专利名称：一种热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备方法，属于燕麦精深 加工技术领域。
背景技术：
冰结构蛋白是一类能吸附在冰晶上并抑制其他水分子与冰晶结合的高 效生物活性抗冻剂，可非依数性降低冰点、抑制冰晶生长和重结晶。冰结 构蛋白可改善冷冻食品、冷冻食材在快速冷冻解冻以及冻藏过程中的品质， 还用于保护在低温储藏的器官、组织和细胞等，具有很大的应用潜能和市 场价值。
目前对于冰结构蛋白的研究对象先后从极地鱼类、昆虫转到植物材料 上。研究显示过冬植物经低温驯化，可积累一定的冰结构蛋白，这些植物 冰结构蛋白具有较高的抑制冰晶重结晶的功能。在冷冻食品中，这些蛋白 的添加可保护食品不受冷冻对其结构的破坏，从而有利于延长货架期。燕 麦耐寒冷，适合在气温较低的寒冷地区生长，在燕麦蛋白中含有冰结构蛋 白，因而能够抵御外界的寒冷。但是要从植物中获得纯的植物冰结构蛋白， 是一个高成本的制作过程，因为从植物中提取的蛋白质含量本来就不高， 而要获得纯度高的冰结构蛋白还需要经过一个复杂的分离纯化过程。因此 直接应用冰结构蛋白提取液将会是一个不错的选择。通过一系列简单易行 的浓縮方法除掉一些不需要的杂质，同时增大蛋白质的浓度。将这样的提 取物直接应用到食品中，使用方便，价格便宜。但还是会存在一些问题， 比如提取物中所含的一些酶如脂肪酶、蛋白酶等，会对食品品质造成不好 的影响。
因而，就有必要寻求一种提取冰结构蛋白的方便易得的天然原料和途径， 同时消除脂肪酶、蛋白酶等的有害影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的存在的不足，提供一种热稳定性
的燕麦冰结构蛋白的制备方法，该制备方法简单方便，制备成本大大降低； 所制备的冰结构蛋白具有较好的热滞活性、抑制重结晶性和热稳定性，可 直接应用在冷冻食品中，安全方便。按照本发明提供的技术方案， 一种热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备 方法，以生燕麦全粉为原料，经低温驯化、可溶性蛋白的提取、热处理、 无水乙醇沉淀和真空冷冻干燥步骤制得热稳定性的燕麦冰结构蛋白，各步 骤详细如下
(1) 低温驯化将生燕麦全粉在低于ox:的低温环境下放置两周或两
周以上进行驯化；
(2) 可溶性蛋白的提取在低温驯化的生燕麦全粉中加入去离子水， 低温驯化的生燕麦全粉与去离子水混合重量比为1: 8~15,然后在100
300rpm的搅拌速度下均匀搅拌30 60min得到混合液，将混合液在3000 4000g的离心力下离心15 30min，收集上清液；
(3) 热处理将步骤(2)中收集的上清液倒入烧杯中，置于60 100 。C的热水中水浴加热10 15min，然后在3000 4000g的离心力下离心15 30min，收集上清液；
(4) 无水乙醇沉淀在步骤(3)收集的上清液中加入预冷至4。C以下 的低温无水乙醇，上清液与预冷低温无水乙醇混合体积比为1: 4 10，并 在低于4'C的温度条件下以100 300rpm的搅拌速度搅拌60 120min，然 后在温度为4°C、离心力为4000 10000g的条件下离心10 20min，收集 离心后的沉淀物；
(5) 真空冷冻干燥取步骤(4)中收集的沉淀物，在温度低于4'C的 条件下真空冷冻干燥40 60h，粉碎得到冻干粉，该冻干粉即为热稳定性的 燕麦冰结构蛋白。
作为本发明的进一步改进，所述预冷的无水乙醇是将无水乙醇放置在4 "C以下的环境中预冷。
本发明与现有技术相比，制备工艺简单方便，大大降低了制备冰结构蛋 白的成本；所制备的冰结构蛋白具有较好的热滞活性和抑制重结晶性，同时 具备热稳定性且不含脂肪酶、蛋白酶等热敏性酶，消除了酶的潜在危害；该 产品可直接或经进一步纯化间接用于冷冻食品中，安全方便；经SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳测定，其蛋白质分子量范围为40 12KDa，其中包括40、 33、 23、 20、 14KDa。
图1为本发明的制备工艺流程图。
图2为本发明制备的热稳定性的燕麦冰结构蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施例方式
下面结合具体附图和实施例对本发明做进一步描述，下述实施例都按 照图1所示的制备工艺流程图进行。
实施例l:本发明一种热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备方法，采用以 下工艺步骤-
(1) 低温驯化将生燕麦全粉在0"C的低温环境下放置两周进行低温
驯化；
(2) 可溶性蛋白的提取在低温驯化的生燕麦全粉中加入去离子水，
低温驯化的生燕麦全粉与去离子水混合重量比为1: 8，在100rpm的搅拌速 度下均匀搅拌30min得到混合液，将混合液在3000g的离心力下离心30min， 收集上清液；
(3) 热处理将步骤(2)中收集的上清液倒入烧杯中，置于60。C的 热水中水浴加热10min，然后在3000g的离心力下离心30min，收集上清液；
(4) 无水乙醇沉淀在步骤(3)收集的上清液中加入预冷低温无水 乙醇，上清液与预冷低温无水乙醇混合体积比为1: 4，预冷无水乙醇温度 为4'C，并在4"C下以100rpm的搅拌速度搅拌60min，然后在温度为4"C、 离心力为4000g的条件下离心20min，收集离心后的沉淀物；
(5) 真空冷冻干燥取步骤(4)中收集的沉淀物，在真空度为2 13Pa、 温度低于4'C的条件下真空冷冻干燥60h，然后粉碎成冻干粉，粉碎机转速 为800 1500rpm，该冻干粉即为热稳定性的燕麦冰结构蛋白。
上述制得的热稳定性的燕麦冰结构蛋白为米灰色或淡黄褐色粉末，具 有较好的溶解性，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，如图2所示，其中1 为低分子量标准蛋白条带，2为本发明制备的热稳定性的燕麦冰结构蛋白条 带，由该图可知，热稳定性的燕麦冰结构蛋白的分子量范围为40 12KDa, 其中包括40、 33、 23、 20、 14KDa。
实施例2:本发明一种热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备方法，采用以 下工艺步骤
(1) 低温驯化将生燕麦全粉在-20'C的低温环境下放置1个月进行低 温驯化；
(2) 可溶性蛋白的提取在步骤(1)中经低温驯化的生燕麦全粉中 加入去离子水，低温驯化的生燕麦全粉与去离子水混合重量比为1: 10，在200rpm的搅拌速度下均匀搅拌40min得到混合液，将混合液在3500g的离 心力下离心20min，收集上清液；
(3) 热处理将步骤(2)中收集的上清液倒入烧杯中，置于80'C的 热水中水浴加热12min，然后在3500g的离心力下离心20min，收集上清液；
(4) 无水乙醇沉淀在步骤(3)收集的上清液中加入低温无水乙醇， 上清液与低温无水乙醇混合体积比为1: 8,预冷无水乙醇温度为-10。C，并 在-l(TC下以200rpm的搅拌速度搅拌90min，然后在温度为4。C、离心力为 6000g的条件下离心15min，收集离心后的沉淀物；
(5) 真空冷冻干燥取步骤(4)中收集的沉淀物，在真空度为2 13Pa、 温度低于4'C的条件下真空冷冻干燥50h，然后粉碎得到冻干粉，粉碎机转 速为800 1500rpm，该冻干粉即为热稳定性的燕麦冰结构蛋白。
上述制得的热稳定性的燕麦冰结构蛋白为米灰色或淡黄褐色粉末，具 有较好的溶解性；经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其分子量范围为40 12KDa，其中包括40、 33、 23、 20、 14KDa。
实施例3:本发明一种热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备方法，采用以 下工艺步骤
(1) 低温驯化将生燕麦全粉在-4(TC的低温环境下放置3个月进行低 温驯化；
(2) 可溶性蛋白的提取在步骤(1)中经低温驯化的生燕麦全粉中 加入去离子水，低温驯化的生燕麦全粉与去离子水混合重量比为1: 15，在 300rpm的搅拌速度下均匀搅拌60min得到混合液，将混合液在4000g的离 心力下离心15min，收集上清液；
(3) 热处理将步骤(2)中收集的上清液倒入烧杯中，置于IO(TC的 热水中水浴加热15min，然后在4000g的离心力下离心15min，收集上清液；
(4) 无水乙醇沉淀在步骤(3)收集的上清液中加入预冷低温无水 乙醇，上清液与低温无水乙醇混合体积比为1: 8，无水乙醇温度为-2(TC， 并在-2(TC下以300rpm的搅拌速度搅拌120min，然后在温度为4。C、离心 力为10000g的条件下离心10min，收集离心后的沉淀物；
(5) 真空冷冻干燥取步骤(4)中收集的沉淀物，在真空度为2 13Pa、 温度低于4'C的条件下真空冷冻干燥60h，然后粉碎得到冻干粉，粉碎机转 速为800 1500rpm，该冻干粉即为热稳定性的燕麦冰结构蛋白。
上述制得的热稳定性的燕麦冰结构蛋白为米灰色或淡黄褐色粉末，具有较好的溶解性；经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其分子量范围为40 12KDa,其中包括40、 33、 23、 20、 14KDa。
本发明中，热稳定性的燕麦冰结构蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测方法详细如下
(a) 复溶取经冷冻干燥的热稳定性的燕麦冰结构蛋白1份，按质量 比加入2份的去离子水，使燕麦冰结构蛋白溶解，在4500g的离心力下离 心15min,去除未溶解的蛋白，收集上清液；
(b) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳取步骤(a)中收集的上清液40"L， 加入12.5uL样品缓冲溶液，在沸水中煮4min，然后在4000g的离心力下 离心10min，收集离心后的上清夜，取该上清液15uL,注入胶板中，将胶 板与电泳仪相连接，进行电泳实验，电泳前20min采用的电流为12mA，之 后增大至26mA，整个电泳过程时间为2.5h;
(c) 将步骤(b)中电泳结束后的胶板置于考马斯亮蓝中进行染色， 然后用10%冰醋酸溶液进行脱色处理至蛋白条带清晰为止；
(d) 绘制蛋白质谱带，计算出迁移率，并算出分子量。 本发明中的原料生燕麦全粉为市场购得；离心设备采用贝克曼公司制
造的型号为J-20XPI高速冷冻离心机；真空冷干燥设备采用德国CHRIST 公司制造的型号为ACPHA1-4自动压盖箱冻干机；电泳仪采用北京六一仪 器厂制造的型号为DYY-8的电泳仪；其他为常规设 。
权利要求
1、一种热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备方法，其特征是采用以下工艺步骤(1)低温驯化将生燕麦全粉在低于0℃的低温环境下放置两周或两周以上进行驯化；(2)可溶性蛋白的提取在低温驯化的生燕麦全粉中加入去离子水，低温驯化的生燕麦全粉与去离子水混合重量比为1∶8～15，然后在100～300rpm的搅拌速度下均匀搅拌30～60min得到混合液，将混合液在3000～4000g的离心力下离心15～30min，收集上清液；(3)热处理将步骤(2)中收集的上清液倒入烧杯中，置于60～100℃的热水中水浴加热10～15min，然后在3000～4000g的离心力下离心15～30min，收集上清液；(4)无水乙醇沉淀在步骤(3)收集的上清液中加入预冷至4℃以下的低温无水乙醇，上清液与预冷无水乙醇混合体积比为1∶4～10，并在低于4℃的温度条件下以100～300rpm的搅拌速度搅拌60～120min，然后在温度为4℃、离心力为4000～10000g的条件下离心10～20min，收集离心后的沉淀物；(5)真空冷冻干燥取步骤(4)中收集的沉淀物，在温度低于4℃的条件下真空冷冻干燥40～60h，然后粉碎得到冻干粉，该冻干粉即为热稳定性的燕麦冰结构蛋白。
2、 根据权利要求l所述的热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备方法，其 特征还在于所述预冷低温无水乙醇是将无水乙醇放置在4°C以下的环境中 预冷。
全文摘要
本发明涉及一种热稳定性的燕麦冰结构蛋白的制备方法，以生燕麦全粉为原料，经低温驯化、可溶性蛋白的提取、热处理、无水乙醇沉淀和真空冷冻干燥步骤制得热稳定性的燕麦冰结构蛋白。本发明的制备工艺简单方便，大大降低了制备冰结构蛋白的成本；所制备的冰结构蛋白具有较好的热滞活性和抑制重结晶性，同时具备热稳定性且不含脂肪酶、蛋白酶等热敏性酶，消除了酶的潜在危害；该产品可直接或经进一步纯化间接用于冷冻食品中，安全方便；经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其蛋白质分子量范围为40～12KDa，其中包括40、33、23、20、14KDa。
文档编号C07K14/415GK101619097SQ20091018363
公开日2010年1月6日 申请日期2009年7月31日 优先权日2009年7月31日
发明者凤 王, 黄卫宁 申请人:黄卫宁