专利名称：通过预处理手段获得高质量土壤微生物基因组dna的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及对土壤样品进行一定的处理以获得高 质量土壤微生物基因组DNA。
背景技术：
不依赖培养的分子生态学技术逐渐成为解析和认识土壤微生物的多样性以及原 位条件下的生理特征的有力手段。目前分子生态学已经涉足多个研究领域，对原位条件下 研究环境微生物群落多样性和生态生理功能提供了大量的有价值的信息。分子生态学的基 础依赖于高质量的DNA模板。目前提取土壤微生物基因组DNA的方法很多，商品化的试剂
盒方法(例如FastDWA 等)以及部分文献中的方法(例如周氏方法等)基本都能够满足 提取土壤微生物基因组DNA的需要，但是提取的基因组DNA混杂有大量的污染物腐殖酸物 质等。含有腐殖酸物质污染物的DNA强烈的抑制PCR扩增，影响内切酶消化等、以及一些下 游分析相应的分子生物学操作，这些干扰因素严重影响到对土壤微生物的正确认识。目前 常通过稀释基因组DNA的方法解决腐殖酸等污染物的影响，以解除干扰物质对PCR扩增的 抑制。稀释模板基因组DNA的方法有时可以解决这个问题，但是在一定程度上牺牲了多样 性。因而有必要改进现有的土壤微生物基因组的提取方法，以获得高质量、高纯度的土壤微 生物基因组DNA。
发明内容
本发明旨在通过预处理技术，预先去除土壤中的腐殖酸物质等，提取并获得高质 量、高纯度的土壤微生物基因组DNA，为更好的开展土壤微生物分子生态学研究提供方便。本发明所述的通过预处理手段获得高质量土壤微生物基因组DNA的方法如下(1)样品的预处理待提取基因组DNA的样品与1 2倍体积的0. 5 1. 5M碳酸 钙溶液(或者选用碳酸钡、草酸钙等溶液)混勻，室温温育0. 5 2h，间歇摇勻。(2)样品的收集预处理好的样品，8000 12000Xg离心10 20min，收集沉淀 物。(3)收集的沉淀物作为提取基因组DNA的材料。提取的方法选用任意一种，包括 商品化的试剂盒方法、周氏方法以及由周氏方法衍生的提取方法。本发明依据物理化学以及生化原理设计预处理样品后再提取土壤样品微生物基 因组DNA的方法，本发明的预处理技术简单可行，成本低廉，腐殖酸物质去除效果明显，提 取的基因组DNA质量高，并且使用对象范围广，可以适用于各种土壤样品以及水体沉积物 等样品。
图1提取获得的土壤微生物基因组DNA外观照片其中1，土壤样品不经预处理；2，土壤样品经过碳酸钙预处理。
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图2PCR扩增得到的16S rDNA V3区DNA的DGGE结果照片其中1，土壤样品经过碳酸钙预处理；2，土壤样品未经预处理。
具体实施例方式以下将将结合具体实施例对本发明作进一步的说明，目的在于帮助读者更好的理 解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。实施例1 选取中国科学院亚热带农业生态研究所桃源站为研究地点，采集5 15cm的稻田 土壤样品为研究对象，土壤的理化等性质测定结果(PH为4. 96，总有机碳含量2. 37%)。称 取5g土壤样品，置于50ml离心管中，加入5ml碳酸钙悬浮液(IM)，颠倒数次混勻后，置于室 温条件下lh，间隔IOmin轻柔颠倒混勻。利用碳酸钙处理Ih后，在10000Xg室温条件下 离心lOmin，取沉淀物0. 5g采用FastDNA 试剂盒抽提土壤微生物基因组DNA，提取方法参照 生产商随同试剂盒提供的方案。对照实验，直接称取0.5g未经任何预处理的土壤样品，采 用FastDNA 试剂盒抽提土壤微生物基因组DNA。图1说明两种方法提取的土壤微生物基因 组DNA外观有明显的差异，利用碳酸钙预处理过的土壤样品，提取得到的DNA澄清，而未经 过处理的土壤样品提取到的DNA颜色呈黄褐色，颜色深说明含有腐殖酸等有机物物质污染 物。DNA的纯度测定使用Nanodrop 1000核酸蛋白测定仪(美国)测定，操作参照仪器使用 说明，利用碳酸钙预处理过的土壤样品提取得到的DNA其0D26(i/0D28(i为1. 81。未经过处理 的土壤样品提取到的DNA其OD26tZOD28tl为1. 44。0D26(1/0D28(1数值表明利用碳酸钙预处理过 的土壤样品提取得到的DNA纯度高。选择细菌16S rDNAV3 区的通用引物;357f-GC(5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGCGGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3‘)禾口518r(5' -ATT ACCGCG GCT GCT GG-3')作为PCR扩增的引物。PCR扩增体系选用ExTaq体系，购至大连宝生物。 扩增条件为95°C预变性5min ；95°C变性30sec，55°C退火45sec，72°C延伸45sec，30个循 环；72°C延伸IOmin ；4°C保持。采用伯乐公司的Dcode系统进行变性梯度凝胶电泳，变性梯 度为40 60%，60v电压，电泳时间17h。DGGE凝胶图谱(图2)结果表明利用碳酸钙预处 理过的土壤样品提取得到的DNA为模板，PCR扩增得到的产物质量好，其DNA条带亮度高、 带型犀利(图2电泳泳道1)。香农指数(H')可以代表多样性，借助Quantity one软件 分析DGGE凝胶图谱，并计算香农指数。
权利要求
1.通过预处理手段获得高质量土壤微生物基因组DNA的方法，其特征在于，提取获得 高质量土壤微生物基因组DNA的步骤包括土壤样品预处理、土壤样品基因组DNA提取。
2.权利要求1中所述的通过预处理手段获得高质量土壤微生物基因组DNA的方法，其 特征在于，土壤样品预处理是1 IOg 土壤与1 2倍体积的0. 5 1. 5M碳酸钙溶液(或 者选用碳酸钡、草酸钙等溶液)混勻，室温温育0. 5 2h，间歇摇勻。
3.权利要求1中所述的通过预处理手段获得高质量土壤微生物基因组DNA的方法，其 特征在于，离心收集预处理好的样品，提取基因组DNA。提取的方法选用任意一种，包括商 品化的试剂盒方法、周氏方法以及由周氏方法衍生的提取方法。
全文摘要
本发明涉及预处理土壤样品再提取获得高质量土壤微生物基因组DNA。本发明用碳酸钙等溶液预处理待提取基因组DNA的土壤样品，提取的DNA外观颜色清亮，OD260/OD280为1.81DNA的纯度高。提取的DNA可以直接用于PCR扩增，DGGE凝胶图谱表明扩增的产物浓度高且带型犀利。香农指数分析表明扩增产物的多样性大可以有效的反应土壤微生物群落的微生物多样性。本发明的预处理技术简单可行，成本低廉，腐殖酸物质去除效果明显，提取的基因组DNA质量高，适用于广泛的分子生态学研究领域。
文档编号C07H21/04GK102080076SQ20091023793
公开日2011年6月1日 申请日期2009年11月26日 优先权日2009年11月26日
发明者吕迪, 庄国强, 马安周 申请人:中国科学院生态环境研究中心