专利名称：一种黄连碱单体的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及从植物中分离化合物单体的方法技术领域，尤其是一种黄连碱单体的
分离纯化方法。
背景技术：
黄连(Rhizoma coptidis)为毛茛科黄连属植物黄连(Coptis chinensisFranch.)、三角口十黄连(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao)或云连(CoptisteetaWall.)的干燥根茎，分别习称"味连"、"雅连"、"云连"。黄连性味苦寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿，泻火解毒的功效。用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。
黄连碱是黄连的特征性化学成分，也是黄连中活性最高的原小檗碱型生物碱，其英文名为Coptisine，化学名为Bis [1， 3]benzodioxolo [5， 6_a :4' ， 5' _g] quinolizinium，6，7-dihydro-，分子式为C19H14N04+，分子量为320. 32，属于原小檗碱型生物碱，其结构式如
下
由于黄连碱是黄连的特征性化学成分，如果能以黄连碱作为该药材及其相关制剂的质量评价指标，既能较真实地反映其质量又具有专属性，可对黄连药材及其制剂的质量控制起到重要作用。 但是，发明人通过检索大量文献现，目前只有关于黄连中总生物碱的提取或小檗碱的分离纯化报道，如中国专利申请200810069671. 8公开了 "一种黄连总生物碱提取工艺"，中国专利申请200710098436. 9公开了 "一种从中药提取物中分离小檗碱类总生物碱的方法"等，未见与黄连碱单体分离工艺的相关报道。究其原因，与黄连碱的性质和黄连中其它原小檗碱型生物碱的干扰有关，常规分离纯化方法不能有效的将它们进行分离。从黄连药材的HPLC分析图谱(如图1所示，参考文献高效液相色谱法测定黄连药材中小檗碱型生物碱的含量，药物分析杂志，2003， 23 (5))可以看到，黄连碱峰的前面分别为药根碱和表小檗碱，后面分别为巴马亭和小檗碱，5个峰的保留时间很接近；其原因是这几个化合物的结构相近，其理化性质也比较相近，对于常规的分离介质，如硅胶、氧化铝、大孔树脂、聚酰胺等，都不能将它们很好分离。因此，迄今为止，尚没有可有效分离制备黄连碱的成熟工艺报道，更没有高纯度的黄连碱单体化合物面市。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中无高纯度黄连碱的分离制备方法、因而缺 少高纯度黄连碱单体化合物、无法通过黄连碱的含量测定加强对黄连药材及其制剂的质量 控制等问题，提供一种黄连碱单体的分离纯化方法。该方法操作简便，生产周期短，分离效 率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量黄连碱单体的高纯度分离制备，得到的黄连碱单体 纯度高，可作为含量测定的对照品使用。 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
—种黄连碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤
(1)、提取 将黄连药材粉碎成粗粉，按照药材重量乙醇溶液体积=iKg : (8 io)L计算，
加入体积百分比为85 95%的乙醇溶液，回流提取3 4次，每次2 3小时，过滤，收集、
合并滤液。 本步骤通过乙醇回流提取，得到的提取液(滤液)中主要含有小檗碱、黄连碱等总
生物碱成分。 (2)、浓縮 将步骤(1)收集、合并的滤液回收乙醇，浓縮至相对密度为1. 05 1. 10g/mL(约 9(TC测定)，静置析晶8 12小时，过滤，除去沉淀物(沉淀物中的晶体为小檗碱，可纯化制 得小檗碱产品)，黄连碱主要保留在滤液中，将滤液进行下一步萃取处理。
(3)、萃取 向步骤(2)的滤液中加入氨水调pH8. 0 9. O，然后加入等体积氯仿萃取3 4 次，合并氯仿层，回收氯仿，固体残渣中主要含黄连碱，待下一步处理。
本步骤中水层主要除去极性较大的杂质。
(4)、溶解、过滤 按照固体物质量溶剂体积=lg : 4 6ml，将步骤(3)萃取后所得的固体残渣 加吡啶、或四氢呋喃、或DMF溶解，溶解后的溶液用纳米膜过滤，滤除颗粒杂质，以免堵塞制 备色谱柱，滤液作为下一步制备黄连碱单体的原料。
(5)、高效制备液相色谱分离
采用填料为C18的色谱柱； 流动相组成为乙腈40 60mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸二氢钾溶液中含有 10 20mmol/L十二烷基磺酸钠，以磷酸或冰乙酸调pH4. 0 5. 0) = 45 : 55 55 : 45 (v/ 检测波长为345nm。 取步骤(4)所得的滤液进样，进行黄连碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测， 针对性收集黄连碱单体的制备馏分溶液，得黄连碱单体溶液。 在进行高效制备液相色谱分离前，可通过液质联用或其它本技术领域常用的方法 确定高效液相色谱中黄连碱单体的峰形。 以液质联用方法为例，可与上述制备分离色谱条件相同，采用填料相同的色谱柱、 组成相同的流动相、相同的检测波长等，柱温为室温(无特别要求，室温即可)；取步骤(4)所得的滤液进样，进行黄连碱单体的高效液相分离纯化，根据质谱检测结果，可确定黄连碱
单体在液相色谱中所对应的峰形。 (6)、产品回收 将步骤(5)高效制备液相色谱分离得到的黄连碱单体溶液加热回收乙腈，在剩下 的溶液中加入氨水调pH至8. 0 9. 0，再加入等体积氯仿萃取3 4次，合并氯仿溶液，再 在氯仿溶液中加入等体积水反向萃取1 2次，收集氯仿溶液，回收氯仿，固体干燥，即得到
黄连碱单体产品。 由于高效液相色谱对样品溶液的纯度、色泽等要求均较高，通过提取等简单处理 得到的提取液不能直接作为样品溶液进入高效液相色谱系统，否则既可能达不到良好的分 离效果，还可能对高效液相色谱系统的色谱柱等配件产生难以逆转的影响，縮短其使用周 期；而色谱柱等液相色谱的相关配件成本通常较高，其使用周期的縮短显然将造成最终产 品的生产成本大大提高；因而，对进入高效液相色谱的样品溶液要求较高，其前处理过程非 常重要。 黄连药材中除含有黄连碱外，还含有药根碱、表小檗碱、巴马亭、小檗碱等非常复 杂的成分，要获得可直接进入高效液相色谱系统的样品，需要先进行特殊的提取及分离纯 化处理。针对黄连药材中存在的各种成分的理化性质，本发明方法通过前述步骤(1)、(2)、 (3)、 (4)的顺序搭配，以及适当的参数组合，可有效提取出黄连药材中的黄柏碱等成分，并 除去提取液中含有的小檗碱、颗粒物质等大量杂质，获得可以进入制备型高效液相色谱系 统的样品溶液(即步骤(4)得到的滤液)，不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量 延长其使用周期，节约生产成本。 在高效液相色谱分离过程中，色谱条件的选择非常重要，它对样品溶液中各物质 的出峰顺序、峰形、分离效果等起着决定性的作用；色谱条件主要包括色谱柱(包括填料、 柱长及内径等)、流动相(包括组成及流速等)、柱温、检测波长、检测器等，各色谱条件的选
择及其组合至关重要。 本发明人通过大量的试验研究及对比分析，确定了如上所述的各色谱条件，使样 品溶液中各物质的出峰时间、峰形、分离效果等最佳化，有利于黄连碱单体得到充分有效的 分离。 与现有技术相比，本发明的有益效果是 1、本发明方法采用制备型高效液相色谱系统对黄连碱单体进行分离纯化，通过最 适宜的前处理方法和色谱条件等，达到良好的分离效果，并且紫外检测器在线监测，过程直 观，针对性收集黄连碱单体，目标明确，避免了常规柱层析和先分离后检测造成的资源浪 费，且易于控制产品质量。 2、本发明方法操作简便，生产周期短，产品收率高、纯度高，产量大，工艺稳定可 靠，重现性好，成本低廉，易于放大生产。 3.本发明方法各工艺步骤中的有机试剂均可回收再利用，溶剂消耗量少。 4.具有较高的学术价值。由于目前尚未有能规模生产黄连碱单体及对照品的方法
报道，本发明所得产品不但能有效改善黄连碱对照品缺乏的现状，也能为产业化开发黄连
碱制剂提供高纯度优质原料。
图1是参考文献"高效液相色谱法测定黄连药材中小檗碱型生物碱的含量"中公 开的黄连药材的HPLC分析图谱；图1中1是药根碱，2是表小檗碱，3是黄连碱，4是巴马 亭，5是小檗碱。 图2是实施例1的黄连药材中原小檗碱型生物碱的HPLC分析图谱。 图3是实施例1的高效制备液相色谱图，图中记录为2针样品(不同进样量)连
续进样色谱图，图中峰1、2为黄连碱。 图4是实施例1的黄连碱单体产品复检的HPLC分析图谱。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。 下述各实施例中，终产品黄连碱单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱 (RP-HPLC)法，色谱条件如下 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-50mmol/L磷酸二氢钾溶液 (50 : 50)(混合液中加15mmol/L十二烷基硫酸钠，再以磷酸调节pH为4. 0)为流动相；柱 温30°C ;流速1. 0ml/min ;检测波长为345nm。
实施例1 本实施例黄连碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤
(1)、提取 取黄连药材lkg，粉碎成粗粉，加入10L体积百分比为85%的乙醇溶液，回流提取 3次，每次2小时，过滤，收集、合并滤液(药渣蒸干回收乙醇)。
(2)、浓縮 将步骤(1)收集、合并的滤液回收乙醇，浓縮至相对密度为1. 10g/mL(约9(TC测 定)，静置析晶8小时，过滤，除去沉淀物(沉淀物中的晶体为小檗碱，另行纯化处理制得小 檗碱产品)，黄连碱主要保留在滤液中，将得到的滤液(约1. 5L)进行下一步萃取处理。
(3)、萃取 向步骤(2)的滤液中加入氨水调pH8. 0，然后加入1. 5L氯仿萃取3 4次，合并氯 仿层，回收氯仿至干，固体残渣约80g，待下一步处理。
(4)、溶解、过滤将步骤(3)萃取后所得的固体残渣加480mL DMF溶解，溶解后的溶液用0. 45um膜 过滤，滤液作为下一步制备黄连碱单体的原料。
(5)、高效制备液相色谱分离 采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)的色谱柱，柱规格为50cmcm ;
流动相组成为乙腈-60mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸二氢钾溶液中含有 20mmol/L十二烷基磺酸钠，以冰乙酸调pH4. 0) = 45 : 55 (v/v);
检测波长为345nm ;室温下操作。 取步骤(4)所得的滤液进样，每针进样量10g(以滤液样品中所含的干品重量计)， 进行黄连碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集黄连碱单体的制备馏分溶液，得黄连碱单体溶液。 在进行高效制备液相色谱分离前，通过液质联用方法确定高效液相色谱中黄连碱 单体的峰形，采用的色谱条件同上，取步骤(4)所得的滤液进样，进行黄连碱单体的高效液 相分离纯化，根据质谱检测结果，确定黄连碱单体在液相色谱中所对应的峰形。
(6)、产品回收 将步骤(5)高效制备液相色谱分离得到的黄连碱单体溶液加热回收乙腈，得到剩 下的黄连碱水溶液2L，加入氨水调pH至8. 0，再加入2L氯仿萃取3次，合并氯仿溶液(约 6L)，再在氯仿溶液中加入6L水反向萃取2次，收集氯仿溶液，回收氯仿，固体于65t:干燥8 小时，得到黄连碱单体产品9. 8克。
整个生产流程用时约3天。 计算得产品收率为(9. 8/1000) X 100%= 0. 98%。 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得 结果为99. 20%。
实施例2 本实施例黄连碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤
(1)、提取 取黄连药材10kg，粉碎成粗粉，加入80L体积百分比为95 %的乙醇溶液，回流提取 4次，每次3小时，过滤，收集、合并滤液(药渣蒸干回收乙醇)。
(2)、浓縮 将步骤(1)收集、合并的滤液回收乙醇，浓縮至相对密度为1. 05g/mL(约9(TC测 定)，静置析晶12小时，过滤，除去沉淀物(沉淀物中的晶体为小檗碱，另行纯化处理制得小 檗碱产品)，黄连碱主要保留在滤液中，将得到的滤液(约30L)进行下一步萃取处理。
(3)、萃取 向步骤(2)的滤液中加入氨水调pH9. 0，然后加入30L氯仿萃取4次，合并氯仿层， 回收氯仿至干，固体残渣约900g，待下一步处理。
(4)、溶解、过滤 将步骤(3)萃取后所得的固体残渣加3. 6L四氢呋喃溶解溶解，溶解后的溶液用 0. 45um膜过滤，滤液作为下一步制备黄连碱单体的原料。
(5)、高效制备液相色谱分离 采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)的色谱柱，柱规格为50cm Ocm ;
流动相组成为乙腈-40mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸二氢钾溶液中含有 10mmol/L十二烷基磺酸钠，以冰乙酸调pH5. 0) = 55 : 45 (v/v);
检测波长为345nm ;室温下操作。 取步骤(4)所得的滤液进样，每针进样量25g(以滤液样品中所含的干品重量计)， 进行黄连碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集黄连碱单体的制备馏分溶 液，得黄连碱单体溶液。 在进行高效制备液相色谱分离前，通过液_质联用方法确定高效液相色谱中黄连 碱单体的峰形，采用的色谱条件同上，取步骤(4)所得的滤液进样，进行黄连碱单体的高效 液相分离纯化，根据质谱检测结果，确定黄连碱单体在液相色谱中所对应的峰形。
(6)、产品回收 将步骤(5)高效制备液相色谱分离得到的黄连碱单体溶液加热回收乙腈，得到剩 下的黄连碱水溶液15L，加入氨水调pH至9. 0，再加入15L氯仿萃取4次，合并氯仿溶液(约 60L)，再在氯仿溶液中加入60L水反向萃取1次，收集氯仿溶液，回收氯仿，固体于7(TC干燥 12小时，得到黄连碱单体产品120克。
整个生产流程用时约4天。 计算得产品收率为(120/10000) X100%= 1. 20%。 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)复检产品纯度，测得 结果为98. 86%。
权利要求
一种黄连碱单体的分离纯化方法，包括下述主要步骤(1)、提取将黄连药材粉碎成粗粉，按照药材重量∶乙醇溶液体积＝1Kg∶(8～10)L计算，加入体积百分比为85～95％的乙醇溶液，回流提取3～4次，每次2～3小时，过滤，收集、合并滤液；(2)、浓缩将步骤(1)收集、合并的滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.05～1.10g/mL，静置析晶8～12小时，过滤，除去沉淀物，将滤液进行下一步萃取处理；(3)、萃取向步骤(2)的滤液中加入氨水调pH8.0～9.0，然后加入等体积氯仿萃取3～4次，合并氯仿层，回收氯仿，固体残渣待下一步处理；(4)、溶解、过滤按照固体物质量∶溶剂体积＝1g∶4～6ml，将步骤(3)萃取后所得的固体残渣加吡啶、或四氢呋喃、或DMF溶解，溶解后的溶液用纳米膜过滤，滤液作为下一步制备黄连碱单体的原料；(5)、高效制备液相色谱分离采用填料为C18的色谱柱；流动相组成为乙腈-40～60mmol/L磷酸二氢钾溶液，二者体积比为45∶55～55∶45；其中的磷酸二氢钾溶液，还含有10～20mmol/L十二烷基磺酸钠，并以磷酸或冰乙酸调pH4.0～5.0；检测波长为345nm；取步骤(4)所得的滤液进样，进行黄连碱单体的制备分离，紫外检测器在线监测，针对性收集黄连碱单体的制备馏分溶液，得黄连碱单体溶液；(6)、产品回收将步骤(5)高效制备液相色谱分离得到的黄连碱单体溶液加热回收乙腈，在剩下的溶液中加入氨水调pH至8.0～9.0，再加入等体积氯仿萃取3～4次，合并氯仿溶液，再在氯仿溶液中加入等体积水反向萃取1～2次，收集氯仿溶液，回收氯仿，固体干燥，即得到黄连碱单体产品。
全文摘要
本发明公开了一种黄连碱单体的分离纯化方法，包括提取、浓缩、萃取、溶解过滤、高效制备液相色谱分离、产品回收等步骤。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量黄连碱单体的高纯度分离制备，得到的黄连碱单体纯度高，可作为含量测定的对照品使用。
文档编号C07D491/22GK101781307SQ20091031135
公开日2010年7月21日 申请日期2009年12月13日 优先权日2009年12月13日
发明者刘丁, 夏柯, 文焕松, 郭建华 申请人:成都普思生物科技有限公司