专利名称：蛋白质活性多肽及其编码基因、表达载体、表达菌及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及一种蛋白质稳定与生物活性保护 多肽及其编码基因、重组表达载体、表达菌以及该蛋白质稳定与生物 活性保护多肽的应用。
背景技术：
在现代生物科学、化学和医学领域中，广泛使用具有生物活性的 各种蛋白质制剂。蛋白质制剂的存贮方式一般有液体和固体(干粉) 两种形式。第一种方式的蛋白质溶液由于在常温下容易变性，降低或 丧失生物活性，因此需要存放在低温环境中，但在存贮和运输过程中， 可能由于各种原因导致其脱离低温环境，造成蛋白质变性沉淀和生物 活性降低。第二种方式是将蛋白质制剂成干粉，存放常温下，但冷冻 干燥过程中的冷冻和干燥所导致的脱水过程可对蛋白质造成损伤变 性，导致生物活性降低。此外，在蛋白质溶液制剂的使用过程中，反 复冻融会显著降低蛋白质的生物活性。为了保持蛋白质的稳定性和保 护蛋白质的生物活性，蛋白质制剂中往往加入了各种保护剂，例如-在蛋白酶溶液中加入血清蛋白和甘油等保护剂，血清蛋白可以防止蛋 白酶发生由疏水相互作用引起的聚集和沉淀，甘油可以避免疏水作用 引起的蛋白酶聚集，保护蛋白酶的生物活性。在蛋白质冻干制剂中加 入了糖、多羟基化合物、血清蛋白、表面活性剂和氨基酸等各种保护剂，可与蛋白质表面的极性基团形成氨键，防止蛋白质在冷冻干燥过 程中失水后氢键直接暴露于周围环境中，减少蛋白质的损伤、变性和 聚集。 发明内容本发明的第一个目的在于提供一种蛋白质稳定与生物活性保护 多肽。本发明的第二个目的在于提供一种本发明的蛋白质稳定与生物 活性保护多肽的编码基因。本发明的第三个目的在于提供一种本发明的蛋白质稳定与生物 活性保护多肽的重组表达载体。本发明的第四个目的在于提供一种表达本发明的蛋白质稳定与 生物活性保护多肽的表达菌。本发明的第五个目的在于提供本发明的蛋白质稳定与生物活性 保护多肽的应用。本发明人注意到一段高度保守的22氨基酸序列和其同源序列 (一般具有1-9个氨基酸取代的同源序列)，多分布在植物胚蛋白中。 该22氨基酸序列和其同源序列主要由亲水性氨基酸组成。本发明人 推测该22氨基酸序列可防止高温、干燥或冰冻引起的脱水及反复冻 融对蛋白质的损伤和变性，保持蛋白质的稳定性和保护蛋白质的生物 活性。本发明人将此22氨基酸序列命名为"多肽ZYZ22"，并通过基 因工程方法表达和获得了含有2-12个多肽ZYZ22或其同源序列的多 肽，加入到蛋白质液体制剂和蛋白质固体制剂中，可有效提高蛋白质 在常温条件下的稳定性，防止蛋白质在冷冻干燥过程的变性和失活， 防止蛋白质在反复冻融过程中的失活，保护蛋白质的生物活性。本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，为如下(a)或(b) 或(C)所述的多肽(a) 由2-12个多肽ZYZ22或其同源序列首尾串联而成的多肽， 多肽ZYZ22之间由0-5个氨基酸连接起来；所述多肽ZYZ22为序列表 中SEQ ID NO. 1所述的氨基酸序列，其同源序列为具有卜9个氨基酸 取代的序列；(b) (a)所述的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加而成的具有蛋白质稳定与活性保护功能的由(a)衍 生的多肽；(c) 含(a)或(b)所述多肽且具有蛋白质稳定与活性保护功 能的多肽。所述多肽ZYZ22的氨基酸序列如下VNKMGEYKDYAAEKAKEGKDAT。 所述蛋白质稳定与生物活性保护具体为可防止高温、干燥、冷冻和反复冻融对蛋白质损伤、变性和生物活性丧失。为了使发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽便于纯化，本发明可在(a)或(b)或(c)所述多肽的氨基末端或羧基末端连接有Poly-His标签或GST标签。本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，较好的为序列表中 SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列，它是由2个多肽ZYZ22的同源序列 首尾串联组成的多肽，申请人将其命名为ZYZ22-2多肽；较好的还有 序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列，它是由6个多肽ZYZ22的 同源序列首尾串联组成的多肽，申请人将其命名为ZYZ22-6多肽；更 好的为序列表中SEQ ID NO. 4所述的氨基酸序列，它是由12个多肽 ZYZ22的同源序列首尾串联而成的多肽，申请人将其命名为ZYZ22-12本发明中的(c)所述多肽，较好的为序列表中SEQ ID N0.5所 述的ZYZ-L3多肽。本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽可人工合成，也可先合 成其编码基因，再进行生物表达得到。其中(b)所述多肽的编码基 因可通过将(a)所述多肽的编码基因中缺失一个或几个氨基酸残基 的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5' 端连上Poly-His标签或GST标签的编码序列得到。本发明的DNA序列，为如下(a)或(b)所述的DNA序列(a) 编码上述本发明的任一种蛋白质稳定与生物活性保护多肽 的DNA序列；(b) 在严格条件下可与(a)所述DNA序列杂交的DNA序列；所 述严格条件为在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后 用2XSSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。序列表中SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列，是编码ZYZ22-2多 肽的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO. 7所述的核苷酸序列，是编码 序列表中SEQ ID NO. 3所述ZYZ22-6多肽的核苷酸序列。序列表中 SEQ ID N0.8所述的核苷酸序列，是编码序列表中SEQ ID NO. 4所述 ZYZ22-12多肽的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO. 9所述的核苷酸 序列，是编码序列表中SEQ ID NO. 5所述ZYZ-L3多肽的核苷酸序列。本发明的重组表达载体，包含有上述本发明的任何一种DNA序 列。可用现有的原核表达载体构建重组表达载体。本发明的表达菌，包含有本发明的任何一种重组表达载体或本 发明的任何一种DNA序列。本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽的表达纯化方法，是 将重组表达载体转化表达菌例如大肠杆菌后，诱导表达，收集菌体， 细胞破碎，离心，亲和层析纯化，凝胶过滤。最终获得蛋白质稳定与 生物活性保护多肽。本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽可应用于蛋白质稳定 与蛋白质活性保护剂。实验证明，本发明蛋白质稳定与生物活性保护多肽作为蛋白质稳 定与蛋白质活性保护剂，加入蛋白质溶液后，可以防止或降低因高温、 冷冻、干燥或反复冻融所引起的蛋白质变性、聚集和沉淀，可以防止 或降低因高温、冷冻、干燥或反复冻融所引起的蛋白质生物活性丧失。例如序列表中SEQ ID NO. 2所述ZYZ22-2多肽加入乳酸脱氢酶溶液后，用液氮冷冻，再在25'C融化，反复多次，可防止乳酸脱氨酶因反复冻融过程引起的酶活性下降，对反复冻融过程中的蛋白质生物 活性具有明显的保护作用。序列表中SEQ ID NO. 2所述ZYZ22-2多肽与海藻糖加入乳酸脱氢酶溶液中，在高温(如63°C)条件下，可与 海藻糖发生协同作用，保护乳酸脱氢酶活性的作用效果高于单独的 ZYZ22-2多肽或海藻糖。本发明蛋白质稳定与生物活性保护多肽作为蛋白质稳定与活性 保护剂，可保持以液体形式存在的蛋白质在高温处理或反复冻融处理 下的稳定性，保护蛋白质的生物活性，对蛋白质制剂的应用具有重要
图1是原核表达载体pET-ZYZ22-2的物理图谱。 图2是纯化的ZYZ22-2多肽电泳图。图3是ZYZ22-2多肽对反复冻融条件下乳酸脱氢酶(LDH)活性 的保护作用结果图。图4是ZYZ22-2多肽与海藻糖对高温条件下乳酸脱氢酶(LDH) 活性的协同保护作用结果图。图5是ZYZ-22-6、 ZYZ-22-12、 ZYZ-L3多肽对反复冻融条件下 乳酸脱氢酶(LDH)活性的保护作用结果图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例一:多肽ZYZ22-2的原核表达载体和重组菌株的构建提取大豆白农6号(吉林省白城农业科学研究所提供)未成熟种 子的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据Genebank数据库中 检索到的大豆胚胎发育晚期丰富蛋白3组蛋白(LEA3)序列(Genebank 的序列号为M80664)设计引物如下5， _ ATGGCGTCCAAGAMCMGA _3，5' - TGCGTCTATATATACTMTA -3，。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1400bp的条带，与预期 结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收该片段。将该回 收片段与pGEM-T Easy (购自Promega公司)连接，参照Cohen等的 方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌 ToplO感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记 筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上 的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果 表明扩增到的大豆胚胎发育晚期丰富蛋白3组蛋白(LEA3)基因由200910190296.7 的重组质粒命名 为pGEM-LEA3。
利用EcoR I和Not I双酶切含LEA3基因的pGEM-LEA3质粒，并 连接至经同样双酶切的pET-28a ( + )载体，得重组载体，命名为 ZYZ-L3。转化至大肠杆菌BL21 Star中，获得BL21-ZYZ3菌株。
根据大豆胚胎发育晚期丰富蛋白3组蛋白中ZYZ22-2多肽的核苷 酸序列，即序列表中SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列设计引物 5， -GAATTCGGTTCCAAGGTCGGAGAG-3， 5' -AAGCTTTTAGGTCGTCTTCTTCGCTTC-3'。
以pGEM-LEA3为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行0. 8%琼脂 糖凝胶电泳检测，得到分子量约为140bp的条带，与预期结果相符。 用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收该片段。将该回收片段与 pET-28a ( + )载体连接，插入位点为EcoR I和HindIII，参照Cohen等 的方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌 Topl0感受态细胞，根据pET-28a ( + )载体上的卡那霉素抗性标记筛 选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的 T7启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明为大 豆胚胎发育晚期丰富蛋白3组基因(LEA3)中编码ZYZ22-2多肽的核苷 酸序列，其开放阅读框(0RF)为序列表中SEQ ID N0.6的自5'末端 第1至132位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID N0.2的第l至44位氨基酸。
将上述含有序列表中SEQ ID NO. 6所述脱氧核糖核苷酸序列的重 组质粒载体命名为pET-力Z^-么参见附图l。
将重组载体/^T-^Z^^转化入大肠杆菌BL21 STAR,获得重组菌株BL21/ZYZ22-2。
同样，设计如下引物，以ZYZ-L3质粒为模板进行PCR扩增 5 ， -CACCGAATTCTCTAGAGGTTCCAAGGTCGGAGAGTAC-3 ， 5' -GTCCAAGCTTCCTAGCACTAGTCCCCAACGTCGTATCTTT-3，。 重复上述琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收的过程，获得编码 ZYZ22-6多肽的核苷酸序列，并克隆至pET-28a ( + )载体，获得的质 粒命名为/^T-Z}Z^-《。其开放阅读框(0RF)为序列表中SEQ ID NO. 7 的自5'末端第1至429位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列 表中SEQ ID NO. 3的第1至143位氨基酸。
将编码ZYZ22-6多肽的核苷酸序列再次插入上面构建好的重组 载体/^7-^ZW-6中，片段酶切位点为Nhe I和HindIII，载体酶切位 点为Spe I和HindIII，获得可以表达ZYZ22-12多肽的重组载体，命名 为pi5T-ZrZ^-7么其开放阅读框(ORF)为序列表中SEQ ID NO. 8的自 5'末端第1至864位脱氧核糖核苷酸，编码的氨基酸序列是序列表 中SEQ ID NO. 4的多肽，即ZYZ22-12多肽。
实施例二多肽ZYZ22-2的表达
接种BL21/ZYZ22-2单克隆于少量培养基中，37。C培养至吸光度 值(OD,)为0. 8时，补加异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至0. 2mM， 37TH秀导4h， 4000g离心收集菌体，2X样品缓冲液重悬，IO(TC水浴 处理5min， 10000g离心IO分钟，取上清进行12% SDS-PAGE,染色， 观察结果。同实验对照组BL21/pET-28a比较，BL21/ZYZ22-2出现一 条特异的蛋白条带，与ZYZ22-2多肽预期分子量10kDa接近。实施例三多肽ZYZ20-2的纯化
接种BL21/ZYZ22-2单克隆于少量培养基中，37'C培养过夜；按 1: 100比例转入1000ml LB液体培养基，37匸培养至吸光度值(OD,) 为0.8，补加异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至0.2mM， 37tH秀导 4h， 4000g离心收集菌体，重悬于PBS中，冰浴超声破碎，4°C， 20000g 离心10分钟，收集上清，参照金属螯合亲和层析介质使用说明，使 用Chelating S印harose Fast Flow柱纯化融合蛋白，获得的初步纯 化蛋白用Superdex 30 PG预装柱进行凝胶过滤，收集目标蛋白，并 进行12% SDS-PAGE。结果表明在预期分子量处有一条特异条带，而 其余蛋白条带基本消失，获得了纯度较高的ZYZ22-2多肽，见附图2。
实施例四ZYZ22-2多肽对反复冻融条件下乳酸脱氢酶(LDH)活性 的保护作用
乳酸脱氢酶反应体系中，乳酸脱氢酶的浓度为62.5ng/ml。将不 同浓度的ZYZ22-2多肽与乳酸脱氢酶按照质量比为1: 10、 1: 5、 1:
1、 5: 1、 1: 10分别混合后，分成两组。 一组用于直接测定乳酸脱
氢酶的活性。另一组放入液氨中速冻1分钟，在25。C恒温混匀器上 完全融化，反复处理10次，测定乳酸脱氢酶的残留酶活性，分析 ZYZ22-2多肽对乳酸脱氢酶活性在反复冻融下的保护作用。以加入同 样量的血清蛋白BSA作为对照组。
结果表明，经过反复冻融后，没有加入保护剂的乳酸脱氢酶活性 几乎完全消失，酶活仅为处理前的1%左右。加入质量浓度比为1: 1 的ZYZ22-2多肽后，乳酸脱氢酶残留酶活升高，为处理前的11%。对 照组加入等比例BSA，可提高乳酸脱氢酶的残留酶活，但比ZYZ22-2多肽显著低，见附图3。实验表明ZYZ22-2多肽对反复冻融条件下乳 酸脱氢酶活性具有良好的保护作用。
实施例五ZYZ22-2多肽与海藻糖对高温条件下乳酸脱氢酶(LDH) 活性的协同保护作用
将不同量的ZYZ22-2多肽与62. 5ng/ml乳酸脱氢酶混合。使混合 后ZYZ22-2多肽与乳酸脱氢酶的质量比分别为0:1 、 1:5、 1:1和5:1 。 将混合液分成两组。 一组用于直接测定乳酸脱氢酶活性。另一组在 63。C恒温混匀器上保持5分钟后，测定乳酸脱氢酶活性，比较加入 ZYZ22-2多肽前后的乳酸脱氢酶活性，分析ZYZ22-2多肽对乳酸脱氢 酶在高温下的保护作用。以加入同样量的血清蛋白BSA作为对照组。
在以上实验体系中同时加入终浓度为250ng/ml的海藻糖，经过 上述同样过程处理后，测定乳酸脱氢酶的活性。
结果表明，乳酸脱氢酶在高温处理后，没有加入保护剂的乳酸脱 氢酶活性仅为16%。在加入的ZYZ22-2多肽和BSA质量相同时，乳酸 脱氢酶活性比较接近。实验体系中加入50mM海藻糖后，在加入同样 质量的ZYZ22-2多肽和BSA时，LDH酶活性明显高于单独添加ZYZ22-2 多肽和BSA。而且，在ZYZ22-2多肽、BSA蛋白与LDH酶的质量比例 为1:5、1:1和5:1时，添加ZYZ22-2多肽的乳酸脱氢酶活性高于BSA， 见附图4。实验结果表明ZYZ22-2多肽对高温下的乳酸脱氢酶活性具 有一定的保护作用，在与海藻糖同时存在的情况下，可发挥协同效应 作用提高对乳酸脱氢酶活性的保护作用。
对ZYZ22-12多肽同样进行了反复冻融处理实验，实验结果表明 在ZYZ22-12多肽与LDH酶的质量比为1: 1时，经过10次反复冻融
13处理后，LDH酶残留活性比ZYZ22-2多肽提高1倍多，表明ZYZ22-12多肽比ZYZ22-2多肽对LDH酶活性具有更强的保护作用，见附图5。根据实验结果及理论推测，其它串联数目的22氨基酸系列多肽对LDH酶均具有保护作用，并且随着22氨基酸串联数目的增加，在加入同样质量的系列多肽的条件下，对LDH酶的保护作用效果也相应提高。同样，对于含有22氨基酸序列的多肽，如SEQ ID NO. 5所述的ZYZ-L3多肽也进行了反复冻融处理实验。实验结果表明在ZYZ-L3多肽与LDH酶的质量比为l: l时，经过10次反复冻融处理后，LDH酶残留活性明显高于添加BSA的对照组。根据实验结果及理论推测，其他含有22氨基酸序列的多肽对LDH酶均具有保护作用。见附图5。序列表
〈110〉深圳大学
〈120〉蛋白质活性多肽及其编码基因、表达载体、表达菌及应用〈160〉 9
〈170〉 Patentln version 3. 1
<210> 1<211〉 22〈212〉 PRT
〈213〉 Glycine Max. L<400〉 1
Vai Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys15 10 15
Glu Gly Lys Asp Ala Thr20
〈210〉 2<211> 44<212〉 PRT
〈213〉 Glycine Max丄〈400〉 2
Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys15 10 15Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr A印Tyr
20 25Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu Ala Lys Lys Thr Thr35 40
30
<210〉 3〈211〉 143<212> PRT
〈213〉 Glycine Max. L〈400〉 3
Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr
15 10 15
Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met
20 25 30
Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser
50 55 60
Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly65 70 75 80
Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala
85 90 95
Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr100 105 110Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp
115 120 125
Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly
130 135 140
〈210〉 4〈211〉 288〈212〉 PRT〈213〉人工合成〈400〉 4
Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn1 5Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys20
Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr35
Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu
50 55Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg65 70Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala85
Thr Val Asn Lys Met Gly Glu100
17
Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr10 15
Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr25 30
40
Met
Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu
45
Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser60
Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly
75 80Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala
90 95Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr
105Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp115 120 125
Tyr Thr130Arg Ala145
Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys135
Asp Thr Thr Leu Gly Thr140
Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys150 155
Tyr Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu Thr Lys165 170
Val Gly Glu160
Asp Ala Thr175
Met Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys
180 185 190
Glu Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr195 200 205
Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp210 215
Ala Thr Val Asn Lys Met220
Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu225 230 235
Gly
Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala245 250
Lys Asp240Glu Lys255
Thr Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys
260 265 270
Asp Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly275 280 285〈211〉 463
<212> PRT
〈213〉 Glycine Max. L
〈400〉 5
Met Ala Ser Lys Lys Gin Glu Glu Arg Ala Glu Ala Ala Ala Lys Val1
5
10
15
Ala Ala Lys Glu Leu Glu Gin Val Asn Arg Glu Arg Arg Asp Arg Asp
20 25 30
Phe Gly Val Val Ala Glu Gin Gin Gin Gin His His Gin Glu Asp Gin
35 40 45
Gin Lys Arg Gly Val lie Gly Ser Met Phe Lys Ala Val Gin Asp Thr50 55 60
Tyr Glu Asn Ala Lys Glu Ala Val Val Gly Lys65 70 75
Lys Glu Ala Thr
Asn80
Asn Ala Tyr Ser Asn Thr Glu Val lie His Asp Val Asn lie Gin Pro
85 90 95
Asp Asp Val Ser Ala Thr Gly Glu Val Arg Asp lie Ser Ala Thr Lys
100 105 110
Thr His Asp lie Tyr Asp Ser Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr
115 120 125
Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr Ala Asp Tyr Ala Ser Gin Lys Ala Lys130 135 140Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr A印Tyr145 150 155 160
Ala Ser Gin Lys Ala Lys Glu Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly
165 170 175
Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp
180 185 190
Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys
195 200 205
Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys
210 215 220
Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn225 230 235 240
Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly
245 250 255
Lys Asp Thr Thr Leu Gly Lys Leu Gly Glu Leu Lys Asp Thr Ala Ser
260 265 270
Asp Ala Ala Lys Arg Ala Val Gly Tyr Leu Ser Gly Lys Lys Glu Glu275 280 285
Thr Lys290Gly Glu305
Glu Met Ala Ser Glu Thr Ala Glu Ala Thr Ala Asn Lys Ala295 300
Met Lys Glu Ala Thr Lys Lys Lys Thr Ala Glu Thr310 315
Ala Ala Lys Asn Lys Ala Gly Glu lie Lys Asp Arg Ala Ala325 330
Ala Glu320Glu Thr335Ala Glu Ala Ala Lys Asn Lys Thr Ala Glu Thr Ala Glu Val Thr Lys
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Glu Met Lys Asp Ala Ala Lys Asp Arg Thr Ala Glu
355 360 365
Thr Thr Asp Ala Ala Lys Gin Lys Thr Ala Gin Ala Lys Glu Asn Thr
370 375 380
Lys Glu Asn Val Ser Gly Ala Gly Glu Thr Ala Arg Arg Lys Met Glu 385 390 395 400
Glu Pro Lys Leu Gin Gly Lys Glu Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Asp Lys
405 410 415
Val Val Val Lys Val Glu Glu Ser Arg Pro Gly Ala lie Ala Glu Thr
420 425 430
Leu Lys Ala Ala Asp Gin lie Ala Gly Gin Thr Phe Asn Asp Val Gly
435 440 445
Arg Phe Asp Glu Glu Gly Val Val Asn Val Glu Arg Arg Lys Lys 450 455 460
〈210〉 6 〈211〉 132 〈212〉 DNA
〈213〉 Glycine Max丄 <400> 6
ggttccaagg tcggagagta cgcagattac gcttctcaga aggccaagga aacaaaagat 60 gcaacgatgg aaaaagctgg agagtacacg gattatgctt cgcagaaagc gaaggaagcg 120aagaagacga cc 132
〈210〉 7 <211〉 429 〈212〉 DNA
〈213〉 Glycine Max. L 〈400〉 7
gccEicggaca acaacaacaa caaaaccggt tccaaggtcg gagagtacgc agattacgct 60 tctcagsagg ccaaggaaac aaaagatgca acgatggaaa aagctggaga gtacacggat 120 tatgcttcgc agaaagcgaa ggaagcgaag aagacgacca tggagaaggg tggagaatac 副 aaggattact ctgcggagaa agctaaggag agaaaagatg ctactgtgaa taagatggga 240 gagtataagg actatgctgc ggagaaagcc aaagagggga aagatgctac tgtgaataaa 300 atgggagagt ataaggacta tgctgcggag aaaacgaaag aggggaaaga tgccactgtg 360 aataagatgg gagagtataa ggattacact gcggagaagg cgaaagaggg gaaagatacg 420 scgttgggg 429
〈210〉 8 〈211〉 864 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 8
gccacggaca acaacaacaa caaaaccggt tccaaggtcg gagagtacgc agattacgct 60 tctcagaagg ccaaggaaac aaaagatgca acgatggaaa aagctggaga gtacacggat 120 tatgcttcgc agaaagcgaa ggaagcgaag aagacgacca tggagaaggg tggagaatac 180aaggattact ctgcggagaa agctaaggag agaaaagatg ctactgtgaa taagatggga 40
gagtataagg actatgctgc ggagaaagcc aaagagggga aagatgctac tgtgaataaa 300
3tgggagagt ataaggacta tgctgcggag 3aaacgaaag aggggaaaga tgccactgtg 3G0
aat3ag3tgg gagagtataa^ ggatt已cact gcggag犯gg cgaaagaggg gaaagata^cg 420
acgttgggga ctagagccac ggacaaca^c aacaacaaaa ccggttccaa ggtcggagag 480
tacgcagatt acgcttctca gaaggccaag gaaacaaaag atgcaacgat ggaaaaagct 540
ggagagtaca cggattatgc ttcgcagaas gcgaaggaag cgaagaagac gaccatggag 600
aagggtggag犯tacaagga ttactctgcg gaga3agcta agg3gagaB3 agatgctact GGO
gtgaataaga tgggagagta taaggactat gctgcggaga犯gccaaaga ggggaaagat 720
gctactgtga ata^aatggg agagtstaag gactatgctg cggagaaaac g犯agagggg 780
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〈210〉 9 〈211〉 1389 〈212〉 腿
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gagcca卿c ttcaaggtaa卿agggtat gggggccgtg g卿c卿gt ggtggtgaaa l扁
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ggacagacct tcaacgatgt aggacgcttc gatgaagagg gtgtcgtcaa tgtggagcgc 1380
cgcaagaaa 1389
权利要求
1.一种蛋白质稳定与生物活性保护多肽，为如下(a)或(b)或(c)所述的多肽(a)由2-12个多肽ZYZ22或其同源序列首尾串联而成的多肽，多肽ZYZ22之间由0-5个氨基酸连接起来；所述多肽ZYZ22为序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，其同源序列为具有1-9个氨基酸取代的序列；(b)(a)所述的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白质稳定与活性保护功能的由(a)衍生的多肽；(c)含(a)或(b)所述多肽且具有蛋白质稳定与活性保护功能的多肽。
2. 根据权利要求1所述的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，其 特征在于为序列表中SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列。
3. 根据权利要求l所述的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，其 特征在于为序列表中SEQ ID N0.3所述的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，其 特征在于为序列表中SEQ ID N0.4所述的氨基酸序列。
5. 根据权利要求1所述的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，其 特征在于为序列表中SEQ ID N0.5所述的氨基酸序列。
6. —种DNA序列，为如下(a)或(b)所述的DNA序列(a)编码权利要求1所述蛋白质稳定与生物活性保护多肽的 DNA序列；(b)在严格条件下可与(a)所述DNA序列杂交的DNA序列； 所述严格条件为在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然 后用2XSSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
7. 根据权利要求6所述的DNA序列，其特征在于为序列表中 SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9所述的 核苷酸序列。
8. —种重组表达载体，包含有权利要求6所述的任何一种DNA 序列。
9. 一种表达菌，包含有权利要求8所述的任何一种重组表达载 体或权利要求6所述的任何一种DNA序列。
10. 权利要求1所述的蛋白质稳定与生物活性保护多肽在蛋白 质稳定与生物活性保护剂上的应用。
全文摘要
本发明为一种蛋白质活性多肽及其编码基因、表达载体、表达菌及应用。所述蛋白质活性多肽为(a)由2-12个多肽ZYZ22或其同源序列首尾串联而成的多肽；(b)上述多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而成的衍生多肽；(c)含上述任一多肽且具有蛋白质稳定与活性保护功能的多肽。所述DNA序列为(a)编码本发明蛋白质活性多肽的DNA序列；(b)在严格条件下可与(a)所述DNA序列杂交的DNA序列。所述重组表达载体包含有本发明的任何一种DNA序列。所述表达菌包含有本发明的任何一种重组表达载体或本发明任何一种DNA序列。本发明的多肽可保持蛋白质制剂的稳定性和生物活性，应用于蛋白质稳定与生物活性保护剂。
文档编号C07K14/415GK101665533SQ20091019029
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者郑易之 申请人:深圳大学