专利名称：：一种工程蝇凝集素的高效纯化方法
技术领域：
：本发明属于化学分离
技术领域：
，涉及一种凝集素，尤其是一种工程蝇凝集素的高效纯化方法。
背景技术：
：凝集素有多种生物学活性，广泛用于医药、食品、保鲜等行业，凝集素对机体免疫有双重调节作用，能够促进机体对肿瘤细胞的识别与清除，凝集素单独作用于肿瘤细胞能够引起肿瘤细胞凋亡，对于病毒在体内复制也有很好的抑制作用，还能促进炎症后机体的恢复过程。从工程蝇体内提取的凝集素是一种糖蛋白，其生物活性功能与其分子量、分子结构、糖链的组分都有密切的关系，并使其具有特定的生物学功能，如抗肿瘤特性，对免疫应答、免疫低下、免疫疾病也有很好的调节作用。目前工业上运用最为广泛凝集素是刀豆凝集素，但是由于提取得率低而且价格昂贵，如何高效提取凝集素组分是一亟待解决的问题。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种提取率高、方法简单的工程蝇凝集素的高效纯化方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的—种工程蝇凝集素的高效纯化方法，纯化的步骤是(1)对工程蝇的幼虫进行诱导，待幼虫化蛹后，收集蛹，除去饲养过程中混入的杂质，清水漂洗，收集漂洗干净的蛹，加提取溶剂研磨，3-5t:静置0.8-1.2h，得到浸提液备用；(2)由步骤(1)得到的浸提液，离心，过滤除去杂质，重复离心、过滤步骤2-4次，收集过滤后的上清液，经过石油醚的抽提，得到的浓縮液备用；(3)将步骤(2)得到的浓縮液在4-4(TC条件下与胶混合，每30min缓慢搅拌一次，3.5-4.5h后装柱，缓冲液平衡，缓冲液洗脱流速控制在0.8-1.2mL/min，洗脱杂蛋白，之后进行糖溶液竞争性洗脱，竞争性洗脱液流速控制在0.5mL/min，收集洗脱峰；(4)将收集到洗脱峰过S印hadeXG200凝胶柱，先后检测到四个峰值，分别对各个峰的成分进行回收、冷冻、干燥，得到白色粉末即为凝集素。而且，所述步骤(1)中幼虫化蛹的化蛹率为80%。而且，所述步骤(1)的提取溶剂为生理盐水或者昆虫缓冲液BIS。而且，所述步骤(3)中混胶使用的是S印harose4B。而且，所述步骤(4)的缓冲液为昆虫缓冲液BIS。而且，所述步骤(4)的竞争性洗脱液为D-半乳糖溶液0.2-0.3moL/L。本发明的优点和积极效果是1、本发明以工程蝇为原料，工程蝇凝集素具有糖结合专一性，其配基能与凝集素结合，适合采用特异性纯化，利用色谱分离技术对其进行提取、分离、纯化，并且工程蝇凝集素在4(TC下稳定，适合室温提取，提取方法不仅简单而且实用，适合大规模工业生产。2、本发明提取的工程蝇凝集素是一种具有不同的分子量、结合特异性的大分子物质，其分子量从68kD-22kD之间，由多种氨基酸组成，冻干后样品为白色粉末，易溶于水，难溶于有机溶剂，如乙醇、乙醚、甲醛等，保藏方便，再利用方便。图1为本发明工程蝇蛹提取液的亲和层析图；图2为本发明电泳分析凝集素纯度及分子量非变性电泳，图中M为标准蛋白质样品；1为经R-250染色的样品；图3为本发明凝集素SDS-PAGE电泳图，M为标准蛋白质样品，I为加入P-巯基乙醇。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。—种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其纯化的步骤是(1)利用工程蝇传代，得到性状稳定的子代，收集工程蝇子代的蛹，为提高子代繁殖率与性状稳定，要求饲养环境24°C_301:，湿度控制在60%左右，室内饲养环境达到清洁级，饲料为高营养、高能量饲料。对工程蝇的幼虫进行诱导，待幼虫化蛹后(80%化蛹)，收集蛹，除去饲养过程中混入的杂质，用清水漂洗5次，收集漂洗干净的蛹，以昆虫缓冲液BIS或者生理盐水做为蛹糖蛋白的提取溶剂，加5倍蛹体积的BIS或者生理盐水进行研磨，4t:静置lh，得到浸提液备用；注意用生理盐水做为蛹糖蛋白提取溶剂时，温度应控制在4t:，此时能抑制蛹体内一些蛋白酶对糖蛋白的降解，以提高产物的得率。(2)由步骤(1)得到的浸提液，先经过12000rpm离心15min，过滤除去几丁质、脂肪等杂质，重复离心、过滤步骤3次，收集过滤后的上清液，经过石油醚的抽提，得到的浓縮液备用；其中石油醚抽提，处理温度控制在4(TC以下，处理30min以上，可有效除去脂质。(3)将步骤(2)得到的浓縮液在4°C-4(rC条件下与S印harose4B琼脂糖凝胶进行混合，每30min缓慢搅拌一次，4h后装柱，昆虫缓冲液BIS平衡，缓冲液洗脱流速控制在lmL/min，洗脱杂蛋白，并且亲和目的蛋白，然后进行糖溶液竞争性洗脱，竞争性洗脱液D-半乳糖溶液0.2-0.3moL/L，流速控制在0.5mL/min，收集洗脱峰；其中色谱柱起到除杂蛋白质、亲和目的蛋白的目的，当糖蛋白被洗脱时，可以得到与单糖有专一性结合的物质。(4)将收集到的步骤(3)的洗脱液过S印hadeXG200凝胶柱，先后检测到四个峰值，分别对其进行回收、冷冻、干燥，得到白色粉末为凝集素纯品，其纯度达到90%以上。其中收集洗脱液通过G-200凝胶注，按分子量大小收集各组分，实验证明各组分有多种生物学功能，如免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等。4本发明的生物学功能检测实验情况1、对正常小鼠实验表明，凝集素在非特异性免疫，细胞免疫，体液免疫三方面有一定调节作用。不同浓度的凝集素对脾脏淋巴细胞增殖能力都具有一定的促进作用。1200iig/mL浓度组具有极显著差异。2、对于免疫低下小鼠的碳粒廓清实验中，治疗组中，高剂量组有显著性差异。预防组中，凝集素的作用随剂量的增大而显著，免疫低下小鼠的血清溶血素实验结果表明，高剂量的凝集素能明显改善免疫低下小鼠的特异性体液免疫能力，而中低剂量组的效果并不明显。凝集素对于免疫低下小鼠的迟发型超敏反应没有明显作用。3、体内小鼠实验进一步说明了，凝集素对机体免疫水平的调节，无论是在正常小鼠还是在免疫低下小鼠，凝集素都有一定的作用，对于环磷酰胺所致的免疫低下小鼠有很好的拮抗作用。具体检测见如下列表表1凝集素对正常小鼠免疫器官的影响G士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(与空白对照组比较，*p<0.05)表2凝集素对正常小鼠非特异性免疫功能的影响(；士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01)表3凝集素对正常小鼠体液免疫功能的影响(S士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01)表4凝集素对脾脏淋巴细胞增殖能力的影响G±sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表6凝集素对环磷酰胺致免疫低下小鼠免疫器官的影响(；士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表7凝集素对环磷酰胺致免疫低下小鼠非特异性免疫功能的影响(；士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(与正常对照组比较，Ap<0.05，AAp<0.01;与治疗组阴性对照组比较、<0.05，**p<0.01;与预防组阴性对照组比较Ap<0.05，▲<0.01)表8凝集素对环磷酰胺致免疫低下小鼠体液免疫功能的影响G±sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(与正常对照组比较，Ap<0.05AAp<0.01;与治疗组阴性对照组比较fp<0.05，**p<0.01;与预防组阴性对照组比较Ap<0.01，<0.01)表9凝集素对环磷酰胺致免疫低下小鼠迟发型超敏反应的影响(；士sd，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(与正常对照组比较，Ap<0.05，AAp<0.01;与治疗组阴性对照组比较fp<0.05，**p<0.01;与预防组阴性对照组比较Ap<0.01，<0.01)。权利要求一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其特征在于其纯化的步骤是(1)对工程蝇的幼虫进行诱导，待幼虫化蛹后，收集蛹，除去饲养过程中混入的杂质，清水漂洗，收集漂洗干净的蛹，加提取溶剂研磨，3-5℃静置0.8-1.2h，得到浸提液备用；(2)由步骤(1)得到的浸提液，离心，过滤除去杂质，重复离心、过滤2-4次，收集过滤后的上清液；(3)将步骤(2)得到的浓缩液混胶，在4-40℃条件下与胶混合，每30min缓慢搅拌一次，3.5-4.5h后装柱，缓冲液平衡，缓冲液洗脱流速控制在0.8-1.2mL/min，洗脱杂蛋白，之后进行糖溶液竞争性洗脱，竞争性洗脱液流速控制在0.5mL/min，收集洗脱峰；(4)将收集到洗脱峰过SephadexG200凝胶柱，先后检测到四个峰值，分别对各个峰的成分进行回收、冷冻、干燥，得到白色粉末即为凝集素。2.根据权利要求1所述的一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其特征在于所述步骤(1)中幼虫化蛹的化蛹率为80%。3.根据权利要求1所述的一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其特征在于所述步骤(1)的提取溶剂为生理盐水或者昆虫缓冲液BIS。4.根据权利要求1所述的一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中混胶使用的是S印harose4B。5.根据权利要求1所述的一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其特征在于所述步骤(4)的缓冲液为昆虫缓冲液BIS。6.根据权利要求1所述的一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其特征在于所述步骤(4)的竞争性洗脱液为D-半乳糖溶液0.2-0.3moL/L。全文摘要本发明涉及一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其纯化的步骤是对工程蝇的幼虫进行必要的诱导，待幼虫化蛹后(80％化蛹)，收集蛹，除去饲养中混入的杂质，以生理盐水或者BIS做为提取溶剂提取蛹糖蛋白，提取液经离心、超滤、浓缩，吸附色谱柱脱色纯化、离子交换色谱柱纯化、凝胶色谱柱纯化、浓缩等步骤得到一类分子量在68-22kDa之间的糖蛋白。本发明以工程蝇为原料，工程蝇凝集素有糖结合专一性，其能与色谱柱上的特定配基结合，适合采用特异性纯化，利用色谱分离技术对其进行提取、分离、纯化，并且工程蝇凝集素在40℃下稳定，适合室温提取，提取方法不仅简单而且实用，适合大规模工业生产。文档编号C07K1/16GK101709075SQ200910228160公开日2010年5月19日申请日期2009年11月11日优先权日2009年11月11日发明者周明慧,曹小红,王爱华申请人:天津科技大学