专利名称：一种从黑米中分离制备高纯度花色苷单体的方法
一种从黑米中分离制备高纯度花色苷单体的方法
技术领域：
本发明属于农产品深加工技术领域，涉及一种从黑米中分离制备高纯度花色苷单
体的方法。背景技术：
黑米(0ryza sativa L. indica)是有色特种稻中的一个重要类型，因其营养丰富，同时具有一定的保健功效，历来深受人们的喜爱，在我国及东亚地区其它国家有着悠久的种植和食用历史。目前，在我国黑米稻主要分布在云南、贵州、广东、广西、湖南和陕西等省。在黑米成熟过程中，种皮内会积聚大量花色苷类色素，从而使其糙米呈现出棕红色、紫红色、紫黑色乃至黑色等颜色。除了黑米，花色苷在其他深色谷薯、浆果和蔬菜中也有广泛分布。作为一种天然色素，花色苷安全无毒、资源丰富、色彩鲜艳且色质好。另外，已有的研究表明，花色苷还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节血脂和改善胰岛素抵抗等生物活性，是一种潜在的医药资源。 目前较常用的花色苷分离制备方法是溶剂浸提法，通常采用酸性醇溶液进行提取，得到的粗提物总花色苷含量多在10% 35%之间，往往含有较多的杂质，难于对其进行鉴定，也限制了花色苷的开发利用。目前有报道采用高效液相色谱(HPLC)或高速逆流色谱技术对粗提物进行纯化制备花色苷单体，但存在产量小、成本高等问题。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺点，本发明提供一种工艺过程简单、提取时间相对较
短、原料和设备成本低、易于大规模生产的采用酸性醇溶液浸提及中压液相色谱技术从黑
米中分离制备高纯度花色苷单体的方法。 本发明所采用的技术方案包含三个主要工艺步骤 (1)制备黑米皮取一定量的黑米糙米，用精米机磨取黑米外层5% -8%种皮得到黑米皮。 (2)制备黑米花色苷粗提浓縮液称取一定量黑米皮，用60%乙醇(含有O. 1%HC1)作为浸提剂，室温下浸提2次，每次4-6h ;浸提后经布氏漏斗过滤，旋转蒸发浓縮；将浓縮液合并后用石油醚萃取去脂，弃去萃取液上层脂质溶剂，下层的水溶液用大孔树脂吸附，待吸附结束，用0. 01 % HC1洗除杂质；用80%乙醇溶液将树脂柱上吸附的花色苷类物质洗脱下来，收集洗脱液于45t:下旋转蒸发至无乙醇得到花色苷提取浓縮液。
(3)利用中压液相色谱技术分离花色苷单体取一定量的花色苷提取浓縮液，上反相C18色谱柱，用0. 1%三氟乙酸水溶液和甲醇作为流动相，梯度洗脱，用紫外检测器检测洗出液，根据所得的色谱图分别收集黑米中不同的花色苷组分，将洗脱液旋转蒸发至无甲醇，冷冻干燥得到两种花色苷单体(纯度=95% )粉末。 所述的黑米要求成熟度较高，着色良好，其它性状达到大米国家标准(GB1354-2009) —级大米要求。
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所述化学试剂均为分析纯。 本发明的有益效果是在黑米皮乙醇浸提液脱脂试剂为石油醚，脱脂效果好，沸点 低，回收容易；黑米皮乙醇粗提物采用Amberlite XAD_7大孔树脂作为吸附材料，对花色苷 的选择性较好；中压液相色谱采用反相C18填料(粒径50iim)装柱，O. 1%三氟乙酸水溶液 和甲醇作为流动相，梯度洗脱，花色苷矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷出峰时 的甲醇浓度分别为33% -35%和38% _40%，将洗脱液旋转蒸发浓縮，冷冻干燥得到花色苷 单体粉末。 黑米糙米在磨去米皮后，能够去掉原有的粗涩感，改善食用口感和风味；纯化设备 采用中压制备液相色谱，而非高压液相色谱或高速逆流色谱，流动相为分析纯而非色谱纯， 设备要求低，流速高，上样量大；所用试剂乙醇、石油醚和甲醇均可回收利用，环保无污染， 同时可以大大降低生产成本，适合工业化生产。本发明具有工艺过程设计简单、提取时间 短、适合大规模生产等特点。
图1是本发明的工艺流程方框示意图。具体实施方式
下面结合附图和实施实例对本发明进一步说明 参见图l，一种从黑米中分离制备高纯度花色苷单体的方法，其工艺流程是
第一步是制备黑米皮选取一定量的优质黑米糙米，用精米机磨取黑米外层 5% _8%种皮得到黑米皮(即通常所说的米糠)，将黑米皮分装于塑料封口袋中，避光储存
于低温干燥处备用；磨去米皮的黑米为精制黑米，具有更好的口感，可真空包装另外上市销售。 第二步是获得黑米花色苷粗提浓縮液称取一定量黑米皮，以料/液比为1 : 10 的比例与60%乙醇(含有0. 1% HC1)混合。室温下浸提2次，每次4-6h，期间不定期搅动 以提高浸提效率；浸提后经布氏漏斗过滤，滤液于=42t:旋转蒸发至无乙醇为止；蒸发后 的浓縮液合并后用石油醚萃取去脂，弃去萃取液上层脂质溶剂，下层的水溶液合并后再次 过滤；将滤液通过预先用0. 01% HC1酸化过的大孔树脂(Amberlite XAD-7)吸附柱，流速 1-1. 5柱体积/h，待吸附结束，用0. 01% HC1洗除杂质；用80%乙醇溶液将树脂柱上吸附的 花色苷类物质洗脱下来，流速2-3柱体积/h，收集洗脱液于45t:下旋转蒸发至无乙醇得到 花色苷提取浓縮液，PH示差法测定提取液中总花色苷含量。 第三步是利用中压液相色谱技术分离花色苷单体反相C18填料(粒径50 ii m) 装柱，将色谱柱用6%甲醇压实；取一定量花色苷提取浓縮液，按照1% _3%的重量比(以 总花色苷计)上样，O. 1%三氟乙酸水溶液(A)和甲醇(B)作为流动相，在以下条件下进 行梯度洗脱，线形梯度为A中含有6% B(0-12min)， A中含有12% -25% B(13-24min) ， A 中含有25% -35% B(25-60min) ， A中含有35% -45% B(61-72min) ， A中含有95% -6% B(73-90min)，流速设定为30mL/min，6-8min —个柱体积；用紫外检测器(260nm检测波长， 280nm收集波长)检测洗出液，根据所得的色谱图分别收集黑米中两种主导花色苷组分， 即矢车菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin 3-0-P-glucoside， Cy-3-G)和芍药素-3-葡萄糖苷
4(peonidin 3-0-P -glucoside， Pn_3_G)，出峰时甲醇浓度分别为33% -35%和38% -40%， 将洗脱液于45t:下旋转蒸发至无甲醇，冷冻干燥得到花色苷单体粉末，可以利用高效液相 色谱_质谱联用技术准确定性，归一化法或标准品外标法测定纯度。 实施实例1 :称取黑米5kg，磨制米皮300g，与3L 60%乙醇(含有0. 1%HC1)混 合，室温下浸提2次，每次4-6h ;浸提后经布氏漏斗抽滤，滤液于=42t:旋转蒸发至无乙醇 为止；用石油醚脱脂，过滤后通过预先酸化的大孔树脂吸附柱，流速1-1. 5柱体积/h，待吸 附结束，用0. 01 % HC1洗除杂质；用80%乙醇溶液洗脱，流速2-3柱体积/h，收集洗脱液于 45t:下旋转蒸发至无乙醇得到花色苷提取浓縮液；将3支40g中压色谱柱串联，注射器上 样，O. 1%三氟乙酸水溶液(A)和甲醇(B)作为流动相梯度洗脱，收集相应保留时间吸收峰， 可以分别得到228mg Cy-3-G和30mg Pn-3-G。 实施实例2 :称取黑米25kg，磨制米皮1500g，与15L 60%乙醇(含有0. 1 % HC1) 混合，室温下浸提2次，每次4-6h;浸提后经布氏漏斗抽滤，滤液于二 42t:旋转蒸发至无 乙醇为止；用石油醚脱脂，过滤后通过预先酸化的大孔树脂吸附柱，流速1-1. 5柱体积/ h，待吸附结束，用0. 01 % HC1洗除杂质；用80%乙醇溶液洗脱，流速2-3柱体积/h，收集 洗脱液于45t:下旋转蒸发至无乙醇得到花色苷提取浓縮液；利用保护柱(约12g C18填 料)与玻璃分离柱(400g C18填料，50mmX500mm)上样，O. 1%三氟乙酸水溶液(A)和甲 醇(B)作为流动相梯度洗脱，收集相应保留时间吸收峰，可以分别得到1200mg Cy-3-G和 150mgPn-3-G。
权利要求
一种从黑米中分离制备高纯度花色苷单体的方法，包括(1)制备黑米皮取一定量的黑米糙米，磨取黑米外层5％-8％种皮得到黑米皮。(2)制备黑米花色苷粗提浓缩液称取一定量黑米皮，用含有0.1％HCl的60％乙醇作为浸提剂，室温下浸提2次，每次4-6h；浸提后经布氏漏斗过滤，旋转蒸发浓缩；将浓缩液合并后用脱脂试剂萃取去脂，弃去萃取液上层脂质溶剂，下层的水溶液用大孔树脂吸附，待吸附结束，用0.01％HCl洗除杂质；用80％乙醇溶液将树脂柱上吸附的花色苷类物质洗脱下来，收集洗脱液于45℃下旋转蒸发至无乙醇得到花色苷提取浓缩液。(3)利用中压液相色谱技术分离花色苷单体取一定量的花色苷提取浓缩液，上反相C18色谱柱，用0.1％三氟乙酸水溶液和甲醇作为流动相，梯度洗脱，用紫外检测器检测洗出液，根据所得的色谱图分别收集黑米中不同的花色苷组分，将洗脱液旋转蒸发至无甲醇，冷冻干燥得到两种花色苷单体粉末。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征是在黑米皮乙醇浸提液脱脂试剂为石油醚。
3. 根据权利要求l所述方法，其特征是黑米皮乙醇粗提物采用Amberlite XAD-7大 孔树脂作为吸附材料。
4. 根据权利要求1所述方法，其特征是中压液相色谱采用反相C18填料装柱，料粒径 50 ii m。
5. 根据权利要求l所述方法，其特征是收集黑米中不同的花色苷组分，花色苷矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷出峰时的甲醇浓度分别为33 % -35 %和38 % -40 % ， 将洗脱液旋转蒸发浓縮，冷冻干燥得到纯度=95%的花色苷单体粉末。
全文摘要
本发明为一种从黑米中分离制备高纯度花色苷单体的方法。磨取黑米糙米外层5％-8％种皮得到黑米皮，采用酸化乙醇浸提黑米皮中的花色苷，石油醚萃取脱脂；用大孔树脂对黑米皮乙醇提取物进行初步纯化；以中压制备液相色谱技术分离黑米皮花色苷粗提物中的花色苷，根据所得的色谱图分别收集黑米中的两种主导花色苷组分，即矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷，将洗脱液于45℃下旋转蒸发至无甲醇，冷冻干燥得到花色苷单体粉末。
文档编号C07H1/08GK101723996SQ20091019436
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者凌文华 申请人:中山大学