一种精氨酸杂合细胞穿膜肽及其应用的制作方法

文档序号:3565735阅读:484来源:国知局
专利名称:一种精氨酸杂合细胞穿膜肽及其应用的制作方法
技术领域
本发明属于生物分子领域。
背景技术
随着生物工程学,基因组学,生物和有机化学的发展,各种类型的新型药物分 子,如短肽(P印tides),单克隆抗体蛋白(monoclonal antibodies),反义寡核苷酸 (antisenseoligo薦leotides),核酶(ribozymes),催化DNA(catalytic DNA)等纷纷被开 发出来。这些具有极大生物学和医学意义的分子(当然也包括传统的质粒和融合蛋白)往 往由于其过大的分子量和本身的亲水性质,限制了他们的在体应用。由于生物膜系统的阻 碍,这些分子很难进入到靶向器官和组织的细胞中去发挥作用。针对这些问题,不同的技术 被开发出来,他们都有各自的优缺点。 病毒片段重组技术(recombinant viral vector)可以通过病毒片段的表达,将重 组蛋白(recombinant proteins),核醇(ribozymes),反义RNA (antisense RNAs)在革巴细胞 中原位表达。病毒片段重组技术目前已被广泛应用。但是该技术并不是在所有情况下适用。 同时,其在转染效率和生物毒性上都面临困难。同时,该技术也无法做到组织靶向性。目前 很多非病毒载体被研发出来,但是大多数的非病毒载体在转染效率上依旧难以超越病毒载 体。 也有研究者采用物理透膜方式如电穿孔、微管注射、穿孔蛋白法等。这些方式虽然 各有优势,但是也存在一些缺点导入率低、对细胞剌激大甚至可能导致细胞死亡、靶向性 不强。因此研究者致力于寻求更具高效的透膜方式。 多肽介导的生物活性分子透膜技术,在许多方面优于常用的透膜方式。另外在合 成上多肽具有高产率,对细胞毒性低,而且肽骨架能够进行不同的修饰,这样的多肽在未来 的给药平台具有很大潜在的利用价值 细胞穿膜肽(cell-penetrating p印tides, CPP)也称蛋白转导域 (proteintransduction domains, PTDs)的发现和应用给药物投递系统带了新的方向和希 望。细胞穿膜肽发源于人免疫缺损病毒HIV-1编码的TAT蛋白衍生物和果蝇触角同源异型 的转录调节蛋白(Ante皿即edia),目前已经发展有各种形式,包括全L型/D型多聚精氨酸 (oilgo-Arginines),非天然肽(non_natural peptides),拟肽(p印toids),胍基端聚合物 (guanidinium-terminated dendrimers)等。1988年,Green禾口 Frankel首次发现人免疫缺 损病毒(HIV)-1的反式激活蛋白TAT能够穿透细胞膜进入细胞内部,并能进一步定位于细 胞核。1994年,Fawell等人将TAT蛋白片段TAT(37-72)与某些蛋白(P-galactosidase orhorseradish peroxydase)共价连接,发现TAT蛋白片段可以将大分子蛋白带入到不同 细胞系中。后续的研究发现TAT蛋白的部分序列TAT(49-57)即可行使蛋白转运功能,而 且可以携带多种物质,包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒型物质进入细胞。研究者提 出,对于TAT蛋白类穿膜肽的穿膜能力起核心作用的是精氨酸的数目,也即胍基基团的数 目。在各式各样的穿膜肽中,富含精氨酸的细胞穿膜肽(arginine-rich cell-penetratingp印tides),简称AR-CPPs,由于其高效的穿膜效率和低细胞毒性,目前吸引了广泛的关注和研究。 富含精氨酸的细胞穿膜肽(AR-CPPs)的穿膜机理目前还不是很清楚。最初的研究者认为,AR-CPPs以一种直接透过细胞膜的方式(非囊泡摄取方式)进入细胞,这种方式不受温度,能量的影响,也不需要受体。当AP-CPPs通过直接进膜的方式进入细胞后,可以自由扩散到细胞质中,随着时间的积累,会进一步在细胞核中出现并积累。但是,2003年,Richard等人指出在传统观察CPPs穿膜的实验中,将细胞固定的操作使实验结果受到了人为因素的干扰。通过使用非固定的活细胞实验,他们观测到荧光标记的TAT(48-60)和(L-Arg)9进入细胞后,被困在囊泡状小体中(endosome-like punctuate vesicles),同时,在细胞质或者细胞核中却没有检测到荧光标记的穿膜肽存在(由于无法冲破囊泡小体的限制)。实验也验证,细胞穿膜肽进入细胞需要能量的支持,同时受温度变化的影响。虽然关于AR-CPPs的穿膜机理依旧存在争论和质疑,胞吞作用(endocytosis)是AR-CPPs进入细胞的普遍方式在目前已经被广泛接受。这种胞吞机制的建立也给AR-CPPs的生物学应用提出了新的问题和困难在AR-CPPs或者携带外源货物分子的AR-CPPs进入细胞后,如何将其从囊泡小体释放出来使其真正行使功能?目前,已经有很多研究小组报道,虽然AR-CPPs有很高的穿膜效率,但是大部分进入细胞的AR-CPPs及其负载的货物分子都被困在了囊泡小体中,无法释放到细胞质或细胞核中去真正行使功能。当然,也有一些研究小组指出,当浓度提高到一定程度后,可以看到部分穿膜肽可以从囊泡释放到细胞质中去,但是这种高浓度也伴随着高毒性。因此,目前认为,在较低浓度下,找到有效将AR-CPPs从囊泡小体中释放出来的方法是实现AR-CPPs真正高效穿膜进入细胞质或细胞核的关键因素。尽管已经有研究小组尝试提出一些方案来实现AR-CPP的囊泡小体释放,但是这些方案要么无法实现活体应用,要么使得载体本身结构过于复杂。 AR-CPPs实现高效穿膜还需要面临的另一个方面的挑战由天然L型a氨基酸(L-a-amino acids)构建的AR-CPPs很容易被生物体中的酶降解而失去活性。 一般的解决的方法是采用非天然肽来构建细胞穿膜肽,常用的有P肽(P-p印tides),拟肽(p印toid)以及天然肽(L型)所对应的D型化合物(D-ismoers)。但是,这些非天然肽由于其单体昂贵的价格或还没有商业化而难以制备,不适合商业生产。

发明内容
本发明的目的是解决上述问题,提供一种精氨酸杂合细胞穿膜肽及其应用,该细胞穿膜肽能够携带标记物和货物分子高效、低细胞毒性的进入细胞内部,同时具有很强的抗酶解、抗血清降解能力,并且进入细胞后可以从囊泡小体中逃逸。另外,这种细胞穿膜肽相比由全非天然氨基酸构建的穿膜肽,合成的价格更加低廉,适合商业普及。
本发明所采用的技术方案是 —种精氨酸杂合细胞穿膜肽,该细胞穿膜肽由非天然D型精氨酸(r)与天然L型精氨酸(R)杂合构建而成,分子式为(r)n(R)m,r与R在结构中可以随机排列,n和m是氨基酸残基数目,满足4《n+m《12,1《n《ll,l《m《11。 进一步地,所述细胞穿膜不能由全非天然D型精氨酸(r)与全天然L型精氨酸(R)杂合构建而成。
—种精氨酸杂合细胞穿膜肽的应用该细胞穿膜肽的N端和C端可以单独或者同
时连接不同的标记物或者货物分子,并携带标记物和货物分子进入到细胞内部。 进一步地,所述细胞穿膜肽携带标记物和货物分子能进入到细胞核内进行核定位。
上面所述的标记物可以为荧光素,生物素,放射性物质或者特定的亲和基团等;货
物分子可以为蛋白,多肽,DNA、药物小分子前体、多胺类,甚至比自身分子量大很多倍的寡
聚核苷酸,金属颗粒等。
本发明具有以下优点 (1)该细胞穿膜肽能够携带标记物和货物分子高效、低细胞毒性的进入细胞内部。
(2)该穿膜肽具有很强的抗酶解能力(天然氨基酸构建的穿膜肽在5min内被胰酶 降解,而混合型穿膜肽可以在胰酶溶液保存数天),可以保证穿膜肽在携带各类货物分子进 入组织或细胞时,不会被生物体内的蛋白酶降解掉。同时,在长时间后,也可以逐步被分解, 从而不会在生物体内长时间积累而造成毒性。 (3)该穿膜肽有一定的抗血清降解能力。可以保证穿膜肽在携带各类货物分子进 入组织或细胞时,不会被血清降解,同样的,在长时间后,也可以逐步被血清分解,从而不会 在生物体内长时间积累而造成毒性。 (4)该穿膜肽区别以往的穿膜肽的最大特点在于,在进入细胞后可以的从囊泡小 体中逃逸,实现真正的在进入细胞内部,扩散到细胞质和细胞核中,尤其是特异性的进入细 胞核核仁区域。


图1为细胞穿膜肽的抗胰酶降解实验中的结果显示图;
图2为流式细胞仪检测细胞穿膜肽穿膜效率的显示图;
图3为细胞穿膜肽孵育细胞后激光共聚焦成像的显示图;
图4为MTT检测细胞穿膜肽细胞毒性实验的结果显示图。
具体实施方式

实施例1 将非天然D型精氨酸(r = D-arginine)和天然L型精氨酸(R = L-arginine)交 替连接成一个八聚肽,命名为(rR)4。作为对照组,设计了全L型精氨酸八聚物,命名为Rs。 R8的穿膜效率远高于传统的TAT,57蛋白,但是由于同样依靠内吞作用,在穿膜后被困在囊 泡中。将两种穿膜肽分别用常见的无毒性荧光素FITC标记。 在检测细胞穿膜肽的实验中,不同研究小组检测穿膜肽进入细胞的结果往往各 异。从不同研究小组的实验流程和结果显示,细微的实验条件变化都将影响细胞实验结果。 研究表明如果采用先固定细胞后观察的方案,就会导致细胞穿膜肽在细胞内分布的结果受 到人为干扰,从而影响了对细胞穿膜机制判断。我们的实验显示,影响细胞穿膜肽进入细胞 的效率和及其在细胞内分布的因素,不仅包括细胞种类和孵育的穿膜肽的浓度;孵育时间, 孵育温度,细胞生长状态,细胞数目,穿膜肽孵育体积,穿膜肽给药方式(不可直接向样品 直接加入穿膜肽,应先将穿膜肽与培养基先混合均匀,再温和的将混合后穿膜肽均匀缓慢的滴加)都对细胞穿膜效率尤其是进入细胞后的分布有显著的影响。为了保证实验的严谨性,我们使用目前公认为高效且常用的R8作为对照穿膜肽,选择已被广泛使用的HeLa细胞作为细胞模型,同时对上述所有的实验条件进行严格监控,保证在相同的条件下评估对两组穿膜肽进行评估。
合成肽 (rR)4的合成通过标准的固相态合成,标记基团荧光素FITC(FITC =fluoresceinisothiocyanat)通过正氨基己酸(aminohexanioc acid, AHC)与縮合肽N端相连。作为对照,标记了 FITC的R8通过同样的流程合成。
细胞穿膜肽抗胰酶降解实验 将胰酶溶于甘油Tris *HC1(1 : 1)混合溶液配成胰酶母液,将穿膜肽溶于Tris 'HCl(100mM, pH 7.2)中,终浓度为150 yM。按胰酶穿膜肽(100 : 1)的比例,把胰酶母液(终浓度35. 8mg/mL)加入穿膜肽溶液,37。C孵育。每隔一段时间,从混合溶液终取出50iiL,加入150mL IN HCL并冰浴,中止胰酶的作用,将该样品通过反向液相色谱(RP-HPLC)进行分析(flow = 1. OmL/min ;gradient :0min,A : B = 80 : 20 ;25min,A : B=55 : 45 ;A = 0. 1% TFA in water, B = 0. 1% TFA in acetonitrile)。
其结果显示见附图1 (a)和附图1 (b) ,FITC-AHC_R8在5分钟内被降解完全。而同样条件下,FITC-AHC-(rR)4在60分钟内一直保持稳定,直到70小时,还有近一半的穿膜肽没有被降解。因此,相较于FITC-AHC-R8, FITC-AHC- (rR) 4有更好的酶稳定性,这保证了穿膜肽在有酶存在的情况下,也能很好地运载货物分子。同时,可以发现FITC-AHC-(rRh依旧可以缓慢地被酶降解,这保证了在携带货物分子进入细胞后,可以将货物分子释放出来,并且进入了细胞的穿膜肽也能够被清除,从而降低对细胞和组织的毒性。
流式细胞仪检测穿膜效率实验 流式细胞仪无法区分荧光是来自于进入细胞的肽还是附在细胞膜上的肽。在用流式细胞仪检测前,所有细胞样品都用胰酶(trypsin)清洗来降解掉附着于胞外的细胞穿膜肽。但是由于已证明FITC-AHC-(rR)4有很好的胰酶(trypsin)抗性,而台盼蓝(trypanblue, TB)可以淬灭掉附着于细胞膜外侧的穿膜肽,因此所有样品需要用台盼蓝清洗。
从同一批次原代HeLa细胞接种相同数目(lX105Cells/Well)的细胞于24孔板,37°C、5% (A环境下培养过夜,使细胞重新贴壁。37°C,5% C02环境下,孵育细胞穿膜肽(10 M,孵育体积,350 L) 10分钟,孵育混合液分别为无血清培养基DMEM和含10%胎牛血清(FBS)的培养基DMEM。孵育后,用PBS(ra 7.2)清洗,胰酶消化细胞。将消化下的细胞重悬后4000rpm离心5min。用冰浴的含PI (5 y g/mL)的PBS清洗细胞。清洗后用含1 %FBS的PBS(ra 7.2)将细胞重悬,避光冰浴保存等待检测。检测时,取出等份细胞悬液与台盼蓝(TB,500mg/mL溶于冰浴的ra 7. 2PBS)孵育lmin,直接上样检测。流式细胞仪型号FC-500BeckmanCoulter cytometer。分析软件WinMdi。 其穿膜效率的显示图见附图2,在加血清和不加血清的两种情况下,本发明设计的FITC-AHC-(rR)4都比FITC_AHC_R8有着更好的穿膜效率。有报道全D型精氨酸寡聚物穿膜效率远高于全L型精氨酸寡聚物,其原因主要在于全D型精氨酸寡聚物比全L型精氨酸寡聚物有更好的血清稳定性,在无血清孵育的条件下,两者的穿膜效率几乎等同。而实验展示,即使在无血清孵育的条件下,FITC-AHC-(rRh的穿膜效率依旧远高于全L型的FITC-AHC-R8。 穿膜肽孵育细胞激光共聚焦成像 从同 一 批次原代HeLa细胞接种相同数目(2xl0、ells/we11)的细胞于 Lab-Tek I 8孔板。37°C、5% C02环境下培养过夜,使细胞重新贴壁。将PI (8 y g/mL)和 Hochest33324(10iig/mL)与细胞穿膜肽10 y M)共孵育。所有孵育分子混溶于无血清DMEM 高糖培养基。将混合好后的混合培养基缓慢均匀滴加入Lab-Tek I 8孔板。37°C、5%C02 环境下孵育10分钟。孵育时间结束后,首先丢弃孵育培养基,用含PI的PBS(终浓度8yg/ mL)清洗细胞三次后,加入新的无PI的PBS,上镜观察。观察结束后,将孔板内的PBS丢弃, 加入台盼蓝(trypanblue,TB,500ii g/mL),孵育2min,丢弃孔板中的台盼蓝(trypan blue, TB),再次用含PI的PBS (终浓度8 g/mL)清洗细胞三次后,加入新的无PI的PBS,上镜观 察。 成像条件所有细胞样品通过共聚焦显微镜FV1000观察。FITC由Ar激光器在 488nm处激发,在495_555nm接受。PI由Ar激光器在488nm处激发,在600-670nm接受。 Hochest33324由半导体激光器在488nm处激发,在462_523nm接受。共聚焦显微镜型号 FV1000 (Ol卿us, Japan)。 其孵育细胞后激光共聚焦成像的显示图见附图3,其中图3(a)表示R8孵育细胞 后,不用台盼蓝清洗,直接成像的穿膜肽(FITC标记)在细胞定位激光共聚焦成像的显示 图,图3(b)表示Rs孵育细胞后,加入台盼蓝清洗后的穿膜肽(FITC标记)在细胞定位激光 共聚焦成像的显示图。可以看到台盼蓝萃灭掉细胞膜表面的穿膜肽后,Rs在细胞的定位始 终是囊泡状小体。3(c)表示(rR)J哮育细胞后,不用台盼蓝清洗直接成像的穿膜肽(FITC 标记)在细胞定位激光共聚焦成像的显示图,图3(d)表示(rR)4孵育细胞后,加入台盼蓝清 洗后的穿膜肽(FITC标记)在细胞定位的激光共聚焦成像的显示图。可以看到,台盼蓝可 以萃灭掉大部分膜上的穿膜肽(依旧可以看到的少许荧光斑点,应该是未萃灭完全的附在 膜上的穿膜肽),(rR)J桴育细胞后,穿膜肽广泛的分布到了细胞质中,同时,该穿膜肽同时 特异的标记细胞核,特别是核仁。图3(e)表示(rR)J桴育细胞时,PI染色情况。PI可以特 异性染色死细胞的细胞核,该结果说明所有成像细胞生长状态良好。图3(f)表示(rR)J桴 育细胞时,Hochest33324染色情况。Hochest33324可以特异染色活细胞的细胞核。该结果 可以确定活细胞细胞核的位置。图3(g)表示(rR)J桴育细胞后,将穿膜肽(FITC标记)定 位荧光图、PI染色荧光图、Hochest33324染色荧光图叠加到一起的情况。可以看到穿膜肽 (FITC)和Hochest33324共定位,从而说明穿膜肽可以特异的标记活细胞细胞核。图3 (h) 表示(rR)J桴育细胞时的细胞图。可以看到细胞状态良好。TB淬灭掉细胞膜上的大部分荧光后,FITC-AHC-(rR)4展现了与FITC_AHC_R8不同 的细胞内定位。FITC-AHC-R8虽然可以高效地进入细胞,但是进入细胞后全部被困在囊泡小 体中。而FITC-AHC-(rR)4广泛地分布到了细胞质中,并且在核仁中发生了聚集,没有看到 明显的聚集在囊泡中的现象。
MTT检测细胞毒性实验 从同一批次原代HeLa细胞接种相同数目(4xl(fcells/we11)的细胞于96孔 板。37°C、5% (A环境下培养过夜,使细胞重新贴壁。37°C,5% 0)2环境下,孵育不同浓度 (3 ii m 30 ii m)细胞穿膜肽12小时,孵育后加入MTT (5mg/mL)。再次孵育2小时。丢弃所有孵育溶液,加入200iiL DMS0。通过酶标仪在570nm下检测各孔的吸收值。酶标仪型号ELISAReader Genios Plus(Tecan,Switzland)通过MTT(3_4,5_dimethylthiazol_2_yl)_2,5_diphenyltetrazolium)检测
FITC-AHC-(rR)4和FITC_AHC_R8的细胞毒性。两种穿膜肽在不同浓度下分别孵育12小时
候,细胞活性并无显著降低,两者都展示了很低的细胞毒性,其结果如图4所述。 对于精氨酸杂和细胞穿膜肽的结构,精氨酸残基数目不仅仅限于8个。4 12个
精氨酸残基构建的一系列寡具多肽都有相似的穿膜肽性质。穿膜效率随着精氨酸数目增加
而增加。所以本发明所设计的精氨酸杂合细胞穿膜肽也不仅仅限于实例所述的8个精氨酸
残基的细胞穿膜肽。精氨酸残基数为4 12个,其中精氨酸残基由不同比例天然精氨酸与
非天然精氨酸混合,这样构建的细胞穿膜肽必然同样具有实例中说述(rR)J勺各种性质。这
里很难穷举所有这样的精氨酸杂合细胞穿膜肽结构,所以我们列举了其中的一种情况,其
氨基酸序列表见说明书后面的序列表和光碟,该基因序列表仅仅指出实例中说述(rR)4的结构。 实施例2 按照上面的步骤,我们陆续做了其他结构的精氨酸细胞穿膜肽的验证试验,其中包括(rR)3、(rR)^等,这些实验得出的各种结论也与(rR)4得情况基本相同,从而表明由非天然D型精氨酸(r)与天然L型精氨酸(R)杂合构建而成,结构为(r)n(R)m的精氨酸细胞,均可以携带标记物和货物分子进入到细胞内部,而且具有穿膜效率高、抗酶解能力强、可以特异的标记活细胞细胞核以及低细胞毒性的特性。 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发
明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改
或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求
范围当中。 序列表 〈110〉华中科技大学 〈120〉 一种精氨酸杂合细胞穿膜肽及其应用 〈160>8 〈210>1 〈211>8 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈400〉 1 Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U
Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U
权利要求
一种精氨酸杂合细胞穿膜肽,其特征在于,所述细胞穿膜肽由非天然D型精氨酸(r)与天然L型精氨酸(R)杂合构建而成,分子式为(r)n(R)m,r与R在结构中可以随机排列,n和m是氨基酸残基数目,满足4≤n+m≤12,1≤n≤11,1≤m≤11。
2. 根据权利要求1所述的精氨酸杂合细胞穿膜肽,其特征在于,所述细胞穿膜不能由全非天然D型精氨酸(r)与全天然L型精氨酸(R)杂合构建而成。
3. —种精氨酸杂合细胞穿膜肽的应用,其特征在于,所述细胞穿膜肽的N端和C端可以单独或者同时连接不同的标记物或者货物分子,并携带标记物和货物分子进入到细胞内部。
4. 根据权利要求3所述的精氨酸杂合细胞穿膜肽的应用,其特征在于,所述细胞穿膜肽携带标记物和货物分子能进入到细胞核内进行核定位。
全文摘要
本发明公开了一种精氨酸杂合细胞穿膜肽及其应用,属于生物分子领域。所述细胞穿膜肽由非天然D型精氨酸(r)与天然L型精氨酸(R)杂合构建而成,结构为(r)n(R)m,r与R在结构中可以随机排列,n和m是氨基酸残基数目,满足4≤n+m≤12,1≤n≤11,1≤m≤11;该细胞穿膜肽的N端和C端可以单独或者同时连接不同的标记物或者货物分子,并携带标记物和货物分子进入到细胞内部。该细胞穿膜肽能够携带标记物和货物分子高效、低细胞毒性的进入细胞内部,同时具有很强的抗酶解、抗血清降解能力,并且进入细胞后可以从囊泡小体中逃逸。
文档编号C07K5/11GK101781356SQ20091030966
公开日2010年7月21日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者张玉慧, 马严, 骆清铭 申请人:华中科技大学
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