(TNF)3:ArgA138:NE(TNF)3:TyrB115:0H^衡龟VL:A、物&:NE','參靖參k"歌l驗拳纖？d巻，，Z勸满JC';倫li;關lZWZ12VH.VL:Tyrl01:0HZWZ12VH.VI,:Tyrl05:0(TNF)3:GlriA88:0ZWZ12VH,VI.,:G]n27B:OElZWZ12VH—VL:Lys36B:0(TNF)3:yrA87:0(TNF)3:ValA85:0(TNF)3:GlnA88:0ElZ襟l2#—VL:Asn據fe|由1.(TNF)3:ThrA89:N(TNF)3:LysA90:0DistanceAngle、l(2.35167.812.3159.522.05139.512.38152.842.36122.192.05167.872.05167.412.36121.421.78167.292.14159.832.23130.952.89NA1.92174.362.98NA2.05159.382.05163.481.93170.231.97171.71.68165.562.19144.351.93173.83].68161.992.19158.692.25175.292153.871.89152.681."一.171.961.77142.922.48161.812.18145.041.98178.44<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表3合成短肽的ELISA竞争结合_hTNF-a与Z12抗体的结合率(％)短肽短肽浓度(mM)0.000.140.681.362.72PT1IOO土O118.6±20.3119.U14.2112.5±8.5川.7±13.9PT3IOO士O109.0±7.396.1±13.281,4±12.4*55.2±12.1**PT4卿士o卯.8±8.988.7±9.979.0±3.5*54.7±3.2**PT600±070.±17.3*59.5±15.3**54.3±20.5**37.8±9.1****:PO.01;*:P<0.05表4合成短肽对TNF-a介导细胞毒性的中和作用_中和效率(％)短肽短肽浓度(mM)00.621.252.505.0010.00PT107.99.19,112.042.4PT3012.97.416.7*17.387.9*PT4014.814.720.6*33.9*66.0*PT6017.310.87.133.2*28.3*:PO.0535参考文献DeleuranBW，etal.ArthRheum，1992，35:1170-1175MoellerA,etal.Cytokine,1990，2，162-169;Moeller等获得的美国专利52310224VasilliP,etal.A匪RevImmunol,1992，10,411-452[4]TraceyKJ,CeramiA,A匪RevMed,1994，45,491-503)[5]ElliottMJ，etal.Lancet,1994，344，1125-1127[6]BoyleP，etal.CellImmunol,1993,152,556-568[7]MoffatAS.Science,1993,260,910-912[8]HilpertK,etal.JMedChem,1994，37,3889-3896[9]GreerJ，etal.JMedChem,1994，37,1035-1039[10]TakahashiM,etal.BioorgMedChemLett,1998，8，2023-2026;TakahashiM,etal.Chemistry,2000，6，3196-320336序列表<110〉北京天广实生物技术股份有限公司中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所〈120〉针对抗原表位-抗体可变区的结构信息设计蛋白类药物的方法<130>CPCH0962117D<160>30<170>Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉28<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物<220><221>misc—feature<222>(17)..(17)<223>k是g或t<220〉<221>misc—feature<222〉(21).(21)〈223>s是c或g<220〉<221〉misc—feature<222>(26)..(26)<223〉w是a或t<400>1actcccagctcgagctkgtgsagtcwgg28<210〉2<211>30<212>画<213>人工序列<220〉〈223〉引物<400〉2aggcttactagtacaatccctgggcacaat30<210〉3<211〉32<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>3ccagttccgagctcgttgtgactcaggaatct32<210〉4〈211〉32<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223>引物〈400>4ccagttccgagctcgtgttgacgcagccgccc32<210>5<211>32<212>靈<213>人工序列<220><223>引物〈400〉5ccagttccgagctcgtgctcacccagtctcca32<210>6<211〉32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6ccagttccgagctccagatgacccagtctcca32<210〉7〈211〉32<212>腿<213>人工序列<220><223>引物<400〉7ccagatgtgagctcgtgatgacccagactcca32<210〉8<211>32<212>DNA<213>人工序列〈220>〈223〉引物<400〉8ccagatgtgagctcgtcatgacccagtctcca32<210〉9<211>32<212>腿<213〉人工序列39<220>〈223>引物〈400〉9ccagttccgagctcgtgatgacacagtctcca32<210>10<211〉34<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物〈400〉10gcgccgtctagaattaacactcattcctgttgaa34<210〉11<211〉675<212〉DNA<213〉小鼠(Musmusculus)<400〉11gaggtgcagctgctcgaggagtctgggggaggctcagtgcagcctgg肌ggtccctgaaa60ctctcctgtgcagcctctggattcactttcagtaactatgccatggcctggattcgccag120actccggagaagaggctggagtgggtcgccaccattagtagtggtggtagttacaccaac180tatccagacggtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgcccagaacaccctg240tacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccacgtattactgtgcaagacgt300gagtatagttacgactatgctatggactgctggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc360tcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaact420aactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtg480acctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtct540gacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagacc600gtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcacc肌ggtggacaagaaaattgtgccc660agggattgtactagt675<210>12<211>594<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223>Z12抗体Fd核苷酸序列〈220〉<221〉misc—feature<222>(594)..(594)<223>n是a、c、g或t<400>12gggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgattactcccag60ctcgagcttgtggagtctgggggaggcttagtgaagtctggagggtccctgaaactctcc120tgtgcagcctctggattcgctttcaataactatgacatgtcttgggttcgccagactccg180gagaggaggctggagtgggtcgcatacattaatactggtggtggttacacctactatcca240gacactgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaataccctgtacctg300cagatgagcagtctgaggtctgaagacacagccatgtattactgtgcaagcgaaaggtac360gacggactttactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca420gccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaac480tccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacc540tggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagcttgtctggcn594<210>13<211>59341<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223〉Z12抗体ic链核苷酸序列<220〉<221〉misc—feature<222>(568)..(568)〈223>n是a、c、g或t<400>13gtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgattccagttccgagctccag60atgacccagtctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcactatgagctgc120a犯tccagtcagagtctgctcaacagtagaacccgaaagaactecttggcttggtaccag180cagaaaccaggtcagtctcctaaactgctgatctactgggcatccactagggaatctggg240gtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcggt300gtgcaggctgaagacctagcagtttattactgcaagcaatcttataatcttccgtggacg360ttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatc420ttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaac480肌cttct3ccccaaagacatcaatgtcaagtgg肌gattgatggcagtgaacgaca肪at540ggcgtcctgaacagttgggetctggtcanggacaggcaaaagacagcacctacc593<210>14<211>360〈212〉腿<213〉人工序列<220><223>Z12重链可变区核苷酸序列<400〉14cagctcgagcttgtggagtctgggggaggcttagtgaagtctggagggtccctgaaactc60tcctgtgcagcctctggattcgctttcaataactatgacatgtcttgggttcgccagact120ccggagag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