专利名称：：一种从“太岁”中提取基因组的方法
技术领域：
：本发明属于分子微生物学领域，具体地涉及一种从"太岁"中提取基因组的方法。
背景技术：
："太岁"是一种存在于地球上的不明生物体，它的存在、作用和影响在生物学界始终有争议。"太岁"生活于土壤中，生命力极强，它不是动物，也不是植物。它既有原生生物的特点，也有真菌的特点，是活的生物体，世界罕见。"太岁"是迄今发现的最古老的古生物活体标本，可能生命进化过程中介于原生动物和真菌之间的原生质生物，处于生命演化的一个岔道口上。李时珍在《本草纲目》中称之为"肉芝"，并称其为"本经上品"。古籍《山海经》称"太岁"为"视肉、聚肉、肉芝"，描述它"食之尽，寻复更生"。它外表好像动物的皮，切开后发现里面却是像肥肉的粘质体。由于非常少见，一直是生物演化研究的一个盲点，所以它对研究生命演化过程十分有意义。关于"太岁"是何种生物体的猜测，各种概念都是是非常模糊的，还不能清楚解释"太岁"为何种物种，惟有通过分子系统分析等研究，才能将"太岁"身上的秘密一一揭开。然而，目前采用常规的提取技术，从"太岁"中无法提取出基因组，给"太岁"的进一步研究带来困难。
发明内容为了克服现有技术的不足，本发明提供一种从"太岁"中提取基因组的方法。应用本发明，一方面获得了"太岁"中的基因组，另一方面为"太岁"的分子生物学研究打下了基础。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的一种从"太岁"中提取基因组的方法，包括，a)将"太岁"组织经裂解液研磨后，得研成碎末的"太岁"组织液；b)向研成碎末的"太岁"组织液中加入氯仿-异戊醇，摇匀，离心，取上清液；c)在约72t:水浴中停留约3min，置于冰浴中，取出自然升温至室温；d)加入27mol/L的除蛋白溶剂，使除蛋白溶剂终浓度为约lmol/L;e)重复b)至d)步骤，直至加入氯仿-异戊醇，离心后，两层界面看不到蛋白物质，取上清液；f)加入经-2(TC预冷的95^乙醇，混匀，有絮状沉淀析出，离心收集沉淀。从"太岁"中提取基因组的方法，还包括在步骤a)之前，将"太岁"组织经消毒处理。所述"太岁"组织是在"太岁"表皮下割取，经消毒、削去表皮组织后切成小块，制得"太岁"无菌组织，然后加入裂解液研磨成碎末。制取"太岁"的无菌组织。无菌的意义是除去"太岁"中所带有的杂菌，同时不再混入"太岁"组织以外的杂菌，这样获得的基因组才是纯粹的"太岁"的基因组；否则，如果不能保证用于提取基因组的"太岁"组织不是无菌组织，所提取的基因组即使通过氯仿_异3戊醇抽提，也不能确保该基因组就是来自该"太岁"原本的基因组。无菌组织是从未接触外界有菌环境的组织，通过从大块"太岁"上索取部分组织块，再对其进行消毒处理得到无菌组织块。所述的裂解液由裂解液I、裂解液11、裂解液111和水，按体积比为812:812:i:8io混合；所述的裂解液I是氯化钠1.5mol/L、柠檬酸三钠0.15mol/L，pH=7.0;所述的裂解液II是0.lmol/LEDTA;所述的裂解液III是1%SDS。所述的氯仿-异戊醇中，按体积比，氯仿和异戊醇的比为2026:1。优选24:i。所述的除蛋白溶剂是NaCl或蛋白酶。优选NaCl。本发明的有益效果是通过本发明，获得了"太岁"的基因组，经琼脂糖凝胶电泳检测，检测到了电泳条带，说明通过本发明确实获得了"太岁"的基因组，开创了"太岁"的分子生物学研究先河。使通过分子生物学方法鉴定"太岁"的物种属性成为了可能。本发明的意义在于突破了单纯微生物学研究"太岁"物种属性的局限性，成功从"太岁"组织块中提取并获得其基因组，是从分子生物学角度揭开千年"太岁"之谜的首创之举；通过获得其基因组而证实了"太岁"是有生命的生物学观点；以后可对所提取的基因组的PCR反应产物进行测序来构建进化树，确定"太岁"在生物界的分类地位。图1是采用本发明的方法提取出的"太岁"基因组的琼脂糖凝胶电泳检测图。图中1、2、3和4是"太岁"基因组，5是Marker。具体实施例方式以下结合具体实施方式对本发明做进一步详细描述实施例11.无菌"太岁"组织制备(1)取样在"太岁"表皮组织下割下大约2立方厘米的组织块。(2)表面消毒在无菌操作间内进行，将组织块放入无菌的小烧杯中。用75%的乙醇对组织块进行表面消毒3min，再用浓度为0.1%的升汞对组织块进行消毒lmin。消毒的意义在于避免杂菌干扰。(3)无菌水洗脱残留消毒剂在无菌操作间内进行，无菌水淹没组织块震荡漂洗6次，洗去表面消毒剂。意义在于避免残留消毒剂杀死内部组织。(4)无菌滤纸吸干表面水分无菌操作间内进行，将组织块放在无菌的滤纸上，用无菌镊子夹住无菌滤纸反复吸干表面水分。意义在于避免杂菌随水扩散。(5)切除消毒组织的表层在无菌操作间进行。用无菌的手术刀削去消毒组织块的表层，意义在于除去表层可能带有的杂菌。(6)无菌操作切成小块在无菌操作间内进行。在垫有无菌滤纸片的平皿上，用无菌手术剪刀把组织块剪成lmm3的小块，其间注意无菌操作。42.配制基因组提取液裂解液I(SSC):氯化钠1.5mol/L、柠檬酸三钠0.15mol/L，pH=7.0裂解液II:0.lmol/LEDTA裂解液III:1^SDS抽提液氯仿-异戊醇(24:lv/v)除蛋白溶剂5mol/LNaClDNA沉淀剂95%乙醇DNA洗涤剂75%乙醇3.提取基因组的步骤a)无菌操作间进行，取大约lg处理后的无菌"太岁"组织块放入无菌的小研钵中，在研钵中加入由0.5ml裂解液I、0.5ml裂解液II、50y1裂解液III和0.45ml无菌水组成的裂解液，充分研磨至"太岁"小块组织成碎末，得研成碎末的"太岁"组织液。b)将研钵中的研成碎末的"太岁"组织液转移到5ml离心管中，向离心管中加入等体积氯仿_异戊醇(24:lv/v)，摇匀，4000r/min离心10min。混合物分3层，下层为氯仿，中间为"太岁"碎末。将上清液转移到另一离心管中。c)将上清液在约72t:水浴停留约3min，使组织内的DNase失活，然后置于冰浴中约10分钟，取出自然升温至室温。d)向离心管中加入5mol/LNaCl，使其终浓度为lmol/L。e)再向步骤d)中的离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇，重复b)至d)步骤，直至加入氯仿-异戊醇，摇匀，离心后，上下两层之间的界面看不到蛋白物质，取上清液。f)向上清液中，加入2倍体积的经-2(TC预冷的95%乙醇，倒置离心管若干次，有絮状沉淀析出，12000r/min离心收集沉淀，即为DNA基因组。g)用70%乙醇洗涤基因组两次，室温晾干。4.检测取获得的DNA基因组，溶于无菌水中。琼脂糖凝胶电泳检测基因组提取结果。检测结果见图1，图中，l、2、3和4是"太岁"基因组，5是Marker。从图l可见，l、2、3和4具有明显的条带，说明，通过本发明，从"太岁"中提取出了基因组。X寸比i式验采用实施例1的提取方法，不同的只是改变了裂解液，采用现有技术的裂解液，裂解液的组成及检测结果见表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求一种从“太岁”中提取基因组的方法，其特征在于包括，a)将“太岁”组织经裂解液研磨后，得研成碎末的“太岁”组织液；b)向研成碎末的“太岁”组织液中加入氯仿-异戊醇，摇匀，离心，取上清液；c)在约72℃水浴中停留约3min后，置于冰浴中，取出自然升温至室温；d)加入2～7mol/L的除蛋白溶剂，使除蛋白溶剂终浓度为约1mol/L；e)重复b)至d)步骤，直至加入氯仿-异戊醇，离心后，两层界面看不到蛋白物质，取上清液；f)加入经-20℃预冷的95％乙醇，混匀，有絮状沉淀析出，离心收集沉淀。2.如权利要求1所述的从"太岁"中提取基因组的方法，其特征在于还包括在步骤a)之前，将"太岁"组织经消毒处理。3.如权利要求1所述的从"太岁"中提取基因组的方法，其特征在于裂解液由裂解液工、裂解液n、裂解液in和水，按体积比为812:812:i:sio混合；所述的裂解液I是氯化钠1.5mol/L、柠檬酸三钠0.15mol/L，pH=7.0;所述的裂解液II是0.lmol/LEDTA;所述的裂解液III是1^SDS。4.如权利要求l所述的从"太岁"中提取基因组的方法，其特征在于氯仿-异戊醇中，按体积比，氯仿和异戊醇的比为2026:1。5.如权利要求4所述的从"太岁"中提取基因组的方法，其特征在于氯仿-异戊醇中，按体积比，氯仿和异戊醇的比为24:1。6.如权利要求1所述的从"太岁"中提取基因组的方法，其特征在于所述的除蛋白溶剂是NaCl或蛋白酶。7.如权利要求6所述的从"太岁"中提取基因组的方法，其特征在于所述的除蛋白溶剂是NaCl。全文摘要本发明涉及一种从“太岁”中提取基因组的方法。采用的技术方案是a)将“太岁”组织经裂解液研磨，得研成碎末的“太岁”组织液；b)向研成碎末的“太岁”组织液中加入氯仿-异戊醇，摇匀，离心，取上清液；c)在约72℃水浴中停留约3min，置于冰浴中，取出自然升温至室温；d)加入2～7mol/L的除蛋白溶剂，使除蛋白溶剂终浓度为约1mol/L；e)重复b)至d)步骤，直至加入氯仿-异戊醇，离心后，两层界面看不到蛋白物质，取上清液；f)加入经-20℃预冷的95％乙醇，混匀，有絮状沉淀析出，离心收集沉淀。应用本发明，成功的从“太岁”中获得了基因组，为“太岁”的分子生物学研究打下了基础。文档编号C07H21/04GK101705224SQ20091022011公开日2010年5月12日申请日期2009年11月24日优先权日2009年11月24日发明者刘宏生,姜秋实,朱俊丰,朱春玉,白婷婷,艾海新,郑方亮申请人:辽宁大学