经修饰瘦素多肽和其用途的制作方法

专利名称：经修饰瘦素多肽和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及经至少一个非天然编码氨基酸修饰的瘦素多肽。
背景技术：
肥胖(ob)基因产物瘦素是体重调控的一个重要循环信号(Zhang Y等人，(1994) Nature 372 :425_432)。非功能性ob基因纯合型小鼠因过度进食和代谢效率增加而变得病 态性肥胖和呈糖尿病性。1995年，Tartaglia L A等人(Cell 83 :1263_1271)描述鼠类瘦 素的一种高亲和力受体(0B-R)。有迹象表明，瘦素减轻体重的作用可通过经由下丘脑中的 0B-R 进行信号转导来介导(Lee G H 等人，(1996) Nature 379:632-635)。剪接变异体表达的调控可在信号转导分子的活性中具有重要作用且牵涉数种疾 病的发病机理(Khachigian L M等人，(1992)Pathology 24 :280_290)。举例来说，产生磺酰 脲受体基因的新剪接变异体的突变会隔离家族持续性高胰岛素血症性低血糖症(ThomasPM 等人，(1995) Science 268 :426_429)。已描述小鼠0B-R的至少9种替代性剪接形式(Lee等人，同上)。一种剪接变异 体B219表达于小鼠卵黄囊、早期胎儿肝脏、富集的造血干细胞、多种淋巴造血细胞系中和 成体生殖器官中，且可能直接参与造血和生殖(Cioffi JA等人，(1996) Nature Medicine2 585-589)。关于瘦素和瘦素受体在生殖中的作用的额外证据来自Chehab F F等人，其报导 瘦素治疗会修正ob/ob雌性小鼠中的不孕缺陷(1996，Nature Genet 12 :318_320)。研究人 员指出，瘦素通过恢复必需的下丘脑和垂体激素水平而不是通过减少脂肪来改善生育力。产生替代性剪接的转录物的0B-R突变是形成db/db小鼠的重度肥胖表型的 原因(Chen H等人，(1996)Cell 84:491-495)。基于人类与小鼠染色体之间的同线性 (synteni)，0B-R的人类形式很可能对应于人类染色体lp31 (Lee等人，同上)。在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中尝试进行的基因组定序已分别揭示推定的开放阅读框架(0RF)C30B5. 2和 YJR044c (Wilson R 等人，(1994)Nature 368 32-38 ；Huang M E 等人，(1995)Yeast 11: 775-781)。YJR044c与C30B5. 2的氨基酸序列有27%相同且有71 %类似，且共享类似的疏 水性模式。YJR044C已表征为推定的膜相关蛋白质(Wilson等人，同上)。C30B5. 2氨基 酸序列与磷脂酶A2(—个从甘油的第二个碳基团释放脂肪酸的酶的家族)具有共同模式 (CCxxHxxC)。认为诸如瘦素受体等许多信号转导分子是通过表达分子的剪接变异体来调控活 性。新颖瘦素受体相关蛋白质可提供诊断和治疗与由代谢病症所致的信号转导事件相关的疾病状态的基础，所述代谢病症为诸如肥胖症和糖尿病以及生殖病症(包括不孕不育症)。与亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)共价连接是对许多生物活性分子(包 括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半 衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间的方法。PEG已广泛用于药物、人工植入 物，以及生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其它应用中。为最大化PEG的所需 性质，连接到生物活性分子上的一种或一种以上PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足 够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加的水溶性和循环半衰期)，而 不会不利地影响母体分子的生物活性。PEG衍生物通常通过例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端以及碳水化合物 部分等反应性化学官能团与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可 用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适于通过聚合物连接来修饰的位点在受体结合中 起重要作用，并且对于分子的生物活性保持来说是必需的。因此，聚合物链与生物活性分子 上的这些反应性位点的杂乱连接通常导致聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至 完全丧失。R. Clark 等人，(1996),.T. Biol. Chem.，271 :21969_21977。为形成具有足够聚合 物分子量以赋予标靶分子以所需优点的接合物，先前技术方法通常涉及多个聚合物臂与分 子的随机连接，从而增大母体分子的生物活性降低或甚至完全丧失的风险。形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点由蛋白质的结构指示。蛋白质 (包括酶)由多个a氨基酸序列构成，所述序列具有一般结构H2N--CHR--C00H。一个氨基 酸的a氨基部分(H2N-_)与相邻氨基酸的羧基部分(一C00H)连接形成酰胺键联，其可表 示为一(NH--CHR--C0)n--，其中下标“n”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有关于 蛋白质生物活性和用于连接PEG衍生物的反应性位点。举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在￡位以及a位存在--NH2部分。￡--NH2 在碱性pH值条件下不反应。用PEG进行蛋白质衍生领域中的许多技术是针对开发用于连接 蛋白质中存在的赖氨酸残基的￡—NH2部分的PEG衍生物。“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" , Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003，第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有常见限制其不能在蛋白质表面上存在的通 常众多赖氨酸残基之间进行选择性安装。在赖氨酸残基对于蛋白质活性较为重要(例如存 在于酶活性位点中)的情况下或在赖氨酸残基在介导蛋白质与其它生物分子的相互作用 中起作用(如在受体结合位点的情况下)的情况下，这可能是一个重要限制。蛋白质聚乙二醇化的现有方法的又一个同样重要的复杂情况在于PEG衍生物可 能经历与除所需残基以外的残基发生的不需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分 (其结构表示为一N(H)--)，但许多与e -NH2反应的化学反应性物质也可与一N(H)--反 应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有自由巯基，其结构表示为一SH。在一些情况下，针 对赖氨酸的￡--NH2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可以产 生PEG衍生的生物活性分子的复杂的异质混合物，并且存在破坏所靶向生物活性分子的活 性的风险。将需要开发出允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物，其 随后将使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质表面上确定以及可预测的特定位点 处的生物活性分子选择性偶合。除赖氨酸残基之外，所属领域中也已作出相当大的努力来开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活化PEG试剂。例如，参看以引用的方式并入 本文中的美国专利第 6，610，281 号，以及"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" , Nektar Molecular Engineering Catalog,2003,第 1-17 页。可 使用定点诱变和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结 构中，并且所得自由巯基部分可与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方 法的复杂之处在于引入自由巯基可能使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此， 将需要获得一种将化学官能团引入生物活性分子中的方法，其使得一种或一种以上PEG聚 合物能够与蛋白质选择性偶合，同时可与巯基和蛋白质中通常可见的其它化学官能团相容 (即，不会发生不需要的副反应)。从所属领域中的取样来看，在已开发的用于连接蛋白质侧链(具体来说，赖氨酸 氨基酸侧链上的一NH2部分和半胱氨酸侧链上的--SH部分)的这些衍生物中，已证实许多 衍生物的合成和使用存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键联，其经历水解并因此 分解、降解或以其它方式在水性环境中(例如在血流中)不稳定。关于PEG-Intron 中键 联的稳定性的论述，参看Pedder，S. C. Semin Liver Dis. 2003 ；23增刊1 19-22。一些衍生 物形成较稳定的键联，但在形成所述键联之前经历水解，这表示PEG衍生物上的反应性基 团可能在可连接蛋白质之前已失活。一些衍生物稍有毒性并且因此不太适于活体内使用。 一些衍生物因反应过慢而不能实际使用。一些衍生物因与负责蛋白质活性的位点连接而导 致蛋白质活性丧失。一些衍生物在其将连接的位点中不具特异性，这也可能导致所需活性 丧失并缺乏结果的再现性。为克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关的挑战，已开发 出更稳定(例如，美国专利6，602，498，其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的 硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6，610，281，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍 生物。所属领域中无疑需要在要求选择性反应形成稳定化学键之前在生理环境中呈化学惰 性的PEG衍生物。近年来，已报导蛋白质科学中的全新技术，其有希望克服众多与蛋白质的位点特 异性修饰相关的限制。具体来说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli ;E. coli)(例如，L. Wang 等人，(2001)，Science 292 498-500)以及真核生物酿酒 酵母(Sacchromyces cerevisiae ；S. cerevisiae)(例如，J. Chin 等人，Science 301 964-7(2003))的蛋白质生物合成机制中，其使得能够在活体内将非遗传编码氨基酸并入蛋 白质中。使用此方法，已回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的许多 新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光致异构化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸)有 效且高保真地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中。例如，参看J.W. Chin等人，(2002)， Journal of the American Chemical Society 124 :9026_9027；J. ff. Chin禾口P.G. Schultz, (2002)，ChemBioChem 11 :1135_1137 ;J. W. Chin 等人，(2002)，PNAS United States of America 99 :11020_11024 ；以及 L. Wang 和 P. G. Schultz，(2002)，Chem. Comm.，1—10。这些 研究已证实有可能选择性地并且常规地引入蛋白质中不存在的化学官能团(例如酮基、炔 基和叠氮部分)，所述官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的所有官能团都呈化学 惰性并且可用于有效并选择性地反应形成稳定共价键联。在蛋白质中并入非遗传编码氨基酸的能力允许引入可能提供天然存在的官能团 (例如赖氨酸的￡--NH2、半胱氨酸的巯基一SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的官能团呈惰性， 但完全并有效地反应形成稳定键联。举例来说，所属领域中已知叠氮基和乙炔基在催化量 的铜存在下在水性条件下经历休斯根(Huisgen) [3+2]环加成反应。例如，参看Tornoe等 人，(2002) Org. Chem. 67 :3057_3064 ；和 Rostovtsev 等人，(2002)AnRew. Chem. Int. Ed. 41 2596-2599。举例来说，通过在蛋白质结构中引入叠氮部分，能够并入对蛋白质中存在的胺、 巯基、羧酸、羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分平稳并有效地反应形成环加成产物的官能 团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮化物在其它蛋白质侧链存在下在生理条件 下仍保持化学惰性并且不反应。所属领域中已知投予外源性瘦素来治疗肥胖症(Heymsfield等人，JAMA. 282 1568-1575,1999)和增加内源性瘦素产生(例如参看美国专利公开案第2007/0203225号) 的方法，这两篇参考文献出于所有目的均以引用的方式并入本文中。瘦素具有若干超出 能量平衡调控的作用，除肥胖症管理以外，一种增加血清或循环瘦素的方法还可适用于调 节葡萄糖和脂质代谢、下丘脑-垂体神经内分泌功能、治疗不孕不育症，和促进免疫功能、 造血以及增加血管生成和创伤愈合。举例来说，最近已显示，瘦素投药在因脂肪沉积缺陷 (脂肪营养不良)而患糖尿病的人类中改良葡萄糖控制和降低血清脂质(三酸甘油酯) (Oral等人，New Engl. J. Med.，2002)。已从活体外培养的脂肪细胞的实验中获得数据，表 明葡萄糖利用是胰岛素介导的瘦素基因表达和瘦素分泌的重要决定因素(Mueller等人， Endocrinology, 1998)。还指出，葡萄糖厌氧代谢成乳酸盐不会导致瘦素分泌增加(Mueller 等人，Obesity Res.，8 :530_539，2000)。额外信息指出一种需要增加转运到线粒体中的底 物以用于三羧酸(TCA)循环中的氧化的机理，胰岛素介导的葡萄糖代谢正是通过这一代谢 途径来调控瘦素产生(Havel 等人，Obesity Res.，Abstract, 1999)。本发明尤其涉及与瘦素多肽的活性和制备相关的问题，并且也涉及具有改良的生 物或药理学性质的瘦素多肽的制备。

发明内容
本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽。在一些实施例中，瘦素多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，瘦 素多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，瘦素多肽是与双官能聚 合物、双官能连接子或至少一个其它瘦素多肽连接。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水 溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是双官能聚合物。 在一些实施例中，双官能聚合物是与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是瘦素多 肽。在一些实施例中，瘦素多肽包含至少两个与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合 物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。瘦素的核苷酸序列、氨基酸序列和二级结构区在所属领域中为众所周知的且已论 述和揭示于若干参考文献中，所述参考文献包括F. Peelman等人，(2004)，J. Biol. Chem.， 279 41038-41046 ；Zhang 等人，(1997)Nature 387,206-209 ；Kline 等人，(1997)，Fed. Eur. Biochem. Soc. ,407 239-242 ；RCSB Protein Data Bank" Obesity Protein"，UniProtreferenceQ6NT58 ；各以引用的方式并入本文中。瘦素的二级结构可说明如下，其中氨基酸 位置在中间行指出螺旋A螺旋B螺旋C螺旋D[1-3]-[4-26]-[27-50]-[51-67]-[68-70]-[71-93]-[94-120]-[121-142]-[143-146]N末端A-B环B-C环C-D环C末
端对于SEQ ID NO :4，所述区为相同的且C末端包括氨基酸位置143-147。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入一个或一个以上以下区 中的任何位置，所述区对应于瘦素中的二级结构，如下SEQ ID NO :2或由SEQ ID N0:1编 码的相应氨基酸的1-3 (N末端)、4-26 (A螺旋)、27-50 (A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、 51-67 (B螺旋),68-70 (B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环),71-93 (C螺旋),94-120 (C螺旋 与D螺旋之间的区，C-D环),121-142 (D螺旋),143-146 (C末端)。在一些实施例中，一个 或一个以上非天然编码氨基酸并入一个或一个以上以下区中的任何位置，所述区对应于瘦 素中的二级结构，如下SEQ ID NO :4或由SEQ ID NO :3编码的相应氨基酸的1_4 (N末端 区)、5-27 (A螺旋)、28-51 (A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、52-68 (B螺旋)、69-71 (B 螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、72-94(C螺旋)、95-121 (C螺旋与D螺旋之间的区，C-D 环)、122-143 (D螺旋)、144-148 (C末端区)。在其它实施例中，非天然编码氨基酸在选自 由以下组成的群组的位置处进行取代hGHSEQ ID NO :2或由SEQ ID NO :1编码的相应氨基 酸的残基 1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-55、56-60、 61-65、66-70、71-75、76-80、81-85、86-90、91-95、96-100、101-105、106-110、111-115、 116-120、121-125、126-130、131-135、136-140、141-146。在另一实施例中，非天然编码氨 基酸在选自由以下组成的群组的位置处进行取代hGH SEQ ID NO 4或由SEQ ID NO 3编 码的相应氨基酸的残基 1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、 51-55、56-60、61-65、66-70、71-75、76-80、81-85、86-90、91-95、96-100、101-105、106-110、 111-115、116-120、121-125、126-130、131-135、136-140、141-147。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入瘦素中的一个或一个以 上以下位置中位置 1(即，在 N 末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147(即，在蛋白质的 羧基末端)(SEQ ID NO :2或由SEQ ID NO 1编码的相应氨基酸)。在另一实施例中，一个 或一个以上非天然编码氨基酸并入瘦素中的一个或一个以上以下位置中位置1(即，在N 末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、
101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、 139、140、141、142、143、144、145、146、147、148( S卩，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO :4 或
由SEQ ID NO 3编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置 处进行取代位置 1(即，在 N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35*36(SEQ ID NO :2 或由 SEQ ID NO 1编码的相应氨基酸；或SEQ IDN0 :4或由SEQ ID NO 3编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置 处进行取代位置 1(即，在 N末端)之前、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72 和 73 (SEQ ID NO :2或由SEQ ID NO :1编码的相应氨基酸；或SEQ ID NO :4或由SEQ ID NO :3编码的相 应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置 处进行取代:74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109 和 110(SEQ ID NO 2 或由 SEQ ID NO 1编码的相应氨基酸；或SEQ ID NO :4或由SEQ ID NO 3编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置 处进行取代111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、
127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146和147(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO :2或由SEQ ID NO :1编码的相应氨基 酸)。在其它实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处 进行取代111、112、113、134、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、
128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、 147和148 (即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO :4或由SEQ ID NO: 3编码的相应氨基 酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置 处进行取代45、65、66、99、104、107、110(SEQ ID NO :2 或由 SEQ ID NO :1 编码的相应氨基 酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进 行取代46、66、67、100、105、108、111(SEQ ID NO :4或由 SEQ ID NO :3编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置 处进行取代105、41、117、100、118、40、108、71、95、5、106、112、97、92、109、23、4、119、103、
102、142、69、111、22、93、116、143、67、138、99、3、115、8、141、104、24、120、66、101、70、78、 39、43、39、9、94、12、96、107、74、113、15、85、49、46、145、122、81、110(SEQ ID NO 2 或由 SEQ ID N0:1编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一 个或一个以上以下位置处进行取代:106、42、118、101、119、41、109、72、96、6、107、113、98、 93、110、24、5、120、104、103、143、70、112、23、94、117、144、68、139、100、4、116、9、342、105、 25、121、67、102、71、79、40、44、20、10、95、13、97、108、75、114、16、86、50、47、146、123、82、111 (SEQ ID NO :4或由SEQ ID NO 3编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合 物连接，包括(但不限于)以下位置位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO :2或由SEQ ID NO 1编码的相应氨基酸)。 在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接， 包括(但不限于)以下位置位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、 129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、 148 (即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO :4或由SEQ ID N0 3编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合 物连接45、65、66、99、104、107、110(SEQ ID NO :2 或由 SEQ ID NO 1 编码的相应氨基酸)。 在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接 46、66、67、100、105、108、111(SEQ ID NO :4 或由 SEQ ID NO :3 编码的相应氨基酸)。瘦素拮抗剂包括(但不限于)在以下各处具有取代的拮抗剂120、121或其组合 (SEQID N0:2，或SEQ ID N0:1的相应氨基酸)。瘦素拮抗剂包括(但不限于)在以下各处 具有取代的拮抗剂121、122或其组合(SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO 3的相应氨基酸)。在一些实施例中，瘦素多肽包含调节瘦素多肽对瘦素多肽受体的亲和性的取代、 添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含增加瘦素多肽的稳定性的取代、添加或缺失。 在一些实施例中，瘦素多肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸取代瘦素SEQ ID N0:2 中的 Glul05、Phe41、Serll7、Glul00、Glyll8、Asp40、Aspl08、Arg71、Ser95、Lys5、Thrl06、 Glyll2、Hi97、Phe92、Serl09、Asp23、Gln4、Tyrll9、Glyl03、Serl02、Lul42、Pro69、Glylll、 Asn22、Ser93、Alall6、Serl43、Ser67、Trpl38、Pro99、Ile3、Glull5、Asp8、Aspl41、Leul04、 Ile24、Serl20、Thr66、AlalOl、Ser70、Asn78、Leu39、Pro43、Thrl9、Asp9、Lys94、Thrl2、 Cys96、Leul07、Ile74、Valll3、Lysl5、Asp85、Leu49、His46、Glyl45、Glul22、Glu81、Leull0 或其任何组合。在其它实施例中，瘦素多肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸取代瘦素 SEQ ID NO 4 中的 Glul06、Phe42、Serll8、GlulOl、Glyll9、Asp41、Aspl09、Arg72、Ser96、 Lys6、Thrl07、Glyll3、Hi98、Phe93、SerllO、Asp24、Gln5、Tyrl20、Glyl04、Serl03、Lul43、 Pro70、Glyll2、Asn23、Ser94、Alall7、Serl44、Ser68、Trpl39、Prol00、Ile4、Glull6、Asp9、 Aspl42、Leul05、Ile25、Serl21、Thr67、Alal02、Ser71、Asn79、Leu40、Pro44、Thr20、Aspl0、Lys95、Thrl3、Cys97、Leul08、Ile75、Valll4、Lysl6、Asp86、Leu50、His47、Glyl46、Glul23、 Glu82、Leulll或其任何组合。在一些实施例中，瘦素多肽包含调节瘦素多肽的免疫原性的 取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含调节瘦素多肽的血清半衰期或循环时间 的取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含增加瘦素多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一 些实施例中，瘦素多肽包含增加宿主细胞中产生的瘦素多肽的溶解性的取代、添加或缺失。 在一些实施例中，瘦素多肽包含增加瘦素多肽在宿主细胞中的表达或增加活体外合成的瘦 素多肽的取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含SEQ ID N0:2的120、121或 120与121处的氨基酸取代。在一些实施例中，瘦素多肽包含SEQ ID NO :4的121、122或 121与122处的氨基酸取代。包含这种取代的瘦素多肽保持激动剂活性并且保持或提高宿 主细胞中的表达水平。在一些实施例中，瘦素多肽中的氨基酸可经天然存在或非天然存在氨基酸取代， 条件是存在至少一个非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、胼基、酰胼基、氨基脲基、 叠氮基或炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基 酸具有以下结构
权利要求
一种包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽。
2.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。
3.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述多肽是与连接子、聚合物或生物活性分 子连接。
4.根据权利要求3所述的瘦素多肽，其中所述多肽是与水溶性聚合物连接。
5.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述多肽是与双官能聚合物、双官能连接子 或至少一个其它4HB多肽连接。
6.根据权利要求5所述的瘦素多肽，其中所述双官能连接子或双官能聚合物是与第二 多肽连接。
7.根据权利要求6所述的瘦素多肽，其中所述第二多肽是瘦素多肽。
8.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
9.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物是与所述瘦素多肽中存在 的非天然编码氨基酸连接。
10.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上调节所 述瘦素多肽对瘦素受体的亲和性的氨基酸取代、添加或缺失。
11.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上增加所 述瘦素多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
12.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上增加所 述瘦素多肽在重组宿主细胞中的表达或所述瘦素多肽的活体外合成的氨基酸取代、添加或 缺失。
13.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上增加所 述瘦素多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
14.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸可与不与所述多肽 中20种常见氨基酸中的任一者反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。
15.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、 胼基、酰胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
16.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
17.根据权利要求16所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构(
18.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
19.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰胼基。
20.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含胼基。
21.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
22.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
23.根据权利要求22所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构
24.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
25.根据权利要求24所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构
26.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.lkDa与约 lOOkDa之间的分子量。
27.根据权利要求26所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.lkDa与约 50kDa之间的分子量。
28.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其是通过使包含含羰基的氨基酸的4HB多肽与包 含氨氧基、胼基、酰胼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。
29.根据权利要求28所述的瘦素多肽，其中所述氨氧基、胼基、酰胼基或氨基脲基是通 过酰胺键联与所述水溶性聚合物连接。
30.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含包 括氨氧基、胼基、酰胼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备。
31.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其是通过使包含含炔的氨基酸的瘦素多肽与包 含叠氮部分的水溶性聚合物反应来制备。
32.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其是通过使包含含叠氮基的氨基酸的瘦素多肽 与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。
33.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述叠氮基或炔基是通过酰胺键联与水溶 性聚合物连接。
34.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物是支化或多臂聚合物。
35.根据权利要求34所述的瘦素多肽，其中所述支化聚合物的各支链具有介于约lkDa 与约lOOkDa之间的分子量。
36.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述多肽为4HB拮抗剂。
37.根据权利要求36所述的瘦素多肽，其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修 饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
38.根据权利要求37所述的瘦素多肽，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。
39.根据权利要求36所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸存在于所述4HB多 肽的位点II区内。
40.根据权利要求36所述的瘦素多肽，其中所述多肽阻止4HB受体的二聚。
41.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
42.根据权利要求3所述的瘦素多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过 糖部分与所述多肽连接。
43.一种分离核酸，其包含编码瘦素多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一个 选择密码子。
44.根据权利要求43所述的分离核酸，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭 石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。
45.一种制备根据权利要求3所述的瘦素多肽的方法，所述方法包含使包含非天然编 码氨基酸的分离瘦素多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或 生物活性分子接触。
46.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙 二醇)组成的群组的部分。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰胼 基、胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，并且所 述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、胼、酰胼或氨基脲部分。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述氨氧基、胼、酰胼或氨基脲部分是通过酰胺 键联与所述连接子、聚合物或生物活性分子连接。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸残基包含炔部分，并且 所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
51.根据权利要求46所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，并 且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述叠氮部分或炔部分是通过酰胺键联与连接 子、聚合物或生物活性分子连接。
53.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约0.lkDa与约 lOOkDa之间的平均分子量。
54.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分是支化或多臂聚合物。
55.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的瘦素多肽和医药学上可接受的载剂。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物连接。
57.一种治疗患有由瘦素调节的病症的患者的方法，其包含向所述患者投予治疗有效 量的根据权利要求55所述的组合物。
58.一种细胞，其包含根据权利要求43所述的核酸。
59.根据权利要求58所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
60.一种制备包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的方法，所述方法包含在允许所述包4含非天然编码氨基酸的瘦素多肽表达的条件下培养包含一个或一个以上编码瘦素多肽且 包含选择密码子的多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述瘦素多肽。
61.一种增加瘦素多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或一个 以上非天然编码氨基酸取代所述瘦素多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
62.一种由多核苷酸编码的瘦素多肽，其中所述多核苷酸包含选择密码子，并且其中所 述多肽包含至少一个非天然编码氨基酸。
63.根据权利要求62所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸是与连接子、聚合 物、水溶性聚合物或生物活性分子 连接。
64.根据权利要求63所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
65.根据权利要求64所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、 酰胼基、胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
66.根据权利要求64所述的瘦素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约0.lkDa 与约lOOkDa之间的分子量。
67.根据权利要求64所述的瘦素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分是支化或多臂聚合物。
68.根据权利要求67所述的瘦素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约lkDa与 约lOOkDa之间的分子量。
69.一种组合物，其包含根据权利要求63所述的瘦素多肽和医药学上可接受的载剂。
70.一种瘦素多肽，其包含一个或一个以上增加所述瘦素多肽在重组宿主细胞中的表 达的氨基酸取代、添加或缺失。
71.一种瘦素多肽，其包含通过共价键与所述瘦素多肽在单一氨基酸处连接的水溶性 聚合物。
72.根据权利要求72所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
73.根据权利要求72所述的瘦素多肽，其中所述与所述水溶性聚合物共价连接的氨基 酸是非天然编码氨基酸。
74.根据权利要求10所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸是与聚(乙二醇) 分子连接。
75.一种瘦素多肽，其包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述连接子、 聚合物或生物活性分子是通过经核糖体并入所述瘦素多肽中的非天然编码氨基酸的官能 团与所述瘦素多肽连接。
76.根据权利要求75所述的多肽，其中所述多肽是经单聚乙二醇化。
77.根据权利要求75所述的多肽，其中所述多肽是瘦素多肽。
78.一种多肽，其包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生 物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸是经核糖体并入所述多肽中的预选位点处。
79.根据权利要求78所述的多肽，其中所述多肽是瘦素多肽。
80.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上调节所 述瘦素多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。
81.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上调节所 述瘦素多肽的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。
82. —种调节瘦素多肽的免疫原性的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编 码氨基酸取代所述瘦素多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
全文摘要
本发明提供经修饰人类瘦素多肽和其用途。
文档编号C07H21/04GK101939443SQ200980104660
公开日2011年1月5日 申请日期2009年2月5日 优先权日2008年2月8日
发明者安娜玛莉亚·A··海斯·蒲楠, 尼克·克努森, 希瑟·马拉, 杰森·品克史塔夫, 洛林·沙利文, 瓦迪姆·克赖诺夫 申请人:Ambrx公司