专利名称：具有抗菌和抗肿瘤活性的大环酰胺化合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是一种有抗菌和抗肿瘤活性的新型大环 酰胺化合物WH-21091(自命名)及其类似物的制备方法与应用。
背景技术：
随着社会经济的发展，人类生活环境和生活习惯的改变，新的疾病不断产生，通过 合成化学药物控制的疾病重新出现，并日愈泛滥。同时，抗生素的滥用导致病原细菌产生耐 药性，使正常剂量的药物不能发挥应有的杀菌效果。此外，恶性肿瘤成为导致死亡的主要原 因，严重地威胁着人类的健康和生命。疾病的蔓延，给人类造成了新的灾难。在农林方面， 人类面对着病原菌对杀菌剂和化学药物抗药性的挑战。因此，不断开发新的、有效的药物受 到了广泛的重视。土壤中存在着大量微生物，包括细菌、真菌、放线菌、病毒和原生生物等。 土壤微生物次生代谢产物的分子多样性是新药物和新农药研究与开发的资源库。
土壤中昆虫病原线虫共生细菌产生具有生理活性的次生代谢产物，如抑菌物质、 杀虫蛋白和胞外酶等。其中，产生抗生素是共生细菌的普遍特征，作为抑制细菌、真菌和酵 母生长的抗菌物质有广阔的商业应用前景(Webster等，2002)。 大量的研究报道表明，与斯氏属(Steinernema)和异小杆属(Heterorhabditis) 线虫共生的肠杆菌科致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆菌属(Photorhabdus)等革兰氏阴 性细菌，其代谢产物不仅能抑制多种细菌和真菌的生长，还具有杀虫活性和抑制肿瘤细胞 生长的活性。因此，从该类特异生境细菌中寻找新的生理活性物质已成为国内外科学家关 注的热点(Li，1997 ;Park，2001 ;刘卫京，2004 ;Furgani， 2008)。目前，从其代谢产物中已 发现新的抗菌物质，例如xenoco丽cins，固atophin仏i， 1997， 1998) ， xenorxides仏i， 1998)， benzylineacetone (Ji， 2004) ， xenortides禾口 xenematide (Xang， 2008) 等。 xenorxides还具有显著的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种从致病杆菌和光杆菌中分离到的，完全新型的抗菌和抗 肿瘤活性物质大环酰胺化合物WH-21091及其类似物的制备方法与应用。
本发明的大环酰胺化合物WH-21091的化学结构如下
<formula>formula see original document page 5</formula> 其中，&-1 15中的一个或数个位置可以是氢原子，也可以部分或全部由烷基、环烷
基、烯基、炔基、芳香基、以及由氧、氮、硫和卤素等原子组成的基团或杂环基取代，其含氧的
取代基团包括羟基、酰基、酮基和羧基；含氮的取代基团包括氨基和硝基。
所述大环酰胺化合物WH-21091为微生物的次生代谢产物，该微生物包括寄生于斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫体内并与线虫共生的伯氏杆菌(Xenorhabdus bovienii)、嗜线虫杆菌(X. nematophila) 、 X. ehlersii禾口X. budapestensis杆菌属(Xenorhabdus)以及发光杆菌属(Photorhabdus)寄生杆菌。
所述的大环酰胺化合物WH-21091的制备方法如下 1)将寄生杆菌的线虫幼虫侵染大蜡螟(Galleria mellonella)的终龄幼虫，对死
去的幼虫进行消毒、解剖、取淋巴放置于琼脂培养基上，室温下黑暗培养，分离杆菌； 2)杆菌的培养对上述杆菌进行发酵培养，接种到含有碳源和氮源的液体培养基
中，在23-27t:条件下进行有氧培养，培养时间持续24-96小时，在培养过程中，定时测定培
养液的抗菌活性，直到培养液产生WH-21091所具有的抗菌活性。菌株在含有碳源和氮源的
液体培养基中培养时，先进行初级培养后，再进行次级培养。 3) WH-21091的制备发酵培养结束后，过滤或离心，除去菌体，清液用酯酸调节pH至7. 0，用氯仿或乙酸乙酯萃取，合并萃取液，过滤，40-5(TC减压浓縮，得到的提取物，在柱层析上进行分离，通过溶剂梯度洗脱，分离得到具有抗菌活性的大环酰胺化合物WH-21091 。用薄层层析法和抗菌活性检测指导分离纯化，也可用高压液相色谱法进行分离和纯化。在柱层析上进行分离时，以硅胶、树脂或凝胶的任何一种作为层析材料，在应用硅胶柱层析时，硅胶为200-300目的柱层析用硅胶，提取物与硅胶的比例为1 : 15。用层析法分离纯化杆菌产生的次生代谢产物时，应用氯仿和甲醇或石油醚或丙酮或它们的混合物作为洗脱剂。 大环酰胺化合物WH-21091也可经过转基因方法由其他生物体产生；其基本方法是人工分离产生WH-21091的目的基因，进行修饰，通过载体连接到包括大肠杆菌在内的其他生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的可遗传修饰，从而生产WH-21091。 本发明的大环酰胺化合物WH-21091的应用 WH-21091对大多数革兰氏阳性病源细菌和真菌具有显著的抗菌活性，特别是对耐药性细菌(例如耐药性金色葡萄球菌等)引发的感染，活性高于目前市场上的一般抗生素。其可用于预防和治疗由这些病原菌引发的感染，是用于替代现有抗生素的新一代新型广谱抗生素，可治疗的宿主包括植物和动物，如狗、猫和其它家养动物等哺乳动物，尤其是人。 WH-21091还对一些人癌细胞系具有抗肿瘤活性。最重要的，WH-21091抑制人肺癌的生长以及人乳腺癌和宫颈癌的生长。剂型、给药方式以及剂量，可以由熟练的技术人员进行选择。成年人的示例剂量为每日大约2.5mg到大约2.000mg。对哺乳动物的给药方式可以是口服，肠胃外或者局部给药，对植物宿主的给药方式可以通过施与种子、树叶或其他植物部分，或者施与土壤中来实现。 当WH-21091或其酯类衍生物被用于治疗时，它们可以被单独使用或者以药学上
合适的制剂形式使用，所述制剂含有活性成分以外的一种或多种常规的载体。根据疾病的
性质和/或给药途径，本发明的所述的衍生物可以用已知的方法来制备。 药物组合的例子包括适于口服，局部或肠胃外给药的任何固体化合物(片剂、丸
剂、胶囊、颗粒、粉末等)或液体化合物(溶液、悬浮液或乳剂)，它们可以仅包括该化合物或
其酯类衍生物，也可以由该化合物或其酯类衍生物与任何的载体或其他药学活性化合物组
合在一起。这些化合物在肠胃外使用前需要进行灭菌。 给药剂量取决于疾病的种类、宿主的类型(包括其年龄，健康状况和体重)、同时进行的其它类型的治疗(如果有其他类型的治疗)、以及治疗的频率和治疗比、使用的活性成分的剂量水平，在静脉给药时是O. 1到约200mg/kg宿主体重；肌肉给药时是1到约500mg/kg宿主体重；口服给药时是5到约1000mg/kg宿主体重；滴鼻给药时是5到约1000mg/kg宿主体重；喷雾给药时是5到约1000mg/kg宿主体重。以浓度表示，用于皮肤、鼻腔、咽喉、支气管、阴道、直肠或者眼睛局部用药，本发明的化合物含有浓度约0.01到约50% (w/V)，优先约1到约20% (w/w)。同样地，对于肠胃外给药，使用的浓度约0. 05到约50% (w/V)，优先约5到约20X (w/w)。在动物和人的疾病治疗中，用作抗菌药物和/或抗肿瘤药物的活性成分的WH-21091及其酯类衍生物，可以利用现有技术中的药用物质和确定的工艺容易地制成单位制剂。可以选择合适的固体或液体赋形剂或者稀释剂，通过本领域技术人员已知的方法制备该化合物。
作为农业应用，该抗菌化合物或其衍生物可以置于惰性载体内制成。如果制成固体，活性成分可以与例如漂白土、高岭土、硅藻土或其他可湿润的污迹稀释剂等常用载体混合。也可以使用流动性粉尘制剂，其通过将干燥的活性成分与诸如滑石粉、叶蜡石、粘土和硅藻土等的细微固体混和而制得。 根据其在液体载体中的溶解性，粉末可以以悬浮液或溶液形式施用。可以使用压力喷雾剂，特别是活性成分弥散于低沸点的分散剂溶剂载体的气雾剂。重量百分比可以根据该化合物被应用的方式和所使用的制剂进行调整，通常，该抗菌制剂中包括O. 005wt^到95wt^的活性成分。该抗菌化合物可以与其它成分一起使用，所述其它成分包括生长调节因子、杀虫剂和肥料等，这些成分有助于应用、易于操作、维持化学稳定性和增强效力。根据活性成分的溶解性、乳化度、比重和经济因素选择溶剂。可加入佐剂以增强活性，还可以加入包括阴离子、阳离子或非离子的表面活性剂。稳定剂和防冻剂可以延长保藏时间。另外，可以加入增效剂、粘结剂、铺展剂和除臭剂化合物以改善商业制剂的处理特性。该活性成分可与诸如碳酸钙等惰性载体组合制成丸，或制成其他可消耗的给药器，包括用于定量传输活性成分的控释给药器。 本发明的化合物还可以用作抗菌药物，用于抑制现存微生物的生长或者根除活宿主表面上或活宿主外媒介内的微生物。本发明的化合物和/或它们的酯类衍生物可用作消毒剂，对多种易于微生物生长的固体或液体媒介进行消毒。本发明化合物的合适用量可根据本领域技术人员已知的方法来确定。 下面的例子用于进一步说明本发明，但并不是对本发明的限定。
具体实施方法
实施例 从伯氏至文病杆菌(X. bovienii)、嗜线虫至文病杆菌(X. nematophila) 、 X. ehlersii、X. bud即estensis、光杆菌(Photorhabdus sp.)培养物中制备和分离WH-21091 。上述菌株的初级培养物维持14天后进行次级培养。首先用接种环将初级培养物加入到装有50ml胰酶大豆肉汤(TSB)培养基的100ml锥形烧瓶中，在25t:，120rpm条件下，培养物在Eberbach转动震荡器上连续培养24小时，将100ml该培养物接种到装有900ml TSB培养基的2000ml的烧瓶中，在25°C， 120rpm，黑暗条件下，于Eberbach转动震荡器上连续发酵培养96小时，发酵液在4°C， 12， OOOXg，条件下离心20分钟以分离出细菌菌体。再将该菌体接种到20L培养基(与初级培养基相同)中，接种后的培养基在37t:下培养三天(次级培养)，培养结束后，过滤或离心，除去菌体，清液用酯酸调节pH至7. 0，用20L氯仿或乙酸乙酯萃取三次，合并萃取物，于旋转蒸发仪中，在40°C -S(TC，真空状态下浓縮，得到约20g油性粗提物，得到的粗提物加入100ml己烷，搅拌30分钟后，出现固体沉淀物，过滤后得到约10g固体，用20ml氯仿充分溶解，在硅胶柱(200-300目)上进行分离，提取物与硅胶的比例为1 : 15 ;用氯仿和甲醇(9 : 1)混合溶剂洗脱，通过薄层层析监测分离过程。对分离得到的物质进行抗菌活性实验，最后得到一个具有显著抗菌活性的化合物，用NMR和MS对其进行结构鉴定。 该化合物结构如下所示
<formula>formula see original document page 8</formula> 2.WH-21091的结构鉴定 用C5D5N5溶剂在Bruker丽600核磁共振光谱仪测定NMR谱。通过70eV惠普5985Bgc体系得到低分辨率MS图谱。通过上述相同的设备使用异丁烷得到CIMS图谱。用KratosMS80质谱仪得到高分辨率MS图谱。用配备有Waters 996PDA检测器的Waters 2695高效液相仪进行HPLC和UV分析。表1为WH-21091的NMR谱数据。
表1. WH-21091的NMR谱数据原子序号13C-NMR(ppm)i腦MR (ppm)
1174.0
274.24.89 (d， 6.0 Hz)
371.85.03 (dd, 6.0， 4.5 Hz)
462.54.40 (m)
25.92.37 (m), 2.22 (m)
624.91.85 (m)
45.53.41 (m)
824.71.94 Cm)
939.91.92 (m), 1.42 (m)
1049.44.66 (m)
1181.84.72 (ddd, 14.4， 2.4, 2.4 Hz)
1230.13.21 (dd， 15.6, 12.6 Hz),
2.95 (dd， 16.8,3.0 Hz)
1323.40.84 (d, 7.2 Hz)
1421.80.92 (d, 6.6 Hz)
匸140.8
109.1
3,162.4
4'116.06.96 (d, 8.4 Hz)
5,136.57.35 0， 7.8 Hz)
6'118.76.62 (d, 7.2 Hz)
7-170.0
CONH8.79 (d， 9.6 Hz) 应用实施例1 :WH-21091作为抗菌药物 WH-21091化合物进行了以下抗菌试验，显示了 WH-21091的抗菌特性。采用了标准稀释方法，在35t:下进行测定，培养24小时后，得到了 WH-21091的最小抑制浓度(MIC)。
表2显示了 WH-21091化合物对测试的微生物的MIC。结果表明，从致病杆菌(Xenorhabdus)分离得到的WH-21091具有有效的抗菌特性。特别是对一些有抗生素抗性的葡萄球菌菌株的抗菌特性。
表2. WH-21091和红霉素的抗菌活性 [OO39] (MIC， ii g/ml，24hr和48hr，培养基胰蛋白胨大豆肉汤)
细菌样品WH-21091红霉素
大肠杆菌(￡sc/zm'c/H'fl CO")41
表皮葡萄球菌(Sto/ /zy/ococcMS e/ /cfer附/必)80.25
金黄色葡萄球菌MSRA* (S. awrews MSRA)4>32
粪肠球菌(五她rococcw5^eca/!,s)32>32
化脓性链球菌(5Vre/ tococc^ ;jyogewM)40.03
绿脓杆菌(i^ew^/owo""s aerwg/nosa)>32>32*耐甲氧西林株的临床分离物(clinical isolates)
应用实施例2 :WH-21091作为抗肿瘤药物 WH-21091的体外抗肿瘤活性已经在人肺癌H460、乳腺癌MCF_7和宫颈癌Hela的细胞培养物中得到确认。测试用Skehan等人(1990)所描述的方法进行。WH-21091对这些癌细胞都表现出显著的抗肿瘤活性(表3)。
表3. WH-21091对肿瘤细胞的抗肿瘤活性
H460 MCF-7 Hela
IC50((xg/ml) 0,10 0.81 0.24 尽管上述说明含有许多具体特征，然而它们不应当被认为是对本发明的限定，只
是优选的实施方法的例子。
参考文献 Skehan等人(1990) J.-X丄i， G. _H. Chen， J. M. Webster. Nematophin， A novel antimicrobial substance produced by Xenorhabdus nematophilus (Enterobactereaceae).
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10
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权利要求
一种大环酰胺化合物WH-21091，其特征在于该大环酰胺化合物WH-21091的化学结构如下F2009102182573C0000011.tif
2.根据权利要求1所述的大环酰胺化合物WH-21091，其特征在于该大环酰胺化合物WH-21091的化学结 构如下<formula>formula see original document page 2</formula>其中，RrR15中的一个或数个位置可以是氢原子，也可以部分或全部由烷基、环烷基、烯 基、炔基、芳香基、以及由氧、氮、硫和卤素等原子组成的基团或杂环基取代，其含氧的取代 基团包括羟基、酰基、酮基和羧基；含氮的取代基团包括氨基和硝基。
3. 根据权利要求1所述的大环酰胺化合物WH-21091，其特征在于所述大环酰 胺化合物WH-21091为微生物的次生代谢产物，该微生物包括寄生于斯氏线虫属 (Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫体内并与线虫共生的伯氏杆菌 (Xenorhabdusbovienii)、嗜线虫杆菌(X. nematophila) 、 X. ehlersii禾口 X. budapestensis 杆菌属(Xenorhabdus)以及发光杆菌属(Photorhabdus)寄生杆菌。
4. 权利要求1所述的大环酰胺化合物WH-21091的制备方法，其特征在于(1) 将寄生杆菌的线虫幼虫侵染大蜡螟(Galleria mellonella)的终龄幼虫，对死去的 幼虫进行消毒、解剖、取淋巴放置于琼脂培养基上，室温下黑暗培养，分离杆菌；(2) 杆菌的培养对上述杆菌进行发酵培养，接种到含有碳源和氮源的液体培养基中， 在23-27t:条件下进行有氧培养，培养时间持续24-96小时，在培养过程中，定时测定培养 液的抗菌活性，直到培养液产生WH-21091所具有的抗菌活性；3)WH-21091的制备培养结束后，过滤或离心，除去菌体，清液用酯酸调节pH至7.0，用 氯仿或乙酸乙酯萃取，合并萃取液，过滤，40-5(TC减压浓縮，得到的提取物，在柱层析上进 行分离，通过溶剂梯度洗脱，分离得到具有抗菌活性的大环酰胺化合物WH-21091 。
5. 根据权利要求4所述的大环酰胺化合物WH-21091的制备方法，其特征在于在柱层析 上进行分离时，以硅胶、树脂或凝胶的任何一种作为层析材料，在应用硅胶柱层析时，硅胶 为200-300目的柱层析用硅胶，提取物与硅胶的比例为l : 15。
6. 根据权利要求4所述的大环酰胺化合物WH-21091的制备方法，其特征在于菌株在含 有碳源和氮源的液体培养基中培养，先进行初级培养后，再进行次级培养。
7. 权利要求l所述的大环酰胺化合物WH-21091的应用，其特征在于该大环酰胺化合 物WH-21091及其类似物用于制备对革兰氏阳性细菌以及动物和植物的病源细菌和病源真 菌具有抗菌活性的制剂。
8. 权利要求l所述的大环酰胺化合物WH-21091的应用，其特征在于该大环酰胺化合物 WH-21091及其类似物用于制备对人或动物的癌细胞的生长具有抑制活性的制剂。
全文摘要
本发明是一种具有抗菌和抗肿瘤活性的新大环酰胺化合物WH-21091及其类似物，以及它的制备方法和应用。该大环酰胺由致病杆菌属(Xenorhabdus)和发光杆菌属(Photorhabdus)等微生物产生，也可经过转基因技术由其他生物体产生。该大环酰胺及其类似物的制剂可用作治疗微生物感染的药物和(或)农药，特别是用于抗药性金黄色葡萄球菌的传染病，也可用为治疗人或动物癌症的药物。
文档编号C07D225/02GK101735149SQ20091021825
公开日2010年6月16日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者张颖君, 李海舟, 杨崇仁, 赵平 申请人:玉溪市维和生物技术有限责任公司