专利名称：一种多肽免疫原及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽免疫原及其制备方法，以及该多肽免疫原在制备用于治疗 HBV慢性感染持续状态及其相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药物中的应用，属于 医药技术领域。
背景技术：
乙型病毒性肝炎是危害全人类健康的传染性疾病之一。全球乙型肝炎病毒感染者 约占人群的30%，慢性肝炎患者约3.5亿。我国属高流行区，乙型肝炎病毒的携带者约占人 口的10% (1. 3亿)，慢性肝炎患者约0. 3亿，如其迁延不愈则可发展为肝硬化、肝癌。
目前控制乙型肝炎流行的主要方法是注射预防性乙肝疫苗，但其对乙肝病毒感染 者无效，且因种种原因接种率也不是很高，因此，在今后相当长时期内，乙型肝炎仍将是危 害人类健康的重要疾病之一。 目前已经证实HBV作为一种嗜肝病毒，并不能直接引起肝细胞损伤，其感染的病 理和临床后果取决于免疫机制。 作为细胞内感染，慢性持续性感染状态主要与机体细胞免疫应答太弱有关。其中， HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反应决定了HBV感染的 最终结果。感染HBV后CTL活性高者体内病毒被清除而痊愈；CTL活性低或测不到的感染 者则发展为慢性持续感染状态，并进一步发展为肝硬化或肝癌。 因此，打破HBV持续感染患者的免疫耐受状态，在体内启动HBV特异性CTL反应，
可治疗HBV慢性感染持续状态及防止其相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病。 美国的一家研究机构在自己研究的基础上分别申请了 4项美国专利。这些专利的
主要内容是关于在HBV抗原上所确定的CTL表位。这些表位分别来源于核心抗原、表面抗
原、多聚酶和X抗原。这些部位或结构，是HBV所诱导的CTL所识别的部位。我国科研人员
闻玉梅发现抗原-抗体免疫原性复合物可以有效地在部分鸭中清除病毒及疾病抗原，由此
认为发展成为供人体应用的治疗性疫苗是有可能的。 当前，对HBV慢性持续感染状态(包括病毒携带者、慢性迁延性肝炎和慢性活动性 肝炎)尚无特效治疗方法。干扰素和拉米呋定虽有特定的治疗效果，但并不能清除病毒。因 此，目前急需寻求有效治疗HBV慢性持续感染状态的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽免疫原及其制备方法。 本发明的另一目的在于提供了该多肽免疫原在制备用于治疗HBV慢性感染持续 状态及其相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药物中的应用。 本发明所述多肽免疫原，含有一个多肽序列，该多肽序列含有氨基酸序列1、氨基 酸序列2、氨基酸序列3和氨基酸序列4，其中，各氨基酸序列之间由若干个氨基酸残基组成 的连接肽段连接或直接共价连接；所述的氨基酸序列1是Th细胞表位序列或Th细胞表位序列与艾滋病毒HIV-l来源的TAT蛋白的碱性区域序列共价相连构成的混合序列；所述的 氨基酸序列2是艾滋病毒HIV-l来源的TAT蛋白的碱性区域序列；所述的氨基酸序列3是 乙型肝炎病毒来源的CTL表位序列或乙型肝炎病毒来源的CTL表位序列与艾滋病毒HIV-l 来源的TAT蛋白的碱性区域序列共价相连构成的混合序列；所述的氨基酸序列4是乙型肝 炎病毒来源的B细胞表位序列或乙型肝炎病毒来源的B细胞表位序列与艾滋病毒HIV-l来 源的TAT蛋白的碱性区域序列共价相连构成的混合序列。 本发明所述的多肽序列从N端到C端的排列次序可以是氨基酸序列1、氨基酸序列
2、氨基酸序列3、氨基酸序列4的任意组合，其中，优选的排列次序为 氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列4、 氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4-氨基酸序列2、 氨基酸序列1-氨基酸序列4-氨基酸序列2-氨基酸序列3、 氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4、 和氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4， 其中当氨基酸序列2存在时，氨基酸序列1、3、4不能为混合序列； 当排列次序为氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4时，氨基酸序列1、氨基
酸序列3、氨基酸序列4中至少含有一混合序列。 本发明所述的氨基酸序列1是破伤风类毒素来源的Th细胞表位上的 第830-843氨基酸序列QYIKANSKFIGITE或通用Th细胞表位PADRE或混合序列 RKKRRQRRRQYIKANSKFIGITE或混合序列RKKRRQRRRPADRE ;所述氨基酸序列2是HIV-l TAT蛋白中第48-60氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ或第49-57氨基酸序列RKKRRQRRR或 第48-57氨基酸序列GRKKRRQRRR ;所述的氨基酸序列3是HBV核心抗原上的第18-27氨 基酸序列FLPSDFFPSV或混合序列RKKRRQRRRFLPSDFFPSV ;所述氨基酸序列4是HBV Pre S2来源的B细胞表位上的第14-26氨基酸序列DPRVRGLYFPAGG或第14-30氨基酸序列 DPRVRGLYFPAGGVSFG或混合序列RKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG。 本发明所述的各氨基酸序列之间的连接肽段为AAA、 GGG或SSS ;所述的多肽免疫 原其N端氨基酸序列的N端上连接着修饰性连接肽段KSS ;所述的修饰性连接肽段KSS的N 端的赖氨酸残基的a或e氨基上分别或同时共价连接着棕榈酰基。
本发明所述的多肽免疫原，可以有多种多肽序列，其中优选的多肽序列为
多肽1)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADRESSSGRKKRRQRRRPPQAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRG LYFPAGGVSFG(多肽2)、
AGGVSFG(多肽3)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSQYIKANSKFIGITEAAAGRKKRRQRRRPPQAAAFLPSDFFPSV GGGDPRVRGLYFPAGGVSFG(多肽4)、 CH3 (CH2) 14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRPPQ (多肽5)、
CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRR RPPQ(多肽6)、
54C0)SSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGG
4C0)SSGRKKRRQRRRPPQSSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRG CH3 (CH2) (多肽7)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) GRKKRRQRRRPPQ(多肽8)、
CH3(CH2) 多肽9)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) LYFPAGGVSFG(多肽10)、
CH3 (CH2) AGGVSFG(多肽11)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSGRKKRRQRRRPPQSSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSV GGGDPRVRGLYFPAGGVSFG(多肽12)、CH3 (CH2) 14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGRKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG (多肽13)
CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGRKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGG VSFG(多肽14)、
CH3 (CH2)
CH3(CH2) 多肽16)。 —种多肽免疫原的制备方法，包括以下步骤
a.多肽固相合成所述多肽免疫原_树脂，所述多肽免疫原 的多肽免疫原； b.对多肽免疫原_树脂进行裂解，得到裂解液； c.将裂解液采用体积排阻层析进行初步分离纯化，然后通过反向层析纯化得到多 肽免疫原。 多肽免疫原在制备用于治疗HBV慢性感染持续状态及其相关的继发性肝硬化、肝 癌疾病的疫苗或药物中的应用。 所述的HBV慢性感染持续状态为慢性乙型肝炎或乙型肝炎病毒携带者。
所述的疫苗或药物还含有药学上可接受的辅料、佐剂和载体。
所述的疫苗或药物的给药方式为注射给药。
本发明常用氨基酸英文縮写含义为
COKSSPADREGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRFLPSDFFPSV(多肽15)或 fOK (CH, (CH2) 14C0) SSPADREGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRFLPSDFFPSV (
树脂表示与树脂结合
A Ala丙氨酸
D Asp天冬氨酸
E Glu谷氨酸
F Phe苯丙氨酸
G Gly甘氨酸
I lie异亮氨酸
K Lys赖氨酸
L Leu亮氨酸
N Asn天冬酰胺酸
P Pro 脯氨酸
Q Gin谷氨酰胺酸
R Arg精氨酸
S Ser 丝氨酸
T Thr 苏氨酸
V Val 缬氨酸
Y Tyr 酪氨酸 本发明采用固相化学合成方法制备该种免疫原，确定了反应体系的最佳温度、投 料比、肽树脂裂解方法和时间、纯化条件等因素。 在本发明方法中，当反应温度在30-4(TC时，采用HOBT/DCC偶联策略，氨基酸序 列连续合成，原料和树脂的最佳摩尔投料比为3 : l，每个氨基酸或组分平均偶联效率达 99. 5%以上；肽树脂裂解采用三氟乙酸法，最佳裂解时间为90分钟。 纯化采用两步法(l)采用体积排阻层析法初步纯化，二甲基亚砜(DMSO)为流 动相，最佳柱温为20-4(TC ;(2)采用反相层析法高度纯化，研究了其最佳上样条件、最佳 层析填料、最佳柱温等因素。在本发明方法中，最佳层析填料是POROS 50 Rl，最佳柱温为 22-34 。C。 经乙醇溶液剂型、脂质体混悬液体剂型、脂质体冻干剂型的比较，证明脂质体剂型 在诱导Thl极化和诱导CTL活性方面优于乙醇溶液剂型，皮下注射疼痛感明显减轻；脂质体 冻干剂型在稳定性方面明显优于脂质体混悬液剂型。 本发明设定所述多肽免疫原的脂质体注射液最佳处方。其中，含有上述多肽免疫 原、大豆磷脂、棕榈酸、维生素E和胆固醇。 本发明所述脂质体冻干剂型除含上述多肽免疫原、磷脂、胆固醇、棕榈酸、维生素E 外，还含有人白蛋白、甘露醇和磷酸盐。 本发明所述多肽免疫原及其剂型，可以使用任何一种公知的免疫方式，例如皮下 注射、皮内注射、腹腔注射、静脉注射等。免疫剂量可以是0. Olnmol至20nmol，可以不使用 另外的佐剂。用于免疫HBV转基因小鼠可以剂量依赖性方式剌激淋巴细胞活化和增殖，Thl 极化和CTL应答，并抑制HBV复制，血中HBV DNA拷贝数下降，HbsAg和HbeAg滴度下降或 消失。该效力为单独使用单表位多肽或多表位多肽所不能达到的。 本发明以乙型肝炎抗原表位图谱为基础，确定了具有特定骨架结构的多肽免疫 原。该多肽免疫原在HBV转基因小鼠体内能有效激发Thl极化反应、HBV特异性CTL反应 和抑制HBV的复制。实验结果表明上述多肽免疫原可开发成为一种新型乙型肝炎及其继发 性肝硬化、肝癌的治疗用疫苗或药物。
具体实施例方式
以下实施例仅用于解释本发明，但不能因此限制本发明。 实施例1 多肽免疫原合成通法 采用Fmoc固相化学合成方法。固定羧基端，由C端向N端延伸肽链，在合成仪 上进行。Fmoc氨基酸为原料，上样量为0. 75mmol，侧链保护氨基酸Ser(tBU) 、 Thr(tBU)、Tyr (tBU) 、 Gin (Trt) 、 Asp (OtBU) 、 Glu (OtBU) 、 Arg (pbf) 、 Asn (Trt) 、 Lys (Boc)，选用Wang-树 脂为固相载体，上样量0.25mmol，原料和树脂摩尔比为3 : 1，偶联到树脂上的第一个氨基 酸采用DIC/HOBT法偶联，其余氨基酸和棕榈酸的活化及其偶联采用HOBT/DCC法。
实施例2
多肽免疫原裂解通法选用TFA裂解液(0. 75g苯酚、0. 25ml乙二硫醇、0. 5ml苯甲硫醚、0. 5ml去离子水、
10. OmlTFA)，可最大限度的抑制副反应的发生。反应浓度40mg/ml (40mg指的是实施例1合
成得到的多肽免疫原_树脂的质量，ml指的是裂解液的体积)，反应温度为25°C ，反应时间
为1. 5小时。将多肽分子从树脂上切割下来，乙醚沉淀，旋转蒸发得粗肽产品。 实施例3 多肽免疫原初步纯化通法 将粗肽产品采用SEC加样55.0ml，进行多肽分子的初步纯化。层析条件层析系
统P-6000泵及AKTA印lorer 100 ;层析柱直径25mrn，柱长850mm ;±真料S印hadex LH20 ;
流动相DMSO ;流速2. Oml/min。得到较好的纯化结果。 实施例4 多肽免疫原纯化通法 采用层析柱APS 50/275 POROS 50 Rl进行批量制备。肽树脂经过裂解和初步纯 化后，收集样品分成7次进行高度纯化。层析条件层析系统AKTAe邓lorerlOO ;样品浓 度10. 52mg/ml ;加样量11. Oml ;层析柱直径50mm，柱长275mm ;±真料POROS 50 Rl ;柱 温34°C ;流动相A :30%乙醇-lOmmol/L磷酸；流动相B :90%乙醇-lOmmol/L磷酸；梯度 0-50% B，5CV ;50-100% B，O. 5CV ;100-100% B，O. 5CV ;流速100. Oml/min。将收集的洗脱 峰合并液混匀后，存放于-2(TC备用。本品的纯度为98. 5%，收率为85%。
实施例5 在HBV转基因小鼠诱导Thl极化 采用HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1. 3Kb)传染昆明种小鼠)。将动物 随机分组，每组10只，于双侧肋下和后脚掌皮下注射多肽5，按10、 100和1000U/鼠的3个 剂量给药，每周加强免疫一次，共三次。设IFN-a2b(15000U/鼠)为阳性对照药，设生理盐 水为阴性对照药。给药前和最后一次给药结束后10天、20天、30天，取小鼠脾脏，分离脾脏 淋巴细胞，用试品10ng/ml体外剌激3天，取上清，用ELISA法检测培养上清中IFN-y 、IL-4 等细胞因子的分泌情况，分析受试药物体内诱导T细胞Thl/Th2型极化的功效。结果可检 测到较强的IFN-y分泌，IL-4的检测未见明显的剂量-效应关系。
实施例6 在HBV转基因小鼠诱导CTL活性 采用HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1. 3Kb)传染昆明种小鼠)。将动物 随机分组，每组10只，于双侧肋下和后脚掌皮下注射多肽5，按10、 100和1000U/鼠的3个 剂量给药，每周加强免疫一次，共三次。设IFN-a2b(15000U/鼠)为阳性对照药，设生理盐 水为阴性对照药。给药前和最后一次给药结束后10天、20天、30天，取小鼠脾脏，分离脾脏 淋巴细胞，用试品10ng/ml体外剌激3天，用ELI-SPOT法检测IFN- y分泌细胞在外周血淋 巴细胞中的表达频率。结果表明，在结束免疫后第30天，随着免疫剂量的升高，外周血淋巴细胞中IFN-y分泌细胞的表达频率升高，其中100和1000U/鼠的免疫剂量，体内诱导外周 血淋巴细胞中IFN-y分泌细胞的表达频率升高明显，最高可检测到3600士IFN-y分泌细 胞/106PBMC.
实施例7 在HBV转基因小鼠抑制病毒表面抗原(HbsAg) 采用HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1. 3Kb)传染昆明种小鼠)。将动物 随机分组，每组10只，于双侧肋下和后脚掌皮下注射多肽5，按10、 100和1000U/鼠的3个 剂量给药，每周加强免疫一次，共三次。设IFN-a2b(15000U/鼠)为阳性对照药，设生理盐 水为阴性对照药。给药前和最后一次给药结束后10天、20天、30天，取血，分离血清，分别 用ELISA法测定血清中HbsAg。结果表明血清HbsAg明显降低，且呈剂量依赖性和时间依赖 性。 实施例8 在HBV转基因小鼠抑制病毒复制 采用HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1. 3Kb)传染昆明种小鼠)。将动物 随机分组，每组10只，于双侧肋下和后脚掌皮下注射多肽5，按10、100、1000U/鼠的3个剂 量给药，每周加强免疫一次，共三次。设IFN-a2b(15000U/鼠)为阳性对照药，设生理盐水 为阴性对照药。给药前和最后一次给药结束后10天、20天、30天，取血，分离血清，分别用 定量PCR法检测血清中HBV DNA拷贝数。结果表明血清HBV DNA拷贝数明显降低，且呈剂 量依赖性和时间依赖性。
序列表
〈110〉张，嘎 〈120〉 一种多肽免疫原及其制备方法和应用
〈130〉
〈160>16 〈170>PatentIn version 3. 4 〈210>1 〈211>57 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈220〉 〈221>M0D_RES 〈222〉 (1) (1) 〈223>棕榈酰化〈400>1 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ser Ser Ser Gly Arg Lys Lys Arg
15 10 15Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
20 25 30 Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
9:0117] 35 40 45
:0118] Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser Phe Gly
:0119] 50 55
:0120] 〈210>2
:0121] 〈211>57
:0122] 〈212>PRT
:0123] 〈213>人工序列
:0124] 〈220〉
:0125] 〈221〉M0D一RES
:0126] <222>(1). . (1)
:0127] 〈223〉双棕榈酰化
:0128] 〈400>2
:0129] Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ser Ser Ser Gly Arg Lys Lys Arg
:0130] 15 10 15
:0131] Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
:0132] 20 25 30
:0133] Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
:0134] 35 40 45
:0135] Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser Phe Gly
:0136] 50 55
:0137] 〈210>3
:0138] 〈211>66
:0139] 〈212>PRT
:0140] 〈213>人工序列
:0141] 〈220〉
:0142] 〈221〉M0D一RES
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:0144] 〈223>棕桐酰化
:0145] 〈400>3
:0146] Lys Ser Ser Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr
:0147] 15 10 15
:0148] Glu Ala Ala Ala Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro
:0149] 20 25 30
:0150] Gin Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly
:0151] 35 40 45
:0152] Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser
:0153] 50 55 60
:0154] Phe Gly 650156]〈210〉4
0157]<211>66
0158]〈212>PRT
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0163]〈223〉双棕榈酰化
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0172]50
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:0193]〈211>50
:0194]〈212>PRT
Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr
5 10 15
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro
25 30 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly
40 45 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser 55 60
Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
5 10 15
Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
25 30
Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro
40 459/13页
:0195] 〈213>人工序列
:0196] 〈220〉
:0197] 〈221>M0D_RES
:0198] 〈222〉 (1) (1)
:0199] 〈223〉双棕榈酰化
:0200] 〈400>6
:0201] Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
:0202] 15 10 15
:0203] Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
:0204] 20 25 30
:0205] Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro
:0206] 35 40 45
:0207] Pro Gin
:0208] 50
:0209] 〈210>7
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:0216] 〈223>棕榈酰化
:0217] 〈400>7
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:0219] 15 10 15
:0220] Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly
:0221] 20 25 30
:0222] Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg
:0223] 35 40 45
:0224] Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin
:0225] 50 55
:0226] 〈210>8
:0227] 〈211>59
:0228] 〈212>PRT
:0229] 〈213〉人工序列
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:0231] 〈221>M0D_RES
:0232] 〈222〉 (1) (1)
:0233] 〈223〉双棕榈酰化
<400>8 Lys Ser Ser Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr 15 10 15 Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly 20 25 30 Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg 35 40 45 Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin 50 55 〈210>9 〈211>57 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>M0D_RES 〈222>(1). . (1) 〈223〉棕榈酰化 〈400>9 Lys Ser Ser Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin 15 10 15 Ser Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp 20 25 30 Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr 35 40 45 Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser Phe Gly 50 55 〈210>10 〈211>57 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>M0D_RES 〈222〉 (1)(1) <223>双棕榈酰化 〈400>10 Lys Ser Ser Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin 15 10 15 Ser Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
20 25 30
Phe Phe Pro SerVal Gly GlyGly Asp Pro Arg Val ArgGlyLeu Tyr3540 45Phe Pro Ala GlyGly Val SerPhe Gly5055〈210>11〈211>66〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈221>M0D_RES〈222>(1).. (1)〈223〉棕榈酰化<400>11Lys Ser Ser GlyArg Lys LysArg Arg Gin Arg Arg ArgProPro Gin151015Ser Ser Ser GinTyr lie LysAla Asn Ser Lys Phe lieGlylie Thr202530Glu Ala Ala AlaPhe Leu ProSer Asp Phe Phe Pro SerValGly Gly3540 45Gly Asp Pro ArgVal Arg GlyLeu Tyr Phe Pro Ala GlyGlyVal Ser505560Phe Gly65〈210>12〈211>66〈212>PRT〈213〉人工序列<220>〈221〉M0D_RES〈222〉 (1) . (1)〈223〉双棕榈酰化〈400>12Lys Ser Ser GlyArg Lys LysArg Arg Gin Arg Arg ArgProPro Gin151015Ser Ser Ser GinTyr lie LysAla Asn Ser Lys Phe lieGlylie Thr202530Glu Ala Ala AlaPhe Leu ProSer Asp Phe Phe Pro SerValGly Gly3540 45Gly Asp Pro ArgVal Arg GlyLeu Tyr Phe Pro Ala GlyGlyVal Ser
14
50 55 60 Phe Gly 65 〈210>13 〈211>50 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈220〉 〈221〉M0D_RES 〈222〉 (1) (1) 〈223〉棕榈酰化 〈400>13 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp 1 5 10 15 Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg 20 25 30 Arg Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser 35 40 45 Phe Gly 50 〈210>14 〈211>50 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈220> <221>M0D_RES 〈222〉 (1) (1) 〈223〉双棕榈酰化 〈400〉 14 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp 1 5 10 15 Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg 20 25 30 Arg Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser 35 40 45 Phe Gly 50 〈210>15 〈211>44
〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>M0D—RES 〈222>(1). . (1) 〈223〉棕榈酰化 〈400〉 15 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg 15 10 15 Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg 20 25 30 Arg Arg Phe Leu Pro SerAsp Phe Phe Pro Ser Val 35 40 <210>16 〈211>44 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>M0D—RES 〈222>(1). . (1) <223>双棕榈酰化 〈400〉 16 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg 15 10 15 Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg
20 25 30 Arg Arg Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
35 40
权利要求
一种多肽免疫原，其特征在于，所述多肽免疫原含有一个多肽序列，所述的多肽序列含有氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3和氨基酸序列4，其中，各氨基酸序列之间由若干个氨基酸残基组成的连接肽段连接或直接共价连接；所述的氨基酸序列1是Th细胞表位序列或Th细胞表位序列与艾滋病毒HIV-1来源的TAT蛋白的碱性区域序列共价相连构成的混合序列；所述的氨基酸序列2是艾滋病毒HIV-1来源的TAT蛋白的碱性区域序列；所述的氨基酸序列3是乙型肝炎病毒来源的CTL表位序列或乙型肝炎病毒来源的CTL表位序列与艾滋病毒HIV-1来源的TAT蛋白的碱性区域序列共价相连构成的混合序列；所述的氨基酸序列4是乙型肝炎病毒来源的B细胞表位序列或乙型肝炎病毒来源的B细胞表位序列与艾滋病毒HIV-1来源的TAT蛋白的碱性区域序列共价相连构成的混合序列。
2. 根据权利要求1所述的多肽免疫原，其特征在于，所述的多肽序列从N端到C端的排 列次序为氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列4、氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4-氨基酸序列2、氨基酸序列1-氨基酸序列4-氨基酸序列2-氨基酸序列3、氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4、和氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4，其中当氨基酸序列2存在时，氨基酸序列1、3、4不能为混合序列；当排列次序为氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4时，氨基酸序列1、氨基酸序列3、氨基酸序列4中至少含有一混合序列。
3. 根据权利要求1或2所述的多肽免疫原，其特征在于，所述的氨基酸序列1是破伤 风类毒素来源的Th细胞表位上的第830-843氨基酸序列QYIKANSKFIGITE或通用Th细胞 表位PADRE或混合序列RKKRRQRRRQYIKANSKFIGITE或混合序列RKKRRQRRRPADRE ;所述氨基 酸序列2是HIV-1TAT蛋白中第48-60氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ或第49-57氨基酸序列 RKKRRQRRR或第48-57氨基酸序列GRKKRRQRRR ;所述的氨基酸序列3是HBV核心抗原上的 第18-27氨基酸序列FLPSDFFPSV或混合序列RKKRRQRRRFLPSDFFPSV ;所述氨基酸序列4是 HBV Pre S2来源的B细胞表位上的第14-26氨基酸序列DPRVRGLYFPAGG或第14-30氨基酸 序列DPRVRGLYFPAGGVSFG或混合序列RKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG。
4. 根据权利要求1或2所述的多肽免疫原，其特征在于，所述的各氨基酸序列之间的连 接肽段为AAA、 GGG或SSS ;所述的多肽免疫原N端氨基酸序列的N端上连接着修饰性连接 肽段KSS;所述的修饰性连接肽段KSS的N端的赖氨酸残基的a或e氨基上分别或同时 共价连接着棕榈酰基。
5. 根据权利要求1所述的多肽免疫原，其特征在于，所述多肽序列为CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADRESSSGRKKRRQRRRPPQAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFP AGGVSFG、SFG、CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSQYIKANSKFIGITEAAAGRKKRRQRRRPPQAAAFLPSDFFPSVGGGD PRVRGLYFPAGGVSFG、CH3 (CH2)14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRPPQ、CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRPPQ、4C0K (CH, (CH2) 14C0) SSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKK4C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSGRKKRRQRRRPPQSSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPCH3 (CH2)CH3 (CH2) RRQRRRPPQ、CH3 (CH2)CH3 (CH2) AGGVSFG、CH3 (CH2) SFG、CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSGRKKRRQRRRPPQSSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGD PRVRGLYFPAGGVSFG、CH3(CH2)14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGRKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG、CH, (CH2) 14C0K (CH, (CH2) 14C0) SSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGRKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG、CH3 (CH2) 14COKSSPADREGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRFLPSDFFPSV或CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADREGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRFLPSDFFPSV。
6. —种如权利要求1、2或5所述的多肽免疫原的制备方法，其特征在于包括以下步骤a. 多肽固相化学合成多肽免疫原-树脂，b. 采用三氟乙酸法对多肽免疫原-树脂进行裂解，得到裂解液，c. 将裂解液采用体积排阻层析进行分离纯化，然后通过反向层析纯化得到多肽免疫原。
7. 如权利要求1、2或5所述的多肽免疫原在制备用于治疗HBV慢性持续感染状态及其 相关的继发性肝硬化、肝癌疾病的疫苗或药物中的应用。
8. 如权利要求7所述的多肽免疫原在制备用于治疗HBV慢性持续感染状态及其相关的 继发性肝硬化、肝癌疾病的疫苗或药物中的应用，其特征在于所述HBV慢性感染持续状态 为慢性乙型肝炎或乙型肝炎病毒携带者。
9. 如权利要求7所述的多肽免疫原在制备用于治疗HBV慢性持续感染状态及其相关的 继发性肝硬化、肝癌疾病的疫苗或药物中的应用，其特征在于，所述的疫苗或药物还含有药 学上可接受的辅料、佐剂和载体。
10. 如权利要求7所述的多肽免疫原在制备用于治疗HBV慢性持续感染状态及其相关 的继发性肝硬化、肝癌疾病的疫苗或药物中的应用，其特征在于所述的疫苗或药物的给药 方式为注射给药。
全文摘要
本发明公开了一种多肽免疫原及其制备方法。该多肽免疫原含有一个多肽序列，该多肽序列含有氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3和氨基酸序列4。其中，各氨基酸序列之间由若干个氨基酸残基组成的连接肽段连接或直接共价连接。本发明还提供了该多肽免疫原在制备用于治疗HBV慢性感染持续状态及其相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药物中的应用。
文档编号C07K1/04GK101717433SQ20091022736
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者冯长访, 张嘎, 张贲, 韩斌 申请人:张嘎