专利名称：取自牛樟芝的新颖化合物的制作方法
技术领域：
本发明系关于取自牛樟芝(Antrodia camphorata)的新颖且具有免疫刺激性及抗发炎性化合物。
背景技术：
牛樟芝(Antrodia camphorata，其等同于Taiwanofungus camphorata)系台湾原生种。其子实体系非常少见及昂贵的蕈类，其在野外缓慢生长，且极难以在温室中种植。在台湾，牛樟芝的子实体传统上已被作为中草药，且其常称为「樟芝(jang-jy)」或「牛樟芝(niu-chang-chih)」(Shen C.C.et al.，J.Chin.Med.2003，14，247-258)。
在自然中，牛樟芝系生长于牛樟(Cinnamomun kanehirai Hay(樟科(Lauraceae)))的内心材壁上，牛樟系一种台湾的特有且濒临绝种的原生物种。野生牛樟芝子实体含有脂肪酸、木酚素、苯基衍生物、倍半萜、类固醇、及三萜类化合物(Shen C.C.et al.，上述文献)。在传统中医中，牛樟芝的子实体已被用于治疗食物及药物中毒、腹泻、异常疼痛、高血压、皮肤搔痒、以及肝癌。
发明内容
本发明提供来自于牛樟芝的新颖化合物。在本发明中，其已自固态培养的牛樟芝子实体中分离出部分新颖的顺丁烯二酸及琥珀酸衍生物。
本发明的目标系提供一种化合物或其医药上可接受的盐，其系选自由下列者所组成的群
式I
式II
式III
式IV
式V 及
式VI 其中R独立系H、
甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、、
或，
其中X＝H、OH、OR、NH2、或NHR(其中R＝烷基或酰基)。
根据本发明，该等化合物可提供抗发炎或免疫刺激作用。本发明的另一目的系提供一种以上述化合物或其医药上可接受的盐用于制备免疫调节医药的用途。
具体实施例方式 除非另外定义，本文中所用的所有技术及科学词汇具有所属技术领域的技术人员所通常明了的相同意义。
在本文中，冠词“一”是指一个或一个以上(亦即，至少一个)的该冠词的文法客体。举例而言，“一组件”意谓一个组件或一个以上的组件。
本发明提供一种化合物或其医药上可接受的盐，其系选自由下列者所组成的群
式I
式II
式III
式IV
式V 及
式VI 其中R独立系H、
甲基、乙基、丙基、 丁基、异丙基、或
其中X＝H、OH、OR、NH2、或NHR(其中R＝烷基或酰基)。
本发明的化合物可分离自天然来源，诸如牛樟芝的子实体，或可由化学合成。为自牛樟芝的子实体取得本发明的化合物，可经由任何习知的方法进行萃取。在一实例中，其收集似灵芝(Ganoderma)真菌(如，牛樟芝)的子实体，干燥，再浸泡于醇中(如，甲醇、乙醇、或其混合物)一段适当的时间(如，至少四天)。在经由，如，真空，除去该醇后，加入水。以适当的极性溶剂(如，EtOAc)对该悬浮相进行分离。将该极性溶剂层浓缩成为黑色的糖浆(如，藉由蒸馏)。接着，经由任何形式的纯化，分离该糖浆中的混合物，诸如，但不限于，管柱层析，使用正己烷、EtOAc、及MeOH。以1H及13C NMR鉴定该终化合物，取得六种新颖的化合物 反式-3-异丁基4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮(式I，其亦称为化合物1)， 反式-1-羟基-3-(4-羟苯基)-4-异丁基吡咯啶-2，5-二酮(式II，其亦称为化合物2)， 顺式-3-(4-羟苯基)-4-异丁基二氢呋喃-2，5-二酮(式III，其亦称为化合物3)， 3-(4-羟苯基)-4-异丁基-1H-吡咯-2，5-二酮(式IV，其亦称为化合物4)，3-(4-羟苯基)-4-异丁基呋喃-2，5-二酮(式V，其亦称为化合物5)，及二甲基-2-(4-羟苯基)-3-异丁基顺丁烯二酸二甲酯(式VI，其亦称为化合物6)。
在本发明中，其发现本发明的化合物具有免疫刺激作用，并具有抗发炎作用。就本发明化合物的免疫刺激作用而言，其使用一种巨噬细胞株RAW264.7的细胞激素生成模式进行判定。已知巨噬细胞系组织中源自称为单核细胞(monocyte)的特定白血球的细胞。其系先天性免疫系统的一部份，其可辨识、吞噬、并摧毁诸多潜在的病原体，包括细菌、病原性原生动物、真菌、及蠕虫。和分泌细胞相同，活化的巨噬细胞对于免疫反应的调控及发炎的发展而言极为重要；其会大量生产出令人惊异群组的强力化学物质(单核因子(monokines))，包括酶、补体蛋白、以及调控因子，诸如，IL-1β、TNF-α、IL-6、及一氧化氮(NO)。巨噬细胞株(诸如小鼠RAW264.7及人类THP-1)已被推荐作为快速体外筛选免疫调控作用剂的方法(Singh，U.et al.，Clin.Chem.2005，51，2252-2256)。在本发明的实例中，本发明的化合物经证实可诱发TNF-α的自发性生成(参见实例3)；且该等化合物经证实可抑制IL-6的自发性生成(参见实例4)。
由于其绝佳的体外免疫调控活性，该化合物或其医药上可接受的盐可在用以刺激免疫力或抗发炎的医药组合物中作为活性成分。
在另一态样中，本发明提供一种医药组合物，其包含该化合物或其医药上可接受的盐，以及医药上可接受的载体。特定言的，本发明提供一种用以刺激免疫反应及/或抗发炎的免疫调节医药组合物，其包含治疗有效量的该化合物或其医药上可接受的盐。
名辞「治疗有效量」在本文中系指一种组合物的量，其可在欲治疗的对象体内诱发上述的医学目标结果。举例而言，足以降低或减少免疫细胞(例如巨噬细胞)的细胞激素(如，TNF-α、IL-6)生成的该化合物或其医药上可接受的盐的量，系为调节免疫力的有效量。在个别情形下，该治疗有效量可由熟习技艺者使用技艺中已知且已建立方法而由经验判定。
本发明的医药组合物可由习知的方法而以一或多种医药上可接受的载体制造。名辞「医药上可接受的载体」在本文中涵括任何标准的医药载体。此等载体可包括，但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
投药的途径可以任何方式投与。举例而言，其可经口服、皮下、血管内、静脉内、腹膜内、局部、经鼻、或经肺投药。
本发明的医药组合物可被制成任何适于所选投药方式的形式。举例而言，适于口服投药的组合物包括固体形式，诸如，丸剂、胶囊、颗粒、锭剂、及粉末，以及液体形式，诸如，溶液、糖浆、酊剂、及悬浮液。可用于肠外投药的形式包括无菌溶液、乳液、及悬浮液。其中可纳入本发明的组合物以进行口服或是注射投药的液体形式包括水溶液、经适当调味的糖浆、水或油悬浮液、以及以食用油(诸如，玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油)调成的乳液、以及酊剂及类似的医药载剂。
除标准的载体外，本发明的口服医药组合物可添加一或多种正常用于口服调配物中的赋形剂，诸如，界面活性剂、助溶剂、安定剂、乳化剂、增稠剂、着色剂、甜味剂、调味剂、以及防腐剂。此等赋形剂系为熟习技艺者所熟知。
本发明进一步由下例实例说明，其目的系为说明而非限制的提供。
材料及方法 一般实验流程 熔点系以Yanagimoto微熔点装置测定并未经校正。IR光谱系在Perkin-Elmer 983G分光光度计上记录。1H、13C、及DEPT光谱系在BrukerDMX-400分光光度计上取得，而二维NMR光谱系在Bruker DMX-500分光光度计上取得。EIMS、UV、及比旋光度系分别使用JEOL JMS-HX 300，HitachiS-3200分光光度计及JASCO DIP-180数位偏光计测定。萃取物首先系在硅胶(Merck 70-230筛目，230-400筛目，ASTM)上进行初步分离，再接着在LDCAnalytical-III系统上，以半制备性正常相HPLC管柱(250×10mm，7μm，LiChrosorb Si 60)进行纯化。
植物材料 牛樟芝的固态培养子实体系由伟翔生技开发股份有限公司(Well ShineBiotechnology Development，台北，台湾)辨识及提供。其凭证样本寄存于伟翔生技开发股份有限公司。
统计分析 数据系以三次独立实验的平均值±标准差表示。各处理组别间的差异显著性系在整个实验的中，使用策略应用软件(Strategic Application Software)(SASWindows 8.2版；SAS Institute Inc.，Cary，NC)，以非成对史都登氏t检验(unpairedStudent′s t test)进行分析。数据系以平均值±SD表示。p＜0.05的数值视为具有显著性。
实例1化合物的分离及定性 在室温下以MeOH(12L)浸渍牛樟芝的固态培养子实体(3.0kg)以进行萃取(4天×3)。在真空下除去MeOH后，加入水使总体积成为1L。以EtOAc(1L×3)对此悬浮相进行分离。对结合的EtOAc层进行蒸馏产生黑色糖浆(212g)。在硅胶管柱上(10×70cm，Merk 70-230筛目)，使用渐增极性的正己烷、EtOAc、及MeOH作为溶析液，对该EtOAc层的区份(200g)进行层析，取得9个区份区份1[8000mL，正己烷/EtOAc(19∶1)]，区份2[7000mL，正己烷/EtOAc(9∶1)]，区份3[6000mL，正己烷/EtOAc(8∶2)]，区份4[10000mL，正己烷/EtOAc(7∶3)]，区份5[8000mL，正己烷/EtOAc(1∶1)]，区份6[9000mL，正己烷/EtOAc(1∶3)]，区份7(8000mL，EtOAc)，区份8[7000mL，EtOAc/MeOH(1∶1)]，区份9(6000mL，MeOH)。接着进行液体-液体的分离，以取得具有抗发炎活性的EtOAc层的区份。在硅胶管柱上进行进一步的分级分离，以取得富含抗发炎活性的区份，其中该粗制萃取物及EtOAc层区份，经试验后发现对于IL-6生成可产生50％抑制的浓度分别为42及30μg/mL。对具有生物活性的区份进行进一步的化学分析，自区份6产生六种新颖的化合物。以4mL/min的正己烷/EtOAc(4∶1)作为溶析液而在正常相管柱上进行HPLC的分离，分别产生化合物1(12.5mg)、化合物2(22.6mg)、化合物3(6.8mg)、化合物4(9.4mg)、化合物5(15.0mg)、化合物6(13.2mg)、及化合物7(8.9mg)。上述的化合物1-6分别为 反式-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮(式I，其亦称为化合物1)， 反式-1-羟基-3-(4-羟苯基)-4-异丁基吡咯啶-2，5-二酮(式II，其亦称为化合物2)， 顺式-3-(4-羟苯基)-4-异丁基二氢呋喃-2，5-二酮(式III，其亦称为化合物3)， 3-(4-羟苯基)-4-异丁基-1H-吡咯-2，5-二酮(式IV，其亦称为化合物4)， 3-(4-羟苯基)-4-异丁基呋喃-2，5-二酮(式V，其亦称为化合物5)，及 二甲基-2-(4-羟苯基)-3-异丁基顺丁烯二酸二甲酯(式VI，其亦称为化合物6)。
式I至式VI化合物的1H及13C NMR数据如表1及表2所示。
表1 化合物1-6的1H NMR数据(400MHz，1-3、5-6于CDCl3中，4于CD3OD中)
表2 化合物1-6的13C光谱数据(100MHz，1-3、5-6于CDCl3中，4于CD3OD中)
实例2诸等化合物的免疫刺激作用 如Chen and Lin(Chen，M.L.et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.2007，143，21-30)所述，以夹层ELISA法测量培养上清液中的细胞激素含量。简言的，以抗细胞激素抗体(PharMingen，San Diego，CA)涂覆96孔试验盘(Nunc，Roskilde，Denmark)后在4℃下隔夜反应，并以1％BSA PBS缓冲液进行阻断30分钟。将样本及标准物(重组小鼠细胞激素，PharMingen)加入该等96孔试验盘中进行2小时的反应。加入生物素复合抗体(生物素连结大鼠抗小鼠细胞激素单株抗体，PharMingen)并进行反应。在清洗后，加入链霉亲和素复合过氧化酶处理1小时。将受质2，2′-次偶氮基-双-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，Sigma)加入各孔处理20分钟。在微盘自动分析仪中(Microplate autoreader；Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)，在405nm下对该等试验盘进行判读。
为评估此等新颖化合物的免疫刺激作用，以无或不同浓度的本发明化合物，于体外处理RAW264.7细胞，并使其细胞激素生成48小时。收集上清液以进行TNF-α分析，并收集细胞以MTT法进行存活率分析。数据系以三次独立实验(其各有三次重复)的平均值±SD显示。
如表3所示，化合物1显著增加RAW264.7细胞的自发性TNF-α分泌而不影响细胞存活率，其显示化合物1具有活化巨噬细胞的潜力。由0.5～5μg/mL的化合物1刺激RAW264.7细胞产生的TNF-α分泌量系以剂量相关形式增加。此等数据显示，化合物1可刺激巨噬细胞分泌TNF-α而无细胞毒性。
表3 来自牛樟芝的分离物对于RAW264.7细胞的存活率及自发性TNF-α分泌的作用
*p＜0.05；**0.05＜p＜0.1；与控制组(无萃取物处理)的差异显著性。
实例3诸等化合物的抗发炎作用 IL-6(一种系感染时具指标性的促发炎细胞激素)系由巨噬细胞在诸多感染及发炎状态下分泌，包括心脏手术、心源性休克、冠状动脉绕道、及细菌性败血症(Kantar，M.et al.，Eur.J.Pediatr.2000，159，156-157)。已有研究报导IL-6的血清浓度与疾病的严重性具相关性(Pathan，N.et al.，Lancet 2004，363，203-209)。兹测量经LPS-刺激的巨噬细胞的IL-6生成，以评估诸等化合物的抗发炎作用。将该等细胞以牛樟芝的分离物预处理30分钟，接着以50ng/mL的LPS刺激48小时。收集上清液进行TNF-α及IL-6分析，并收集细胞以MTT法进行存活率分析。数据系以平均值±SD显示。
如表4所示，此等化合物并未影响RAW264.7巨噬细胞株的存活率。当该等细胞经LPS刺激时，处理化合物1的组别，其IL-6生成随剂量渐增而显著减少。化合物1对IL-6生成产生50％抑制所需的浓度(IC50)系10μg/mL。化合物3、4、及6亦可抑制IL-6生成，IC50值分别为17、18、及25μg/mL。化合物2及5的IC50值分别为54及96μg/mL。
表4 来自牛樟芝的分离物对于经LPS-刺激的RAW264.7巨噬细胞的存活率、TNF-α、及IL-6分泌的作用
*p＜0.05；**0.05＜p＜0.1；与控制组(无萃取物处理)的差异显著性。
权利要求
1.一种化合物或其医药上可接受的盐，其中该化合物为选自由下列者所组成的群
式I
式II
式III
式IV
式V
及
式VI
其中R独立系H、
、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、或
，其中X＝H、OH、OR、NH2、或NHR(其中R＝烷基或酰基)。
2.依权利要求1的化合物或其医药上可接受的盐，其中该化合物为选自由下列者所组成的群
反式-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮，反式-1-羟基-3-(4-羟苯基)-4-异丁基吡咯啶-2，5-二酮，顺式-3-(4-羟苯基)-4-异丁基二氢呋喃-2，5-二酮，3-(4-羟苯基)-4-异丁基-1H-吡咯-2，5-二酮，
3-(4-羟苯基)-4-异丁基呋喃-2，5-二酮，及二甲基-2-(4-羟苯基)-3-异丁基顺丁烯二酸二甲酯。
3.依权利要求1的化合物或其医药上可接受的盐，其中该化合物具有免疫刺激作用。
4.依权利要求1的化合物或其医药上可接受的盐，其中该化合物具有抗发炎作用。
5.依权利要求1的化合物或其医药上可接受的盐，其中该化合物同时具有免疫刺激及抗发炎作用两者。
6.依权利要求3、4、或5的化合物或其医药上可接受的盐，其中该化合物为反式-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮。
7.一种医药组合物，其包含依权利要求1或2的化合物或其医药上可接受的盐，以及医药上可接受的载体。
8.依权利要求7的医药组合物，其提供免疫刺激作用。
9.依权利要求7的医药组合物，其提供抗发炎作用。
10.依权利要求7的医药组合物，其同时提供免疫刺激及抗炎作用两者。
11.一种依权利要求1或2的化合物或其医药上可接受的盐用于制备刺激免疫反应的医药的用途。
12.依权利要求11的用途，其中该化合物系
反式-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮。
13.一种依权利要求1或2的化合物或其医药上可接受的盐用于制备抗发炎的医药的用途。
14.依权利要求13的用途，其中该化合物为
反式-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮，顺式-3-(4-羟苯基)-4-异丁基二氢呋喃-2，5-二酮，3-(4-羟苯基)-4-异丁基-1H-吡咯-2，5-二酮，及
二甲基-2-(4-羟苯基)-3-异丁基顺丁烯二酸二甲酯。
15.一种依权利要求1或2的化合物或其医药上可接受的盐用于制备刺激免疫反应及抗发炎的免疫调节医药的用途。
16.依权利要求15的用途，其中该化合物为
反式-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2，5-二酮。
全文摘要
本发明提供具有免疫刺激性及抗发炎性化合物或其医药上可接受的盐。该等化合物系分离自固态培养中的牛樟芝(A.camphorata)子实体。其亦提供用以制备刺激免疫力及/或抗发炎的免疫调节医药的用途。
文档编号C07D207/40GK101759626SQ20091022410
公开日2010年6月30日 申请日期2009年11月23日 优先权日2008年11月21日
发明者郭悦雄, 林璧凤 申请人:伟翔生技开发股份有限公司