专利名称：：一种锯缘青蟹双顺反子病毒检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及青蟹养殖生物
技术领域：
，尤其涉及一种锯缘青蟹双顺反子病毒检测方法及其试剂盒。
背景技术：
：锯缘青蟹(Scyllaserrata，学名为Mudcrab)，俗称青蟹，主要分布于印度洋-太平洋的热带、亚热带海域，是经济价值很高的食用蟹类，为名优养殖品种之一。病毒是锯缘青蟹Mudcrab养殖过程中的主要病原，其造成青蟹养殖业的严重经济损失。2004年始在珠海发现患"嗜睡病"(SD)的锯缘青蟹同时存在两种病毒锯缘青蟹双顺反子病毒(Mudcrabdicistrivirus，MCDV)禾口呼肠孤病毒(mudcrabreovirus，MCRV)。MCDV是水生甲壳动物中发现的单股正链RNA病毒ssRNA(+)，其单独存在就可以使锯缘青蟹致病，而且死亡率可达80%以上。因此对MCDV的感染机制和致病性进行研究，在青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，寻找有效的预防和防治方法，是当前锯缘青蟹养殖需要解决的重要问题。目前，国内外医学上病毒水平的检测一般采用PCR、westen-blot、原位杂交和免疫组化等方法，但这些方法均存在着操作复杂、精确度不高、需要特殊的仪器、费时长并不适用于大样本检测等问题。双抗体夹心ELISA方法是目前国际上普遍采用的定量检测细胞因子及其受体或者病原物的先进方法。双抗体夹心ELISA方法比生物学活性检测法具有更好的稳定性，特异性和灵敏度均较高，可以非常灵敏的检测出人与动物体液中细胞因子及其受体水平的变化以及病原微生物的表达水平，而且十分简便，不需要特殊的设备条件，利于推广使用。目前，在水产动物病毒的检测上应用高亲和力单克隆抗体进行双抗体夹心ELISA免疫学快速诊断的研究鲜有报道，尤其是针对MCDV进行高亲和力单克隆抗体的研究，以及利用对MCDV具有高亲和力的单克隆抗体对MCDV进行双抗体夹心ELISA免疫学快速诊断的研究尚未见有报道。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用MCDV结构蛋白的单克隆抗体，制备双抗体夹心，从而可对锯缘青蟹双顺反子病毒实现高效、灵敏、特异，且稳定性好的检测的方法。本发明的另一个目的在于提供上述检测方法的专属检测试剂盒。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的本发明人通过筛选制备分别得到锯缘青蟹双顺反子病毒三种结构蛋白的单克隆抗体，这三个单克隆抗体对锯缘青蟹双顺反子病毒具有很高的亲和力，在此基础上，本发明人又通过试验摸索和条件优化建立一种快速检测方法，该方法是基于双抗体夹心ELISA技术来检测锯缘青蟹双顺反子病毒的表达水平，从而实现对MCDV的快速检测。本发明的详细过程如下所述—、MCDV三种结构蛋白的单克隆抗体为了实现本发明检测方法能够对锯缘青蟹双顺反子病毒进行高效、特异、灵敏，且稳定的检测，本发明人对锯缘青蟹双顺反子病毒进行研究，发现该病毒的三个结构蛋白，并分别得到这三个蛋白的单克隆抗体，用于本发明的检测方法中，具体步骤如下所示本发明人从同时存在于锯缘青蟹的两种病毒(MCDV和MCRV)中分离纯化出MCDV。本发明人对MCDV的基因组分析发现其包含有被基因间非编码区(IGR)隔开的两个开放读码框0RF1和0RF2，其中，0RF1编码非结构蛋白，0RF2编码结构蛋白。本发明人对0RF2进行进一步地研究发现，0RF2由三个结构蛋白组成，分别是分子量为53KD的结构蛋白l(简称VP1)、分子量为35KD的结构蛋白2(简称VP2)和分子量为22KD的结构蛋白3(简称VP3)。接着，本发明人对结构蛋白1、结构蛋白2和结构蛋白3进行了一系列的研究分析，如下所示1、氨基酸序列及其编码核苷酸序列结构蛋白1的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；编码结构蛋白1的核苷酸序列，如SEQIDNO:1所示。结构蛋白2的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；编码结构蛋白2的核苷酸序列，如SEQIDNO:4所示。结构蛋白3的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；编码结构蛋白3的核苷酸序列，如SEQIDNO:7所示。2、单克隆抗体的获得本发明人首先采用全病毒(MCDV)作为抗原，进行体内免疫试验，然后采用HAT与HT选择杂交瘤细胞、间接ELISA法筛选阳性单克隆抗体，接着对结构蛋白1、结构蛋白2和结构蛋白3分别采用Westernblot方法，从筛选到的阳性单克隆抗体中分别将能识别结构蛋白1的单克隆抗体、能识别结构蛋白2的单克隆抗体和能识别结构蛋白3的单克隆抗体筛选出来。本发明将得到的MCDV三种结构蛋白的单克隆抗体与其它8种水生病毒以及人类单股正链RNA病毒的13种小RNA病毒科的病毒进行交叉实验，发现MCDV三种结构蛋白的单克隆抗体与其它水生动物病毒及这13种小RNA病毒均无交叉反应，证明制备的MCDV三种结构蛋白的单克隆抗体只能识别MCDV，用来检测MCDV具有很好的特异性，而不会与其他水生病毒及人类13种单股正链RNA病毒反应，检测时也不会出现假阳性结果。二、本发明双抗体夹心ELISA方法的建立本发明人首先对MCDV三种结构蛋白的单克隆抗体进行高效率的酶标，然后将这三个单克隆抗体任意两两组合配对制备双单抗夹心ELISA，对不同组合进行研究，确定最佳工作浓度，最后建立本发明的双抗体夹心ELISA方法。1.酶标记抗体酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。本发明选择高质量的酶——辣根过氧化物酶，简称HRP。本发明采用常规过碘酸钠法，进行HRP酶标记MCDV单克隆抗体的制备与纯化。本发明人通过优化试验发现，当HRP与单克隆抗体的质量比为1:l时，制备所得酶标记抗体的效果最佳。3.双单抗夹心ELISA方法的条件优化本发明人将MCDV三个结构蛋白的单克隆抗体随机两两组合，搭配双单抗夹心，然后对各种组合进行研究。结果发现，MCDV三个结构蛋白的单克隆抗体均具有不同的抗原识别位点，任意两个单克隆抗体搭配的双单抗夹心ELISA法都能实现对MCDV的特异性检测，其中，结构蛋白l的单克隆抗体和结构蛋白3的单克隆抗体进行组合的双单抗夹心ELISA方法，其检测效果最好。本发明双单抗夹心ELISA方法的条件优化如下采用1%BSA的封闭，4%BSA-PBS作为酶标抗体稀释液，酶标抗体作用时间为30min，底物在室温下避光作用15min，P/N值最大，夹心效果最佳。上述4%BSA-PBS是4克BSA溶解于lOOmlPBS缓冲液中配制而得；1%BSA是1克BSA溶解于lOOmlPBS缓冲液中配制而得。检出限的测定检测下限可达0.15iig/ml，线性测定范围在0.1510iig/ml。灵敏度在试验的最佳工作条件下，本发明建立的单抗夹心ELISA法可检测到2.5ng/ml的MCDV蛋白。4.多抗_单抗夹心ELISA方法标记好的两个单抗，先检测两个单抗是否可以夹心饱和情况下两个单抗是否识别同一位点，识别不同位点则可以夹心，用标记抗体法，该法最有效，最佳。如果两个单抗不能夹心，则可以用兔多抗与其中一种单抗进行夹心。本发明MCDV的三种结构蛋白的单克隆抗体，均可分别与兔多抗搭配，构建多抗_单抗夹心ELISA方法，从而实现对MCDV的检测。本发明人还将双单抗夹心ELISA方法与多抗_单抗双抗体夹心ELISA方法进行比较，结果发现双单抗夹心ELISA法检测MCDV抗原阳性率为92%，多抗-单抗夹心ELISA法检测阳性率为82%。双单抗夹心ELISA法检测假阳性率为6.7%，低于多抗-单抗夹心ELISA法的13.3%。双单抗夹心ELISA法与多抗-单抗夹心ELISA法灵敏度和特异度比较无显著性差异(P>0.05)。由此可见，本发明的两种双抗体夹心ELISA方法均可灵敏和特异地检测感染病毒蟹的血淋巴液中MCDV阳性，检出率为8292%。只是双单抗夹心法较多抗_单抗双抗体夹心法灵敏度，特异性及稳定性更好一些，因此本发明优选双单抗夹心ELISA法。本发明更加优选应用MCDV结构蛋白1的单克隆抗体和结构蛋白3的单克隆抗体制备的双单抗夹心ELISA法，其检测效果最好。利用本发明的检测方法，可制备相应的检测试剂盒，从而实现对MCDV的快速高效、高灵敏度和高特异性的检测。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明利用锯缘青蟹MCDV三种结构蛋白的单抗，得出多抗-单抗双抗体夹心ELISA方法和双单抗夹心ELISA方法，这两种方法均可灵敏和特异地检测感染病毒蟹的血淋巴液中MCDV阳性，检出率为8292%;2.根据本发明的方法，可制备相应试剂盒，从而实现快速、高效、高灵敏度、高特异性，以及高稳定性的对MCDV的检测，对生产中检测和今后科研有指导意义。图1为实施例3中酶标MCDV-单抗免疫活性测定折线图；其中，1为MCDV结构蛋白3的单克隆抗体，2为MCDV结构蛋白1的单克隆抗体。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1HRP标记抗体的方法本实施例采用过碘酸钠法，进行HRP酶标记MCDV单克隆抗体的制备与纯化，其具体操作步骤如下(1)称取5mgHRP溶解于O.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06mol/l化104水溶液0.5ml，混匀置4。C冰箱30min;(2)取出加入O.16mol/l乙二醇水溶液O.5ml，室温30min，加入含5mg纯化的单克隆抗体的水溶液lml，混匀，避光，缓慢搅拌、转入透析袋，于0.01MpH4.4醋酸缓冲液4t:透析过夜；所述单克隆抗体为MCDV结构蛋白1的单克隆抗体、MCDV结构蛋白2的单克隆抗体或MCDV结构蛋白3的单克隆抗体；(3)按hrp:单克隆抗体以3:i、2:i、i:i、i:2四个质量比混合，于0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液4。C透析过夜;(4)吸出透析物，按其体积的1/10加入新鲜配制的NaBH;溶液(5mg/ml)，混匀，置4t:，反应2小时；(5)加等体积饱和硫酸铵于上述结合物，4°C30min，离心，沉淀溶于少许0.01mo1/LpH7.2PBS，转入透析袋，于0.01MpH7.2PBS透析过夜；(6)离心弃沉淀，用0.Olmol/LpH7.2PBS加至5ml，即得酶与单克隆抗体的结合物(HRP-IgG结合物)，加入等量优质甘油，_201:保存备用。通过定性及效价滴定对结果进行判定。本实施例中，hrp:单克隆抗体以3:i、2:i、i:i禾pi:2四个质量比例混合制得的酶标抗体，按一定比例倍比稀释，检测阴阳标本，结果表明，HRP和单克隆抗体的质量比为i:i时，效果最佳。实施例2酶标记抗体工作浓度的选择免疫酶技术中，酶标记抗体工作浓度的选择对整个试验的影响很大，因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。1、酶标抗体的最佳工作浓度确定本实施例采用间接ELISA法测定酶标记抗体工作浓度，其步骤为先将抗原(以感染MCDV蟹的血液lOOng/孔)用0.05MpH9.6包被缓冲液稀释为10yg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加O.lml，4t:过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记单克隆抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成i:ioo，i:200，i:400，1:soo，i:i600，i:3200，i:6400(根据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.lml，37t:孵育1小时后洗涤。然后加底物显色液TMB，每孔O.lml，37。C1030min。以2MH2S040.05ml终止反应。加终止液终止反应，酶标仪双波长测出A450/A630值，A450/A630>1.0。酶标抗体最佳工作浓度的确定包被lOiig/ml多抗，酶标记单克隆抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成i:ioo、i:200、i:400、1:soo、i:i600、i:3200禾口i:6400，显色后分别检测其A450值，取强阳性A450/A630>1.0，阴性对照A450/A630<0.1的测定孔，确定酶标抗体的最佳工作浓度为1:3200。包被单抗和检测兔多抗最适工作浓度的确定根据棋盘法测定的结果，兔多抗和单抗分别用i%bsa-pbs液依次稀释成i:ioo、i:200、1:400、1:soo、i:1600、1:3200和1:6400，取强阳性A450/A630>1.0，阴性对照A450/A630<0.1的测定孔，确定单抗最适工作浓度为i:1600，兔多抗最适工作浓度为i:800。实施例3酶标抗体免疫活性测定酶标抗体免疫活性测定先将抗原(以感染MCDV蟹的血淋巴液)包被，酶标记MCDV的单抗作为一抗，酶标抗体稀释倍数(1:100x2n，n=0，1，2，3...ll)，然后加底物显色液TMB，显色后以2MH2S040.05ml终止反应，酶标仪双波长测出A450/A630值。A450/A630>l.O判定为阳性。结果如表1所示，结构蛋白1的单克隆抗体在1:16400处其A450/A630值为1.003，则结构蛋白1单克隆抗体的酶标抗体的免疫活性达到1:6400，而结构蛋白3的单克隆抗体在l:12800时A450/A630值为1.201，故结构蛋白3单克隆抗体的酶标抗体免疫活性达l:12800。表1MCDV-酶标单抗免疫活性的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如图1所示，MCDV-McAbs用HRP酶标记后的免疫活性测定，主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。由图1结果表明结构蛋白1单克隆抗体的酶标抗体的免疫活性达到1:6400，结构蛋白3单克隆抗体的酶标抗体达1:12800。也就是说重组蛋白MCDV-VP3的单抗其酶标抗体的免疫活性要高于全病毒MCDV制备的单抗酶标免疫活性。因为VP1单抗是由全病毒制备的，而VP3单抗是由重组蛋白制备的，它们的酶标抗体免疫活性分别是l:6400和l:12800。实施例4酶标单克隆抗体识别抗原表位的测定双单抗夹心ELISA方法的建立，首先要测定两个单克隆抗体识别抗原表位是否相同。标记好的两个单抗，先检测两个单抗是否可以夹心饱和情况下两个单抗是否识别同一位点，识别不同位点则可以夹心，用标记抗体法，该法最有效，最佳。否则两个单抗不能夹心，就只能用兔多抗与其中之一单抗进行夹心。本实施例选择MCDV结构蛋白1的单克隆抗体和结构蛋白2的单克隆抗体作为例子，进行酶标单克隆抗体识别抗原表位的测定。具体方法步骤如下(1)采用阻断抑制法，MCDV蛋白100ng/孔包被酶标板，按行分别加入倍比稀释的两株酶标MCDV单抗，最后一孔均留作阻断阴性对照(MCDV结构蛋白1的单克隆抗体、MCDV结构蛋白2的单克隆抗体)。再分别按行加入倍比稀释的未标记单抗(顺序与酶标单抗相反)。MCDV结构蛋白1的单克隆抗体、MCDV结构蛋白2的单克隆抗体除外(留作阻断阳性对照)。37t:温育30min，洗涤；加底物显色20min，加终止液终止反应，酶标仪双波长测出与A450/A630值。(2)相加实验进行单克隆抗体结合位点的分析用抗原(MCDV)最佳浓度包被酶标板，取几孔加入其中一种饱和浓度的单克隆抗体，37t:作用lhr，洗涤后，测定各孔0D490;再加入另一种饱和浓度的单克隆抗体，37。C作用lhr，洗涤后，测定各孔0D490，取其平均数，并按照公式计算2株单克隆抗体的指数AI。AI=(A12-A1)/A2X100%，Al和A2为结构蛋白1单抗和结构蛋白3单抗的0D490值，A12为结构蛋白1单抗叠加结构蛋白3单抗的0D490，AI大于10%可以初步判定2种单抗为不同的结合位点。结果如表2所示，MCDV结构蛋白1的单克隆抗体和结构蛋白3的单克隆抗体相互阻断，由此说明两株单抗识别的抗原表位显著相关，由此说明这两个单抗可以夹心。表2单抗识别抗原表位的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例5双抗体夹心ELISA方法的建立标记好的两个单抗可以建立双抗体夹心ELISA快速诊断方法，可以用多抗与单抗夹心，也可以用双单抗体夹心，本实施例采用两种方法同时做夹心ELISA:MCDV兔多抗与MCDV单抗双抗体夹心ELISA法，双单抗夹心ELISA法。双抗体夹心ELISA快速诊断方法的具体步骤如下所示，如果是多抗_单抗夹心就用兔多抗稀释800倍。1.多抗_单抗双抗体夹心ELISA方法(1)首先用抗MCDV的兔多抗于碳酸盐缓冲液中4t:下包被过夜，形成固相抗体。(2)用PBS-T洗涤3次，每次5min拍干，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用含有O.2%BSA的PBS-T的封闭，37t:恒温湿盒内作用2hr，洗涤去除未结合的部分及杂质。(3)加入含10X病蟹血淋巴液的PBS稀释液(待测定抗原)，37t:恒温湿盒内作用lhr，此时，抗原就会与固相上特异兔抗多抗反应而吸附于固相上。(4)再加入杂交瘤细胞的上清原液或者MCDV单抗(稀释1000倍)，37。C恒温湿盒内作用lhr洗涤3次，此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。(5)加入HRP-羊抗鼠IgG，37"恒温湿盒内作用lhr洗板。(6)加入酶底物，温育显色测定OD490nm。设定BALB/C鼠免疫后的血清为阳性对照，其OD值为P;注射PBS作阴性对照的BALB/C鼠血清作为阴性对照，OD值为N;设置PBS为空白对照，P/N>2.1判定为阳性。2.单抗_单抗双单抗夹心ELISA方法双单抗夹心ELISA方法的建立，首先要测定两个单克隆抗体识别抗原表位是否相同，同时要进行单抗配对实验。首先进行单克隆抗体识别抗原表位的测定，步骤如实施例4所示。然后进行单抗配对试验将针对构象型抗原位点和线性抗原位点的单抗配对包板和标酶，做夹心ELISA，单克隆抗体结合位点分析结果经ELISA相加试验，两株单克隆抗体之间的相加指数AI为50.1%，其可能识别的MCDV抗原结合位点不同。捕获及检测抗体的配对试验采用夹心ELISA法分别包被2株McAbs，加入100iig/L的MCDV滤液100uL，同时分别加入工作浓度的HRP标记的，两株McAbs于包被的孔内，37。C反应60min。加TMB显色后，加入2NH2S04终止液，测定A450/A630的OD值。设置PBS为空白对照，P/N>2.1判定为阳性。实施例6两种双抗体夹心ELISA方法检测比较本实施例的检测样品为50只已经用PCR检测为阳性的病蟹血淋巴液和30只PCR检测为阴性的非病蟹血淋巴液。本实施例分别用双单抗夹心ELISA方法和多抗-单抗夹心ELISA方法对上述样品进行检测。结果如表3所示，双单抗夹心ELISA法检测MCDV抗原阳性率为92%，多抗-单抗夹心ELISA法检测阳性率为82%。双单抗夹心ELISA法检测阴性的非病蟹血淋巴液的假阳性率为6.7X，低于多抗-单抗夹心ELISA法的13.3%。双McAbs夹心ELISA法与多抗-单抗夹心ELISA法灵敏度和特异度比较无显著性差异(P>0.05)。双McAbs夹心ELISA法比多抗_单抗夹心ELISA法灵敏度高和特异度好。表3双单抗夹心ELISA法与多抗_单抗夹心ELISA法检测病蟹血淋巴液的灵敏度和特异性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>—种锯缘青蟹双顺反子病毒检测方法及其试剂盒序列表SEQUENCELISTING〈110>中山大学〈120〉一种锯缘青蟹双顺反子病毒检测方法及其试剂盒〈130〉〈160>9〈170>PatentInversion3.5〈210>1〈211>1344〈212>DNA〈213>锯缘青蟹(Scyllaserrata)〈400〉1tcteaggatcgtgatctttcteaagtttctccctetgagaatettcctgcteagggtttc60ttggttttgattetggtgtetccactttcgcttttcctgateacgctett120gatcctectettgcteatcctgagtccattgatg卿tgtctettcaatetttggcttct180cggccgtetetgttggateggteteccatca皿ggtgg皿atectccctcgccgtcaggt240actgttgttgctgatetccctettegtcctgtcaattectctctctetggtegtettetc300cgtgattetegaaccatttttggtgctcctgtcagtctegctgttgcgatggcttcatgg360tggcgagcteaaattcacctteatcttcagttcgc皿3gaccagtgtcgt420ttecttgttcagtetcttccctetggttctgatgttcaatctcttgaaaatgttctttcc■caaattettgatetetcccatgttgatgagagtggtettgatttetgctttccttctett540皿tggatgcgttcttetgatcctgccactg皿ggctecactgctgggtgc600gcgcctgg皿gaattcttetttctgtgcttaatcctcteatttctgctegtectgtteat660gatgacattgttetgatgccatggcttecttggg皿皿tcttgaacttgctgagcctggc720tctcttgcteaggctgctettggttttgactetcctgctgatgctgttgaCg3g3皿tgg780acatctcgtgagttgcctgtcaccggttcttctttteatctttttcgtgateccactett840gttcttggtgcctctecteatetttcteatcttgttcttecteatgatgacactgggggt■gatteccagategtttctectectcctectggctcttetgtttctgctgtcacatgtcct960ateccatcactcatgatggtgtgggtgctecaattttcct102010attcttggtgctggtgagggtccttcttttcagatttccgctttgcgtcatggtgateag1080gtcacgateacagaggatcctecteagateaatgttegtggtgttegttttctcactggc1140accaattcttggaaagctegtttgaaggatagttctggaactttgtteggacgcttegag1200tetgatggtecttctttttctegtgattcacctgctegctteattcctggteagteteat1260gtggagcttgatcctgctgateattctgccgtegtcaccattgttgcteacaattcattt1320ggaactgcttctcttgatacacat1344〈210>2〈211>1344〈212>DNA〈213>锯缘青蟹(Scyllaserrata)〈220〉〈221>CDS〈222〉(1)(1344)〈400>2tctaaggatcgtgatctttctaaagtttctccctatgagaatattcct45SerLysAspArgAspLeuSerLysValSerProTyrGluAsnliePro151015getaagggtttcacacatggtgttggttttgattatggtgtatecact96AlaLysGlyPheThrHisGlyValGlyPheAspTyrGlyValSerThr202530ttcgettttcctgataacgetattgatcctactattgetaatcctgag144PheAlaPheProAspAsnAlalieAspProThrlieAlaAsnProGlu354045tecattgatgagatgtctattcaatatttggettcteggccgtatatg192SerlieAspGluMetSerlieGinTyrLeuAlaSerArgProTyrMet505560ttggataggtataccateaaaggtggaaatactccctegccgteaggt240LeuAspArgTyrThrlieLysGlyGlyAsnThrProSerProSerGly65707580actgttgttgetgatatecctattagtcctgtcaattectctetctat288ThrValValAlaAsplieProlieSerProValAsnTyrSerLeuTyr859095ggtagtattatecgtgattatagaaccatttttggtgetcctgtcagt336GlySerlielieArgAspTyrArgThrliePheGlyAlaProValSer100105110etagetgttgcgatggetteatggtggcgagetaaaattcaccttaat384LeuAlaValAlaMetAlaSerTrpTrpArgAlaLyslieHisLeuAsn115120125cttcagttcgcaaagacacaateccaccagtgtcgtttecttgttcag432LeuGinPheAlaLysThrGinTyrHisGinCysArgLeuLeuValGin130135140tatcttccctatggttctgatgttcaatctcttgaa朋tgttctttec■TyrLeuProTyrGlySerAspValGinSerLeuGluAsnValLeuSer14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