使用大豆寡糖生产塔格糖的方法

专利名称：使用大豆寡糖生产塔格糖的方法
技术领域：
本发明涉及通过使用大豆中存在的大豆寡糖或者含有大豆寡糖的水溶性糖溶液 生产塔格糖的方法，其中将寡糖中存在的半乳糖通过选择性水解而选择性地被回收，该寡 糖在大豆中以水溶性形式存在，然后使用上述回收的半乳糖生产塔格糖。
背景技术：
塔格糖具有几乎不能与蔗糖区分开的天然甜度，并且物理性质也类似于蔗糖。但 是，塔格糖不影响血糖值，因为摄入的塔格糖不能很好地在小肠中吸收，并且其为较低热量 的甜味剂，与蔗糖的热量相比仅仅为蔗糖的大约30%的热量。另外，塔格糖具有益生元效果 (prebiotic effect)，即通过小肠微生物发酵而促进有益的乳酸菌的增殖。但是，塔格糖通常不在自然界里存在，并且其为包含在乳制品或者一些植物中的 非常稀有的微量糖。因此，可由低价格的原材料批量生产的技术应当被开发以便用作具有 低热量的功能性甜味剂。美国专利号5002612和5078796公开了生产D-塔格糖的方法，其中该方法包括通 过使用乳糖酶将含有乳糖的物质或者乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的混合物，随机除去葡萄 糖，然后将半乳糖化学异构化成塔格糖。另外，US专利号6057135公开了生产塔格糖的方法，其中该方法包括通过水解干 酪乳清或者牛奶生产半乳糖和葡萄糖的阶段，将该半乳糖异构化成L-阿拉伯糖异构酶的 阶段，并通过使用层析法分离产物和未转化的化合物，将未转化的化合物重新循环以进行 处理的阶段。迄今为止，用于生产塔格糖的主要原料是乳乳糖或含乳糖物质的乳加工副产品。 对于上面提到的使用乳糖或者含乳糖物质的作为起始原料的生物转化工艺来说，生产塔格 糖的方法基本上应当以两步工艺来进行(乳糖一半乳糖一塔格糖)。

发明内容
技术问题本发明的发明人通过进行有关除乳糖以外生产过程中的副产品和能够从自然界 中以很低的价格供应的树木及工程副产物中富含半乳糖的原料的研究，确定大豆分离蛋白 的副产品与其他物质相比具有高含量的半乳糖，选定为可经济地使用层析的原料，然后发 现由大豆分离蛋白乳清得到的大豆寡糖实际上能够作为被工业化的原料，从而完成本发 明。因此，本发明的一个目的在于提供一种通过选择性水解大豆寡糖或者含有大豆寡 糖的水溶性糖溶液生产半乳糖的方法。另外，本发明的另一目的在于提供一种通过生产异构化产品生产塔格糖的方法， 并使用层析技术生产塔格糖，所述异构化产品通过酶异构化将水解的糖溶液中的半乳糖异 构化来制备。
技术方案为了实现上述目的，本发明提供了将源自大豆的寡糖或者将该寡糖作为主要原料 含有的水溶性糖溶液通过α“半乳糖苷酶选择性水解以生产半乳糖的方法。本发明还提供了生产塔格糖的方法，包括下列步骤1)通过α半乳糖苷酶选择性水解来自大豆的寡糖或者将该寡糖作为主要原料含 有的水溶性糖溶液；2)使用阿拉伯糖异构酶对通过水解的糖溶液中的半乳糖异构化；并且3)通过使用层析连续分离上述得到的异构化产物以获得塔格糖，然后重新循环半 乳糖；本发明还提供了在一个反应器中同时进行步骤1)和3)的方法。有益效果如上所述，本发明的发明人开发了考虑了根据每个单元过程(imitprocess)中物 料平衡和设备投资以生产塔格糖的有效方法，更具体地说，开发了采用了选择性水解以便 容易进行层析分离的方法的新的和经济的工艺。因此，本发明不是通过现有技术中的乳糖 产生塔格糖，而是可经济地通过下列方式来生产塔格糖选择性水解来自植物原料的大豆 的寡糖和将该寡糖作为主要原料含有的水溶性糖溶液以获得半乳糖，对通过将上面得到的 半乳糖异构化产生的至少混合了蔗糖、半乳糖和塔格糖3种的糖溶液进行单一层析。


通过下列结合附图给出的优选实施例的描述，本发明的上述和其他目的、特征和 优点将是容易想到的，在附图中图1和图2是混合的单糖溶液的纯层析分离步骤的模拟图；图3是显示分析大豆寡糖中糖含量的HPLC分析分布图的图示；图4是大豆寡糖的水解结果和糖成分分析；图5和图6是使用不包含转化酶的α半乳糖苷酶处理的大豆寡糖的糖成分分析
结果；图7和图8是水解的混合单糖的层析分离的模式分析；图9和图10是通过使用显微镜检查得到的塔格糖晶体与市场上的蔗糖在尺寸和 形状方面的比较的显微照片(a 蔗糖，b 塔格糖)；图11是通过使用大豆寡糖或者大豆乳清副产品作为原料生产塔格糖的步骤；图12是通过1测试(pass test)得到的洗脱曲线；图13是第9种情况(三相分离)的模拟结果的明细图(drawing detail)；图14、图15和图16是通过使用HPLC的混合单糖组合物溶液中异构化反应剂中的 糖浓度的分析结果；图17是示出了使用单一层析(single chromatography)的塔格糖生产过程的大 概流程图；以及图18是示出了通过包括结晶预处理的单一层析的生产过程的大概流程图。
具体实施例方式此后，将参照下列实施例对本发明进行详细描述，但本发明的范围不限于此。本发明包括如下步骤1)以α半乳糖苷酶选择性水解来自大豆的寡糖或者将该寡糖作为主要原料含有 的水溶性糖溶液；2)使用阿拉伯糖异构酶对通过水解的糖溶液中的半乳糖异构化；并且3)通过层析连续分离得到的异构化反应物，然后重新循环半乳糖。本发明的起始物质可包括作为分离大豆蛋白的副产品的大豆乳清，以及来自相同 来源的大豆寡糖，或者将该寡糖作为主要原料包含的水溶性糖溶液，优选可以是大豆寡糖。包含在大豆乳清中的糖大部分将蔗糖、棉子糖和水苏糖作为主要成分，并且棉子糖 和水苏糖由蔗糖和半乳糖通过α _1，4连接结合在一起构成的聚合物组成。上面提到的糖的 碳水化合物成分见下表1。包含在大豆乳清或者大豆寡糖中的单元组成成分可被分成蔗糖和 半乳糖，并且如果将这些成分再细分的话，可解释为混合的单糖诸如葡萄糖、果糖和半乳糖。[表 1] 同样地，与在本发明中使用的大豆乳清相同，通过水解得到的糖溶液也由至少以 三种糖混合的混合单糖组成，因为大多数天然存在的植物原料中的半乳糖与蔗糖或果糖一 起以碳水化合物或者多聚糖形式存在。对于作为常规方法由牛奶得到的副产品，大多数糖仅由乳糖构成，因此当水解原 料时葡萄糖和半乳糖的混合单糖很容易一次得到，然后可经济地通过成熟的层析法进行分罔。但是，使用层析法分离根据本发明的含有至少三种糖的糖溶液在没有满意的选择 条件下难以经济地进行。由于这个原因，使用除乳糖之外的其他原料经济地生产半乳糖或 者塔格糖非常困难。—般说来，按照层析法的糖分离通过使用需要分离的糖与附着在离子树脂上的金 属离子尤其是金属离子之间的弱结合力的差别来进行，所述金属离子残基可在层析分离中 使用，并且在食品应用中限于K、Na、Ca、Mg等。葡萄糖和半乳糖在物理上具有非常相似的结构，都由醛糖形式构成，而果糖由酮 糖形式构成。一般说来，由醛糖形式和酮糖形式组成的混合糖的分离可通过使用具有阳离
5子残基的树脂的层析经济地进行，并且在淀粉糖工艺中实际上已经广泛使用。但是，葡萄糖 和半乳糖具有类似物理形状的相同醛糖形式，因此葡萄糖和半乳糖可经济地仅仅使用具有 残基诸如K和Na的特定树脂即可分离。这意味着，总的来说，当将两种层析分离设备顺序 组合时，可完全地分离半乳糖。这在图1中示出。另外，混合糖的层析分离一般使用大量的 水，因此在该工艺中浓缩的成本变高，并且设备投资需要相当高的成本。在根据本发明的水解中使用的酶可以是α -半乳糖苷酶，并且更优选不含转化酶 的α-半乳糖苷酶。α -半乳糖苷酶是在自然界中存在的糖酵解酶，并选择性地切断组成棉子糖和水 苏糖的蔗糖和半乳糖之间的α _1，4连接键，从而由大豆乳清或者大豆寡糖制备将蔗糖和 半乳糖作为主要成分的糖溶液。但是，当制备可通常在工业上应用的酶时，通过培养微生物产生的上清液或者产 生酶的菌丝被用作酶制备的原料，因此大多数酶包括作为代表性糖酵解酶的转化酶。将混 合糖选择性水解成蔗糖和半乳糖对于在本发明的层析的有效性来说是必需的，因此使用不 含转化酶的α-半乳糖苷酶有利于使用层析进行的分离。α-半乳糖苷酶来自于其中不包括转化酶基因的菌株。更优选地，α-半乳糖苷 酶可来源于 Mortierella vinaceae var. raffinose utilizer ATCC20034 或者 Absidia griseola ATCC 20431。在本发明的优选实施方式中，本发明得到具有降低的蔗糖含量的糖溶液，所述降 低的蔗糖含量通过使用α-半乳糖苷酶水解大豆寡糖然后进一步选择性地对得到的含有 蔗糖和半乳糖的糖进行蔗糖结晶预处理得到。由于大豆寡糖包括了过量的蔗糖，存在糖溶 液体积增加、工厂规模增加以及损失纯净水增加等等不良影响。由于这种原因，该进展的效 用通过对蔗糖结晶进行预处理来降低。本发明使用通过使用上面提到的α -半乳糖苷酶选择性水解的糖溶液完成了经 济地生产塔格糖或者半乳糖的技术，并且阿拉伯糖异构酶可被用于将通过本发明得到的半 乳糖转化成塔格糖。优选地，使用来自 Sulfurobus sp.，Thermotoga sp.或者 Geobacillus sp.的嗜 热阿拉伯糖异构酶。更优选地，可使用来自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana) DSM5068的嗜热阿拉伯糖异构酶。对于本发明，通过层析法分离由通过水解和异构化得到的含有蔗糖、半乳糖和塔 格糖的混合糖组成的糖溶液。更优选地，使用层析三相分离法。对于可逆反应诸如异构化，通常在经济操作条件下理论上存在相平衡状态，但在 理论上所有物质都不可能转化成产物。因此，对于这种糖工艺，需要使用层析法的非反应物 的经济形分离和再循环。这种生产技术的另一核心在于层析的经济性实施的可能性。在层析分离中用于糖溶液分离的树脂可以是具有Ca残基的树脂。在层析分离步骤中非反应物的再循环根据下列糖溶液的种类本领域技术人员在 需要的情况下可任意选择。对将塔格糖(≥ 90% )作为主要成分含有的糖溶液，可在塔格糖浓缩之后在需要 时将非反应物结晶。对将半乳糖作为主要成分含有的糖溶液，可根据糖溶液中成分的含量比可选择性地再循环到异构化前步骤或者进行结晶前步骤。对将蔗糖作为主要成分含有的糖溶液，可通过浓缩或者结晶处理将非反应物用作 糖溶液或者用于生产的其他原料。此后，将参照实施例对本发明进行更为详细地描述。但是，这些实施例仅仅用于解 释本发明，本发明的范围不限于此。实施例在本发明的实施例中，对工业副产品中的糖成分进行分析和评估以便保证原料通 过层析分离经济地得到塔格糖或者半乳糖。通过使用α-半乳糖苷酶对所选大豆乳清或者 大豆寡糖进行选择性水解制备水解产物，然后可从水解产物中完全分离半乳糖或者塔格糖 的经济生产技术已经被开发。尤其是，通过在该过程中引入连续再循环过程，开发的高产量 经济生产以便将它们提取的技术进一步完成。由于这个原因，加工材料的副产品可以很容易在实验室中得到，由作为主要成分 的碳水化合物构成的原料首选被选择作为用于生产塔格糖的原料，包含在水溶液状态中的 水溶性糖成分(包括单糖、二糖和寡糖)的成分和含量被详细分析，并且确定用于层析分离 的简易组分类型的使用可能性。通过上面提到的研究结果，我们已经发现，与其他原料相比，作为分离大豆蛋白的 副产品的大豆乳清、大豆寡糖和由大豆寡糖得到的水溶性糖溶液具有用于经济地分离半乳 糖或者塔格糖的极佳组分。并且，我们已经在技术上使用其完成了生产塔格糖的工艺。实施例1.工业副产品中糖组分的分析从市场上购买的大豆寡糖为从中国市场收集并用作标准样品。进行HPLC以便分 析得到的大豆寡糖中的碳水化合物成分。Supelco-PB糖分离柱(SUPELC0)被用作分离柱， 并且分析条件使用纯净水0.5mL/分钟作为流动相。HPLC级试剂(sigma)分别被用作标准 溶液。得到的结果在表2中示出。[表2]大豆寡糖组分 对于大豆寡糖中的碳水化合物组分，棉子糖和水苏糖的含量比例构成了总碳水化 合物的73. 5%，并且在剩余糖中蔗糖和果糖的含量比例为26. 5%。图2是按比例的HPLC分析层析。实施例2.大豆寡糖中糖含量分析以及酶水解反应后的分析将实施例1中的大豆寡糖使用α -半乳糖苷酶处理并用作半乳糖源。所使用的酶 为真菌蛋白酶(Validase)AGS (Valley Research，美国)，所使用的酶量分别占作为底物的 大豆寡糖产品的0.15% (w/w)，并在50°C下以150rpm搅拌进行水解。根据时间通过使用 α-半乳糖苷酶进行水解的半乳糖生产和糖成分的变化在表3中示出。真菌蛋白酶允许通过作为大豆寡糖的水苏糖的降解生产棉子糖和半乳糖，并倾向 进一步将棉子糖降解为蔗糖和半乳糖。真菌蛋白酶的主要成分为α-半乳糖苷酶，并且真 菌蛋白酶为在饲料中加入的产品，用于减少由于通过大豆寡糖的水解产生的大豆寡糖消化 而引起的副作用，诸如腹泻、腹痛等等。如图3所示，产品中的α-半乳糖苷酶具有选择性水解大豆寡糖中的半乳糖-半 乳糖键合以及半乳糖-蔗糖键合的功能，但也有通过降解蔗糖产生葡萄糖和果糖的转化酶 功能。存在一种没有先例的现象是24小时之后蔗糖没有剩余，但葡萄糖和果糖却持续 产生。这能够推断通过降解水苏糖和棉子糖产生的蔗糖由真菌蛋白酶的转化酶功能降解， 于是产生蔗糖和果糖。水解开始50小时后，存在半乳糖、果糖以及葡萄糖不再产生的现象。 此时，糖组分在表3中示出。[表3]根据真菌蛋白酶的大豆寡糖溶液的组分 实施例3.不含转化酶的α -半乳糖苷酶如上所述，使用容易使用的酶以便使用层析选择性水解蔗糖和半乳糖是必需的， 因此需要使用α-半乳糖苷酶选择性切割构成棉子糖和水苏糖的蔗糖与半乳糖之间的 α_1，4连接键的技术。但是，通常可在工业上使用的酶的生产可通过下列方式进行选择可在细胞外 分泌过量所需的酶的微生物或者菌丝，在液体或固体中培养微生物或者菌丝，并使用其上
8清液作为生产酶的原料。与α-半乳糖苷酶相同，用于工业目的的市售和分销的酶的类 型大多数使用了菌丝培养上清液作为制备酶的原料，该菌丝为诸如黑曲霉(Aspergillus niger)等，并且大多数培养上清液在它们的酶溶液中包括转化酶。转化酶为自然界中存在的大多数生物所具有的代表性糖水解酶，具有轻易地水解 蔗糖及其类似物的酶特征。因此，包括在酶溶液中的转化酶将糖溶液中存在的蔗糖迅速水 解成葡萄糖和果糖，因此这种功能是阻碍塔格糖经济生产的主要因素。因此，本发明的发明人详细地研究了在微生物或者菌丝中可产生α-半乳糖苷酶 的生物是否可产生转化酶。结果在表4中示出。[表4]是否可产生转化酶 在本发明中，仅仅产生α-半乳糖苷酶但不产生转化酶的Mortierelialla vinaceavar Raffinose utilizer Absidia griseola 白勺角牟_。在本发明中使用的不含转化酶的α-半乳糖苷酶从真菌即来自ATCC的 Mortierella vinaceae var. raffinose utilizer ATCC20034 或者 Absidia griseola ATCC20431 得到。用于菌株的培养基组分为0. IM磷酸缓冲液(ρΗ6. 0)、10g/L乳糖、3g/L蛋白胨、3g/ L酵母提取物、0. 5g/L氯化钾、0. 5g/L硫酸镁以及少量硫酸铁。30°C下培养3天之后，通过 使用过滤系统(CORNING，BOTTLE和BOTTLE TOP FILTERS)仅仅从培养基中收集每个菌株。 将收集的菌株定入到冰上，然后通过使用均浆器溶解10分钟。然后，通过使用lOOOOrpm离 心10分钟从上清液得到最终酶溶液。通过使用得到的酶溶液对大豆寡糖进行酶水解。水解的反应条件为40°C下进行7小时。然后进行HPLC分析(SUPELCO，SUPELCOGEL PbHPLC Column)以确定糖含量。结果显 示，通过使用无转化酶的α-半乳糖苷酶选择性水解将大豆寡糖分别选择性地水解成蔗糖 和半乳糖。结果在图5和图6中示出。实施例4.通过使用L-阿拉伯糖异构酶将半乳糖转化成塔格糖的异构化转化反应。根据本发明的从半乳糖到塔格糖的异构化反应通过使用来自新阿波罗栖热袍菌 (Thermotoga neapolitana) DSM5068的嗜热阿拉伯糖异构酶来实现，所述微生物为高嗜热 微生物，并且其通过来自超嗜热菌(hyperthermophlie)的阿拉伯糖异构酶在棒状杆菌宿 主中以表达。将编码阿拉伯糖异构酶的基因分别插入到为大肠杆菌_棒状杆菌穿梭载体的 pCJ-Ι和pCJ-7(韩国专利特许公开号10-2006-0068505)中，然后最终得到了作为宿主的谷 氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCTC 13032。将 20% (w/v)表达热稳定性酶 的菌株与2.0%的海藻酸钠溶液混合，然后搅拌以制备悬浮的溶液。通过以自然滴落的方式 将悬浮的溶液滴入0. IM CaCl2溶液中诱导硬化反应。通过该过程制备的细胞捕获藻酸盐固
(cell-captured alginate curing bead) ^.MW^'Sx.M (immobilization)中il!用。 20mM pH 7. 5的Tris-HCl缓冲液加入到作为产物得到的糖溶液中以调节pH，然后用作反应 底物溶液。通过该过程得到的阿拉伯糖异构酶被用于获得异构化产品。实施例5.水解的混合单糖的层析分离模式分析进行层析分离模式分析以便使用根据本发明的实施例得到的异构化产品(混合 的单糖)设计半乳糖的层析分离方式。对于混合单糖的层析分离，使用如下物质和设备进行试验。将FINEXMFG220 Ca++(FINEX)用作分离糖的树脂，并在60°C下使用纯净水作为流动相以IlmL/分钟的流速进 行。使用串联的两根XK50/100柱(Ammersham Bioscience，USA)，并在每根柱中填充1900mL 树脂待用。用于分离的混合糖以每次160mL 50Bx浓度的糖溶液而使用。使用的混合单糖 的组成首次先为蔗糖半乳糖=80 20来使用，第二次随机调节至半乳糖塔格糖= 50 50以其作为检测样品来使用进行分离模式分析。检测结果显示蔗糖、半乳糖和塔格糖 可以很容易地分别以有规律的间隔分离。结果在表7和表8中示出。实施例6.塔格糖结晶使用从实施例5中的层析分离中回收的溶液尝试进行塔格糖结晶。回收塔格糖的 最终含量为90%的部分，然后在结晶器中将其抽真空、加热并浓缩至70Bx糖浓度。将温度 降低到50°C，以每小时2°C缓慢冷却，并在40°C下加入塔格糖种子以便结晶。观察到其中上清液中的糖浓度根据塔格糖结晶处理而相对被稀释的现象。并且在 结晶过程中连续进行真空浓缩以便稳定保持待稀释上清液的浓度。在结晶过程中上清液的 浓度稳定保持在至少65BX以保持晶体产生和结晶。在20小时后停止结晶，然后使用离心机分离上清液和晶体。在初始晶体溶液中回 收71%的塔格糖；塔格糖的纯度为从90%到至少98%。通过离心分离的塔格糖进一步在 50°C下使用真空干燥炉干燥1小时。用显微镜观察到的通过该过程产生的塔格糖的照片在 图9和图10中示出。并且，将其尺寸和形状与市场上购买的蔗糖进行比较。
实施例7.使用层析分离从大豆乳清中进行塔格糖的连续再循环生产计划通过实施例使用大豆乳清副产品或者大豆寡糖作为原料的生产工艺按照如下 方式计划，并在图11中粗略描述。在下列步骤中用于改善产品质量的工艺，诸如脱色 (dicolorization)、脱盐以及类似工艺不被单独插入，并可根据加工过程中的质量变化选 择性地插入/排除。1、在通过超声过滤或微过滤等预处理之后，从大豆乳清副产品分离大豆寡糖；2、在高温或低温下水解大豆寡糖溶液(浓度10 50% )(当使用来自超嗜热菌 (hyperthermophilie)或者霉菌的酶时)；3、通过层析分离水解的蔗糖和半乳糖，浓缩过程可在该处理过程中根据糖浓度选 择性地插入或者排除；4、将半乳糖(至少50% )作为主要成分含有的层析分离溶液通过L-阿拉伯糖异 构酶(或者L-半乳糖异构酶)反应器以生产塔格糖；5、对半乳糖、塔格糖和少量混合糖组成的异构化产品进行层析分离，浓缩过程可 根据加工过程中糖浓度选择性地插入或者排除；6、结晶并浓缩(在需要的时候)将塔格糖作为主要成分(至少70%)含有的层析 分离溶液；7、将含有塔格糖作为主要成分的层析剩余溶液重新循环至异构化反应器的步 骤；8、根据糖溶液中的成分将通过塔格糖结晶得到的无定形工作液重新循环至结晶 或者异构化前步骤的步骤。实施例8.混合单糖的三相分离使用包括的所有糖以混合形式进行用于整个过程的物质平衡的1测试(1 pass test)，得到的结果用于使用层析分离技术连续再循环产品的计划模拟。使用混合糖进行1测试，并通过得到的结果计算基本参数。每种成分的浓度分布 图使用新的模拟移动床系统(Oragno，Japan)在计算机上被模拟，计算有关每个部分的成 分纯度和回收率。将流出液分成每个部分。对每个部分进行HPLC分析，并通过分析结果得 到每个组分的洗脱曲线，测试每个洗脱模式，并计算每种成分的基本参数。1测试条件在表 5中示出。每个部分的分析方法在表6中示出。HPLC分析条件在表7中示出。[表5] 1 测试(pass test)条件
11 [表6]分析方法Brix 浓度 [表7]HPLC分析条件 通过1测试得到的洗脱曲线在图12中示出。 通过洗脱曲线的结果计算基本参数，并进行计算机模拟以便计算分离性能。模拟 条件在表8中示出。为了达到最佳分离性能值，本发明的发明人改变糖溶液样品与作为流 动相的水的比例(脱着剂/供应体积之比)，然后根据变化分析整个溶液中的糖成分。然后计算来自上面提到的回收部分中的糖成分的纯度和回收率。表9中第6、7、8和9种情况为 通过模拟结果得到的质量平衡表。在每个模拟中，获得具有优选90%的纯度的塔格糖。第 9种情况的模拟结果的详细图解在作为代表性图示的图13中示出。[表8]模拟条件[表9]模拟结果概述 在该实施例中公开的性能是在organo计算机模拟上计算的结果。实施例9. L-阿拉伯糖异构酶在混合单糖中的反应稳定性对于在本发明中建议的三相层析生产塔格糖的经济的方法与迄今为止使用的将 半乳糖异构化成塔格糖的方法不同，除了半乳糖之外，底物溶液组分的主要成分为糖(葡 萄糖、蔗糖、果糖)。因此，对于采用本发明的技术的重要前提是包括在组分中的其他糖是否 干扰使用酶进行的异构化反应。为了使用在本发明的实施例中使用的异构酶，本发明的发 明人试图公开在混合单糖组分溶液中的半乳糖异构化的底物专一性。将蔗糖、葡萄糖和果糖以一定比例加入到100g/L浓度的半乳糖溶液中制备每种底物溶液。每种糖成分的组分比为(a)蔗糖葡萄糖半乳糖果糖=0:0:1:0， (b)蔗糖葡萄糖半乳糖果糖=3 1 1 1，(c)蔗糖葡萄糖半乳糖果糖= 0:3:1:2。每种糖成分比例以随机制备与通过如下三种情况得到的糖成分的比例相 同水平来使用，(a)当仅含有半乳糖作为对照时，(b)当在寡糖中选择性水解半乳糖之间的 1，4_连接键时，(c)当通过完全水解完全分解成单糖时。将浓度10% (w/v)的在诱导培养基中培养的保藏菌株(CJ-1-TNAI，KCCM10786P) 加入到底物混合溶液中，并在70°C下进行半乳糖异构化1小时。反应后，将混合溶液在4°C 下冷却15分钟，然后以12，OOOrpm离心15分钟之后选择上清液。使用纯净水将得到的上 清液稀释5陪，并通过0. 45 μ m注射过滤器(Millipore，USA)，然后使用HPLC进行分析。使用HPLC对在混合单糖组分溶液中的异构化产物中的糖浓度的分析结果在图 14、图15和图16中示出。每种糖的标准溶液的定量结果在图10中示出。[表10] 根据该结果，可以知道半乳糖异构化不受反应速度的影响，并且在混合有大量的 蔗糖、葡萄糖和果糖的混合糖溶液中达到具有相同水平(达到相等水平，即对于本发明来 说是30.8%)的转化率。因此，可以知道由至少来自大豆寡糖的原料水解产物得到的葡萄 糖、果糖和蔗糖对于使用酶的半乳糖异构化行为来讲不起反应中断因子的作用。实施例10.通过使用三相分离技术对来自大豆乳清水解产物的塔格糖的连续再 循环生产工艺的设计在实施例6中公开的塔格糖的生产过程使用两次层析，这需要大量的纯净水和浓 缩过程。对于本发明来说，为了有效克服该问题，本发明的发明人已经计划了通过改进的层 析计划使用一次层析来生产塔格糖的方法，并在实施例中对其具体地描述。使用单次层析生产塔格糖的过程设计如下，并在图17中粗略示出。在下列步骤中 用于改善产品质量诸如脱色、脱盐等等步骤不单独插入，并可在下列过程中根据质量的变 化选择性地插入/排除。
1、在通过超滤、微滤以及类似方法预处理之后，从大豆乳清的副产品中分离大豆
寡糖；2、在高温或低温下水解大豆寡糖溶液(浓度10 50% )(当使用来自超嗜热菌 (hyperthermophilie)或者霉菌的酶时)；3、将蔗糖和半乳糖作为主要成分(总计至少90% )含有的水解糖溶液中的半乳糖 经L-阿拉伯糖异构酶(或者L-半乳糖异构酶)反应器异构化成塔格糖；4、使用层析将由具有蔗糖、半乳糖和塔格糖作为主要成分(总计至少90% )组成 的混合糖的异构化产物分离成三相。浓缩过程可根据加工过程中糖浓度选择性地插入或者 排除。通过来自上面提到的层析得到的糖分离溶液有三种，如下A.浓缩(在需要的情况下)并结晶成将塔格糖作为主要成分(至少90% )含有 的层析分离溶液；B.根据糖中成分的含量比，将塔格糖作为主要成分含有的层析残余溶液可选择性 地重新循环至异构化反应器或者结晶的前一步骤；C.含有塔格糖作为主要成分的层析残余溶液可被进行浓缩或者结晶以便进一步 被处理为蔗糖溶液，或者可被用作生产其他产品的高级原料；5、根据糖溶液中的组分，将从塔格糖结晶得到的无定形母液重新循环至结晶前的 步骤或者异构化前的步骤。实施例11.通过使用蔗糖结晶预处理对来自大豆乳清水解产物的塔格糖的连续 再循环生产工艺的设计作为通过使用上面提到的设计的单次层析的生产塔格糖的方法的极大前进， 本发明的发明人设计了通过蔗糖结晶过程降低糖溶液中蔗糖的含量来降低加工效用 (utility)ο大豆寡糖包括过多蔗糖，因此存在糖溶液体积增加、工厂规模增大以及损失的纯 净水增加等等不期望的影响。使用包括蔗糖结晶作为预处理的单次层析的生产塔格糖的工艺设计如下，并在图 18中粗略示出。在下列步骤中用于改善产品质量诸如脱色、脱盐等等步骤不单独插入，并可 在下列过程中根据质量的变化选择性地插入/排除。1、在通过超滤、微滤以及类似方法预处理之后，从大豆乳清的副产品中分离大豆
寡糖；2、在高温或低温下水解大豆寡糖溶液(浓度10 50% )(当使用来自超嗜热菌 (hyperthermophilie)或者真菌的酶时)；3、通过对水解寡糖溶液中蔗糖结晶得到含有更多增加的半乳糖含量的糖溶液；4、通过L-阿拉伯糖异构酶(或者L-半乳糖异构酶)反应器将含有蔗糖和半乳糖 作为主要成分(总计至少90%)的糖溶液中的半乳糖异构化为塔格糖。5、使用层析将由具有蔗糖、半乳糖和塔格糖作为主要成分组成的混合糖的异构化 反应溶液分离成三相。浓缩过程可根据加工过程中糖浓度选择性地插入或者排除。通过来 自上面提到的过程的层析得到的糖分离溶液有三种，如下A.含有塔格糖作为主要成分(至少90% )的层析分离溶液可被浓缩(在需要的 情况下)并可被结晶；
B.根据糖中组分的含量比，含有塔格糖作为主要成分的层析残余溶液可选择性地 重新循环至异构化反应器或者结晶的前一步骤；C.将塔格糖作为主要成分含有的层析残余溶液可被进行浓缩或者结晶处理以便 进一步被处理为蔗糖溶液，或者可被用作生产其他产品的高级原料；6、根据糖溶液中的成分将从塔格糖结晶中得到的无定形母液重新循环至结晶前 的步骤或者异构化前的步骤。
权利要求
一种生产塔格糖的方法，包括下列步骤a.从大豆乳清的副产品中分离大豆寡糖；b.使用不包含转化酶的α 半乳糖苷酶水解大豆寡糖；c.通过使用阿拉伯糖异构酶将水解的糖溶液异构化得到包括具有蔗糖、半乳糖和塔格糖作为主要成分的混合糖而组成的异构化产品；以及d.通过使用层析分离异构化反应溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤b)之后进一步包括在水解的大豆 寡糖中通过结晶蔗糖获得具有降低的蔗糖含量的糖溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤d)之后进一步包括在处理过 程中再循环未反应的半乳糖的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，未反应的半乳糖通过层析分离，并再循环 至步骤b)或者步骤c)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，大豆乳清的副产品通过超滤或者微滤进 行预处理。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，大豆寡糖的浓度为10 50%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，水解在40°C 80°C下进行。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，α-半乳糖苷酶来自Mortierella vinaceae var. rafinoseutilizer ATCC 20034 或者 Absidia griseola ATCC 20431。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，α-半乳糖苷酶选择性切割蔗糖和半乳糖 之间的α-1，4连接键。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蔗糖和半乳糖通过步骤b)的水解得到。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阿拉伯糖异构酶来自嗜热新阿波罗栖热 IS胃(thermotoga neapolitana)DSM 5068。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，异构化反应溶液具有总量至少90%的蔗 糖、半乳糖和塔格糖。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d)中的层析为单层析。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤d)中的层析使用具有Ca残基的树脂。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)到c)在一个反应器中同时进行。
16.一种生产塔格糖的方法，包括下列步骤a.从大豆乳清的副产品中分离大豆寡糖；b.使用无转化酶的α-半乳糖苷酶水解大豆寡糖；c.从水解的糖溶液中通过层析分离蔗糖和半乳糖；d.通过使用阿拉伯糖异构酶将半乳糖作为主要成分含有的层析分离溶液异构化；以及e.通过层析分离异构化产物得到塔格糖。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于，在步骤d)之后进一步包括将未反应的半乳 糖再循环至步骤d)步骤。
全文摘要
本发明涉及使用来自大豆的寡糖或者含有寡糖的水溶性糖溶液生产塔格糖的工艺。更具体地说，本发明的工艺包括通过使用α-半乳糖苷酶选择性水解来自大豆的寡糖，从通过酶异构化从水解产物得到的半乳糖生产塔格糖，并通过层析技术分离塔格糖并再循环未反应物。
文档编号C07H1/08GK101925609SQ200980103383
公开日2010年12月22日 申请日期2009年1月28日 优先权日2008年1月28日
发明者朴承源, 李康杓, 李英美, 金成俌, 金政勋, 金镇夏 申请人:Cj第一制糖株式会社