专利名称：治疗慢性疼痛的方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和/或治疗慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的抗CGRP抗体， 且涉及使用抗CGRP抗体治疗和/或预防慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的方法。
背景技术：
慢性疼痛是比根源性损伤或疾病的天然愈合的短暂过程持续更长的持久性疼痛。 其不起有益的或保护性作用，并且在英国估计有270万人因慢性疼痛病况而病废。癌症疼痛是最常见的慢性疼痛类型之一，并且显示伤害性成分(nociceptive component)(由于肿瘤生长)和神经病理性成分(由于肿瘤诱导的神经损伤)。其还牵涉 结构性损伤、神经卡压和损伤、炎性过程，其导致正常组织代谢的中断、炎性前列腺素和细 胞因子的产生和组织损伤。迄今为止，用于治疗慢性疼痛的主要镇痛药是阿片剂和非类固醇抗炎药 (NSAIDS)。两类药都可产生严重的副作用；NSAIDS可引起胃溃疡和肾损伤，阿片剂可引起 恶心、便秘、意识错乱和依赖性问题。阿片样物质(Opioid)(甚至在高剂量上)不能在所有 患慢性疼痛的个体中产生疼痛缓解，并且对阿片样物质的镇痛抗性的产生使它们用于长期 治疗的用途变得复杂。在特定的癌症中，疼痛的治疗需要使用不可接受的高水平的阿片剂 (其带来副作用)并且至少20%的被治疗的患者仍然具有不受控制的疼痛。因此，存在对鉴定干扰慢性疼痛过程的关键步骤和特别地用于治疗和/或预防慢 性伤害性疼痛和/或慢性伤害性疼痛的症状的新型药学活性化合物的急切医学需要。令人惊讶地，我们已发现抗CGRP抗体的施用(通过外周作用部位)在慢性疼痛， 特别地慢性伤害性疼痛例如癌症疼痛的预防和/或治疗中是有效的。CGRP (降钙素基因相关肽)是在中枢神经系统中用作神经递质的37个氨基酸的神 经肽。其以高亲和力结合CGRP受体，降钙素受体样受体(CRLR)，从而激活腺苷酸环化酶和 蛋白激酶A产生。已显示通过中央穿透脊柱施用的小分子选择性CGRP拮抗剂在神经病性和伤害性 疼痛病况的治疗中是有用的(Adwanikar等人，Pain2007)，这表明脊髓中内源性CGRP的去 除具有镇痛效应。此外，已显示抗CGRP抗血清的鞘内施用在关节炎的啮齿类动物模型中减 少伤害性行为(Kuraishi，Y.，等人 Neurosci. Iett (1998) 92，325-329)。令人惊讶地，我们已发现，当外周施用时，抗CGRP抗体的施用，对于外周作用部 位，在慢性疼痛，特别地慢性伤害性疼痛的预防和/或治疗中是有效的。该外周施用途径 提供了优于对鞘内或通过脊柱施用抗体(更高危险和不方便的过程)的需要的显著有利方发明概述本发明提供了抗CGRP拮抗剂抗体用于制造药剂的用途，所述药剂用于预防和/或 治疗慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状，其中药剂经制备用于外周施用。本发明还提供了预防和/或治疗个体中的慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的方 法，该方法包括给所述个体外周施用治疗有效量的抗CGRP拮抗剂抗体。
在一个实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体在施用后在外周起作用。附图概述
图1.在骨癌疼痛模型中，抗体G2对应对8克von Frey刺激的机械性超敏反应的 作用。在手术后第9天用抗体G2或媒介物(PBS+0. 01 % Tween20)处理注射了 MRMT-I的 大鼠。组群在整个手术后期间一直都是健康的，如通过不断增加的手术后体重增长显示的 (数据未显示)。数据是每组7-9只大鼠的平均值士SEM。*p< 0.05，在各时间点上与媒介 物处理的组相比较。图2.在骨癌疼痛模型中，抗体G2对应对15克von Frey刺激的机械性超敏反应 的作用。在手术后第9天用G2或媒介物(PBS+0. 01% Tween20)处理注射了 MRMT-I的大 鼠。数据是每组7-9只大鼠的平均值士SEM。*p< 0.05，在各时间点上与媒介物处理的组 相比较。图3.通过转棒实验(rota rod)测量的抗体G2对步行(ambulation)的作用。探 测2个终点。在骨癌疼痛模型中，跌落潜伏期(latency to fall)作为化合物诱导的运动 协调的损伤的量度(A)，转棒实验评分作为步行诱发的疼痛的量度(B)。在手术后第9天用 抗体G2或媒介物(PBS+0. 01% Tween20)处理注射了 MRMT-I的大鼠。数据是每组7-9只大 鼠的平均值士SEM。*p < 0. 05，在各时间点上与媒介物处理的组相比较。图4 证明抗体Gl抑制α -CGRP与CGRPl受体结合的结合测定数据。图5a 在IV施用10mg/kg后，通过抗IgG ELISA测量的抗CGRP浓度的血清水平 (ug/ml)对时间。图5b 在IV施用10、30、100mg/kg后，通过抗IgG ELISA测量的抗CGRP浓度的血 清水平(ug/ml)对时间。图6使用C末端CGRP片段(CGRP 25-37)进行的丙氨酸扫描。亲和力的变化以亲 和力的损失倍数表示，并且其显示抗CGRP抗体Gl结合人α -CGRP的C末端区域。图7 利用Biacore进行的溶液竞争CGRP，CGRP片段或在序列上与CGRP相关的 肽用于确定抗体Gl的特异性。图8 来自人、食蟹猴、大鼠、小鼠、狗和兔子的CGRP序列。物种之间的非保守残基 以下划线标示，抗体Gl的表位以粗体标示。图9 显示Gl抑制皮肤中的神经源性潮红(neurogenic flare)(始于处理后90分 钟)的数据。通过静脉内施用来施用Gl(lml/kg)。数据来自每组6-8或13只大鼠。*p = 0. 05，= 0. 01，与各时间点上的媒介物(磷酸缓冲盐溶液)处理组相比较(AVOVA)。表1 在25°C下测量的抗人α -CGRP的抗CGRP抗体的Kd和IC50 [muMab7E9 = Gl 的鼠前体。其对于大鼠β-CGRP的Kd= InM。RN4901 =鼠类工具(murine tool)，其识别 与Gl相同的表位但在大鼠中显示相同的亲和力和选择性(β-CGRP Kd = 17ηΜ) ；Gl =从 muMab7E9人源化的抗体(对于大鼠β CGRP的Kd = 0. InM)]。表2 利用Biacore测量的Gl结合亲和力。发明描述一般技术除非另外指出，否则本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物 学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力之内。
7此类技术在文献中得到了详尽的解释，所述文献例如，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,第 2 片反(Sambrook ^ Α 1989)Cold Spring Harbor Pres s ；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed.,1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology :A Laboratory Notebook(J. E. Cellis, ed.,1998)Academic Press ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed. ,1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather 和P. E. Roberts,1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture-Laboratory Procedures (A.Doyle, J. B. Griffiths,和 D. G. Newell, eds. , 1993-1998)J. Wiley 和 Sons ；Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.) ；Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir 和 C. C. Blackwel1,eds.) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller 和 M. P. Calos, eds. ,1987) ;Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等人，eds. , 1987) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等 人’ eds. , 1994) ；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan 等 人’ eds., 1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley 和 Sons,1999) ；Immunobiology (C.A.Janeway 和 P.Travers,1997) ；Antibodies(P. Finch,1997) ；Antibodies :a practical approach(D. Catty. , ed. , IRL Press,1988-1989) ；Monoclonal antibodies a practical approach(P. Shepherd 和 C. Dean，eds. , Oxford University Press,2000)； Using antibodies -.a laboratory manual (E. Harlow 和 D.Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999) ；The Antibodies(M. Zanetti 和 J.D.Capra, eds. , Harwood Academic Publishers, 1995)；以及 Cancer !Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita 等人，eds. , J. B. Lippincott Company, 1993)。定义“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别部位特 异性结合靶例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文中所使 用的，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包括其片段(例如Fab、Fab'、 F(ab' )2、Fv、dAb)、单链抗体(ScFv)、其突变体、嵌合抗体、双价抗体(diabody)、包含抗体 部分的融合蛋白以及包含抗原识别部位的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗体包括 任何类型的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定类型。取决于 其重链的恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分配至不同类型。存在5个主要类型 的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的数个可进一步细分为亚类(同 种型)，例如，IgGl, IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。相应于不同类型的免疫球蛋白的重链 恒定结构域分别称为α、δ、ε、Y和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型 是熟知的。“ Fv"是包含完整抗原识别和结合部位的抗体片段。在双链Fv类别中，该区域 由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链 Fv类别中，一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域可通过柔性的肽连接体共价连接， 以便轻链和重链可以以类似于双链Fv类别中的二聚体结构的二聚体结构结合。正是通过 该构型，各可变结构域的3个CDR相互作用，从而确定VH-VL 二聚体的表面上的抗原结合特 异性。然而，甚至单个可变结构域(或只包含特异于抗原的3个⑶R的Fv的一半)也具有 识别和结合抗原的能力，虽然通常以比完整结合部位更低的亲和力结合。
Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl)。Fab'片段与 Fab片段相异在于重链CHl结构域的羧基末端上少数残基(包括来自抗体铰链区的一个或 多个半胱氨酸)的添加。F(ab)2片段是包含通过铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二 价片段。抗体可具有一个或多个结合部位(以与抗原结合)。如果存在多于一个的结合部 位，则结合部位可以彼此相同或可以不同。例如，天然发生的免疫球蛋白具有两个相同的结 合部位，单链抗体或Fab片段具有一个结合部位，而就序列和/或抗原/表位识别而言，“双 特异性”或“双功能”抗体(双价抗体)具有两个不同的结合部位。“分离的抗体”是(1)不与在其天然状态中与其相伴的天然结合成分(包括其他天 然结合的抗体)结合的抗体，⑵不含来自相同物种的其他蛋白质的抗体，⑶由来自不同 物种的细胞表达的抗体，或(4)非天然发生的抗体。“单克隆抗体”是指均质性抗体群体，其中单克隆抗体由参与抗原的选择性结合的 氨基酸(天然发生的和非天然发生的)组成。单克隆抗体的群体是高度特异性的，其抗单 个抗原部位(antigenic site)。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单 克隆抗体，而且还包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包 含抗体部分的融合蛋白、以及包含结合抗原所需的特异性和能力的抗原识别部位的免疫球 蛋白分子的任何其他修饰构型。关于抗体的来源或其产生的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌 体选择、重组表达、转基因动物等)，不希望受到限制。如本文中所使用的，“人源化的"抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，其为包含 来源于非人免疫球蛋白的最小序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如 Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其他抗原结合子序列)。在极大程度上，人源化的抗体 是其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供者抗体)例如小鼠、大鼠 或兔子的具有期望的特异性、亲和力和生物学活性的CDR的残基置换的人免疫球蛋白(受 者抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此 外，人源化的抗体可包含在受者抗体和引入的CDR或构架序列中都未发现但被包括以进一 步改进和最优化抗体性能的残基。一般地，人源化的抗体将包含基本上所有的至少一个，通 常二个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区相应于非人免疫球蛋白的CDR区并且 所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳地还将包括 免疫球蛋白恒定区或结构域(Fe)(通常人免疫球蛋白的恒定区或结构域)的至少一部分。 抗体可具有如W099/58572中所描述的修饰的Fc区域。人源化抗体的其他形式具有相对于 原始抗体进行了改变的一个或多个⑶R(l、2、3、4、5、6个)，其也称为“衍生自，，原始抗体的 一个或多个⑶R的一个或多个⑶R。如本文中所使用的，“人抗体”是指具有相应于由人产生的抗体的氨基酸序列的 氨基酸序列的抗体，和/或已使用本领域内已知的或本文中公开的用于制备人抗体的任 何技术进行制备。人抗体的该定义包括包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽 的抗体。一个这样的实例是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可使用本领域内已 知的各种技术来产生。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表 达人抗体(Vaughan 等人，1996，Nature Biotechnology, 14 :309_314 ；Sheets 等人，1998， PNAS, (USA)95 :6157_6162 ；Hoogenboom 和 Winter，1991，J. Mol. Biol.，227 381 ；Marks 等人，1991，J. Mol. Biol.，222 :581)。还可通过将人免疫球蛋白基因座导入其中内源免疫球 蛋白基因已部分或完全被灭活的转基因动物例如小鼠来制备人抗体。该方法描述于美国专 利 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 和 5，661，016 中。备选地， 还可通过永生化产生抗靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(此类B淋巴细胞可从个体回收或 可已在体外进行了免疫)来制备人抗体。参见，例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ；Boerner 等人，1991, J. Immunol. , 147 (1) 86-95 ；和美国专利 5，750，373。单链抗体(scFc)是其中VL和VH区域经由使它们能够制备为单个蛋白质链的合 成的连接体配对形成单价分子的抗体(Bird等人Science，242 =423-426(1988)和Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :5879_5883 (1988))。双价抗体是其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上且使用连接体的二价、双特 异性抗体，所述连接体太短以至于不允许相同链上的2个结构域之间形成配对，从而迫使 结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位。“嵌合抗体"是指其中重链和轻链的各氨基酸序列的一部分与来源于特定物种 或属于特定类型的抗体中的相应序列同源，然而链的其余区段与另一种抗体中的相应序列 同源的抗体。一般地，在此类嵌合抗体中，轻链和重链的可变区模拟来源于一个哺乳动物物 种的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一个物种的抗体中的序列同源。此类嵌合形式 的一个明显的有利方面是例如，可变区可通过使用可容易获得的杂交瘤或B细胞(其来自 非人宿主生物)容易地从目前已知的来源产生，并且恒定区来源于例如人细胞制备物。在 可变区具有易于制备的有利方面并且特异性不受其来源影响的同时，来源于人的恒定区， 与来自非人来源的恒定区相比，当注射抗体时较不可能引起人受试者的免疫应答。然而，该 定义不限于该具体的实例。“功能性Fc区域”具有天然序列Fc区域的至少一个效应子功能。示例性“效应子 功能”包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性(ADCC)；吞噬作用(phagocytosis)；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调 等。此类效应子功能通常需要Fc区域与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可 使用本领域内已知的用于评估此类抗体效应子功能的各种测定来进行评估。“天然序列Fc区域”包括与天然发现的Fc区域的氨基酸序列同一的氨基酸序列。 “变异Fc区域”包括与天然序列Fc区域的氨基酸序列相异在于至少一个氨基酸修饰，但仍 然保持天然序列Fc区域的至少一个效应子功能的氨基酸序列。优选，变异Fc区域，与天然 序列Fc区域或与亲本多肽的Fc区域相比较，在天然序列Fc区域或在亲本多肽的Fc区域 中具有至少一个氨基酸置换，例如大约1至大约10个氨基酸置换，优选大约1至大约5个 氨基酸置换。在本文中，变异Fc区域优选与天然序列Fc区域和/或与亲本多肽的Fc区域 具有至少大约80%的序列同一性，更优选与其具有至少大约90%的序列同一性，更优选与 其具有至少大约95%的序列同一性。如本文中所使用的，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的 反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性 粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解。目的分子的ADCC活 性可使用体外ADCC测定例如美国专利5，500, 362或5，821，337中描述的测定来评估。可
10用于此类测定的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。备选地或另外地，目 的分子的ADCC活性可以例如在动物模型例如Clynes等人，1998，PNAS (USA), 95 :652_656 中公开的动物模型中进行体内评估。如本文中所使用的，“Fc受体"和“FcR”描述结合抗体的Fc区域的受体。优选的 FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR (γ受体)，其包括Fc γ RI、 Fc γ RII和Fc γ RIII亚类的受体，包括此类受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcyRII 受体包括Fc γ RIIA (〃激活性受体〃)和FcyRIIB("抑制性受体")，其具有相似的氨基 酸序列(主要不同在于其细胞质结构域)。FcR综述于Ravet ch和Kinet，1991，Ann. Rev. Immunol.，9 457-92 ；Capel 等人，1994，Immunomethods，4 25-34 ；禾口 de Haas 等人，1995， J. Lab. Clin. Med. , 126 :330_41。“FcR，，还包括新生儿受体FcRn，其负责母源IgG至胎儿的 转移(Guyer 等人，1976，J. Immunol.，117 587 ；和 Kim 等人，1994，J. Immunol. ,24 :249)。“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在补体存在的情况下靶的裂解。补体活化途 径通过补体系统的第一组分(Clq)与和相关抗原复合的分子(例如抗体)的结合来起始。 为了评估补体活化，可进行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods, 202 =163(1996)中描述的测定。如本文中所使用的，术语“G1”和“抗体G1”可互换使用，其是指由具有保藏号 ATCC-PTA-6867和ATCC-PTA-6866的表达载体产生的抗体。重链和轻链可变区的氨基酸序 列示于SEQ ID No. 1和2中。抗体Gl的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)以图表的 形式描述于W02007/054809 (其内容以其全文通过弓丨用合并入本文)的图5中。编码重链和 轻链可变区的多核苷酸示于SEQ ID No. 9和10中。抗体Gl的特征描述于W02007/054809 的实施例中，其全部内容通过引用合并入本文。Gl是人源化单克隆阻断性抗体(blocking antibody) (IgG2)，其阻断神经肽CGRP(a和b)的结合和活性以及由CGRP释放引起的其神 经源性血管舒张作用。Gl是来源于鼠抗CGRP拮抗剂抗体前体(称为muMAb7E9，如在使用 从用人和大鼠CGRP免疫的小鼠制备的、与鼠浆细胞瘤细胞融合的脾细胞的筛选中鉴定的) 的IgG2Aa单克隆抗CGRP拮抗剂抗体。通过将muMAb 7E9来源的轻链和重链的⑶R移植入 最接近的人种系序列，然后将至少1个突变导入各⑶R和将2个构架突变导入Vh中来产生 Gl。将两个突变导入Gl的Fc结构域以抑制人Fc受体激活。已显示Gl和muMab7E9识别 相同表位。如本文中所使用的，术语“G2”和“抗体G2”可互换使用，其是指抗大鼠CGRP小鼠 单克隆抗体，如Wong HC等人Hybridoma 12:93-106(1993)中所描述的。重链和轻链可变 区的氨基酸序列示于SEQ ID No. 19和20。编码重链和轻链可变区的多核苷酸示于SEQ ID No. 27和28。在SEQ ID No. 21至26中提供了抗体G2的CDR部分。已显示G2与Gl识别 相同的表位。如本文中所使用的，抗体的"免疫特异性"结合是指在抗体的抗原结合部位与该 抗体识别的特定抗原之间发生的抗原特异性结合相互作用(即，抗体在ELISA或其他免疫 测定中与蛋白质反应，并且不与不相关的蛋白质发生可检测的反应)。“特异性结合”或“优先结合”(在本文中可互换使用)抗体或多肽的表位是本领域 内熟知的术语，并且测定此类特异性或优先结合的方法在本领域内也是熟知的。如果分子 更频繁、更快、以更长的持续时间和/或更大的亲和力与特定的细胞或物质反应或结合(与其和另外的细胞或物质的反应或结合相比)，则该分子被认为展示“特异性结合”或“优先结 合”。如果抗体以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合靶(与其 和其他物质的结合相比)，则所述抗体“特异性结合”或“优先结合”靶。通过阅读该定义， 还应理解例如，特异性或优先结合第一靶的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或 优先结合第二靶。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(虽然其可包括)专一结 合。通常，但非必须地，结合是指优先结合。术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质，，在本文中可互换使用，其是指任何长度的 氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分枝的，其可包含修饰的氨基酸，并且其可被非氨基 酸中断。该术语还包括已被天然修饰或通过干预(intervention)修饰的氨基酸聚合物；例 如，二硫键的形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记成 分的缀合。还包括在该定义中的是例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然 氨基酸等)以及本领域内已知的其他修饰的多肽。应理解，因为本发明的多肽基于抗体，因 此多肽可以以单链或结合的链的形式存在。“多核苷酸”或“核酸”，如在本文中可互换使用的，是指任何长度的核苷酸聚合物， 且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/ 或它们的类似物，或可由DNA或RNA聚合酶整合入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含 修饰的核苷酸例如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在，可在聚合物组装之前或之 后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸成分中断。在聚合后，多核苷酸还 可被进一步修饰，例如通过与标记成分缀合来修饰。修饰的其他类型包括例如“加帽”，用类 似物置换一个或多个天然发生的核苷酸，核苷酸间修饰例如使用不带电荷的连接(例如， 甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)的修饰和使用带电 荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂部分例如蛋白质(例如， 核酸酶，毒素，抗体，信号肽，多聚L赖氨酸等)的修饰，使用插入剂(例如，吖啶、补骨脂素 等)的修饰，包含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰，含有烷化剂 (alkylator)的修饰，具有修饰的连接(例如，α端基异构(anomeric)核酸等)的修饰，以 及多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以例如被膦酸基团、磷酸基 团置换，由标准保护基团保护，或被活化以产生与另外的核苷酸的另外的连接，或可被缀合 至固体支持物。5’和3’末端OH可被磷酸化或可用1至20个碳原子的有机加帽基团部分 或胺置换。其他羟基还可被衍生至标准保护基团。多核苷酸还可包含本领域内公知的核糖 或脱氧核糖的类似物形式，包括例如2' -0-甲基_、2' -0-烯丙基、2'-氟-或2'-叠 氮基-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构(epimeric)糖例如阿拉伯糖、木糖 或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物例如甲基核苷。一 个或多个磷酸二酯连接可被备选连接基团置换。此类备选连接基团包括但不限于，其中磷 酸酯被 P(0)S( “硫代(thioate)”)、P(S)S( “二硫代”)、“ (0)NR2( “酰胺化”)、P(0)R、P(0) OR'、⑶或CH2( “formacetal”)置换的实施方案，其中各R或R'独立地是H或经取代或 未经取代的烷基(1-20个C)(任选地包含醚(-0-)连接)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或 araldyL·多核苷酸中并非所有连接必须是相同的。上述描述适用于本文中提及的所有多 核苷酸，包括RNA和DNA。抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。重链和轻链的可变区各自由通过3个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的4个构架区(FR) 组成。各链中的⑶R通过FR紧密地结合在一起并且，与来自另一条链的⑶R —起，促成了 抗体的抗原结合部位的形成。存在至少两个用于确定CDR的技术(1)基于跨物种序列变 异性的方法(艮口，Kabat 等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第 5 版，1991 ,National Institutes of Health,Bethesda MD))；禾口 (2)基于抗原-抗体复合 物的晶体学研究的方法(Chothia 等人(1989)Nature 342 877 ；Al-Iazikani 等人(1997) J. Molec. Biol. 273 :927-948))。如本文中所使用的，CDR可以指通过任一方法或通过两种 方法的组合确定的⑶R。抗体的“恒定区”是指单独的或组合的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区。如本文中所使用的，“抗CGRP拮抗剂抗体”(可互换地称为“抗CGRP抗体”)是指 能够结合CGRP并且抑制CGRP生物学活性和/或下游途径的抗体。抗CGRP拮抗剂抗体包 括阻断、拮抗、抑制或减少(包括显著地)CGRP生物学活性的抗体。为了本发明的目的，应 明确地理解，术语“抗CGRP拮抗剂抗体”包括所有之前鉴定的术语、名称以及功能状态和特 征，由此CGRP本身，CGRP生物学活性或生物学活性的结果在任何有意义的程度上基本上被 消除、减少或中和。本文中提供了抗CGRP拮抗剂抗体的实例。如本文中所使用的，“大体上纯的”是指这样的材料，其为至少50%纯的(即，不含 污染物)，更优选至少90 %纯的，更优选至少95 %纯的，更优选至少98 %纯的，更优选至少 99%纯的。“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于多核苷酸插入物 的整合的载体的受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然、意外或故意突变 的原因，后代可以不必与原始亲本细胞完全相同(在形态学上或在基因组DNA互补物上)。 宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。如本文中所使用的，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。为了本发 明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于下列中的一个或多个慢性疼痛和/或慢 性疼痛的症状的任何方面的改善或减轻。为了本发明的目的，有益或期望的临床结果包括 但不限于下列中的一个或多个包括疼痛和/或与慢性疼痛相关的症状的缓解、减轻的严重度。药物、化合物或药物组合物的“有效量”是足以产生有益或期望的结果包括临床结 果例如痛觉的减轻或减少的量。可以以一次或多次施用来施用有效量。为了本发明的目的， 药物、化合物或药物组合物的有效量是足以治疗、改善、减少慢性疼痛或与慢性疼痛相关的 症状的强度和/或预防慢性疼痛或与慢性疼痛相关的症状的量。如在临床背景中所理解 的，可以结合或可以不结合另一种药物、化合物或药物组合物来获得药物、化合物或药物组 合物的有效量。因此，可在施用一种或多种治疗剂的背景中考虑“有效量”，并且如果与一种 或多种其他试剂结合，获得或可获得期望的结果，则单个试剂可被认为是以有效量提供。在一个实施方案中，“经制备用于”在本文中是指药剂以剂量单位等形式存在，其 经合适地包装和/或标记用于外周施用。慢性疼痛和/或与慢性疼痛相关的症状的“日益减少的发病率”是指任何不断减 轻的严重度(其可包括不断减少的对通常用于此类病症的其他药物和/或治疗的需要和/ 或不断减少的(暴露至)所述药物和/或治疗的量)、持续时间和/或频率。
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“改善”慢性疼痛和/或与慢性疼痛相关的症状是指当与不施用抗CGRP拮抗剂抗 体相比较时，一种或多种慢性疼痛的症状和/或与慢性疼痛相关的症状的减轻或好转。“改 善”还包括症状持续时间的缩短或减少。“缓和”慢性疼痛和/或与慢性疼痛相关的症状是指用根据本发明的抗CGRP拮 抗剂抗体治疗的个体或个体的群体中，慢性疼痛的一个或多个不期望的临床表现的程度减轻。如本文中所使用的，“延迟”慢性疼痛的发展意指推迟、阻止、减缓、迟滞、稳定和/ 或延缓慢性疼痛和/或与慢性疼痛相关的症状的进展。取决于疾病的历史和/或待治疗的 个体，该延迟可以是不同的时间长度。如对于本领域技术人员是很明显的，充分或显著的延 迟事实上可包括预防，因为个体不发展慢性疼痛。“延迟”症状的发展的方法是这样的方法， 当与不使用该方法相比较时，其在给定的时帧内减少发展症状的可能性和/或在给定的时 帧内减少症状的程度。此类比较通常基于临床研究(使用统计学上显著的受试者数量)。“生物学样品”包括从个体获得的各种样品类型，并且可用于诊断或监控测定。该 定义包括生物来源的血液和其他液体样品、固体组织样品例如活检样本或组织培养物或来 源于其的细胞以及其后代。该定义还包括在它们获得后以任何方式进行了操作(例如通过 用试剂处理、增溶或就某些成分例如蛋白质或多核苷酸进行富集，或为了切片而包埋在半 固体或固体基质中)的样品。术语“生物学样品”包括临床样品，并且还包括培养中的细胞、 细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物学液体和组织样品。“个体”或“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限 于，家畜(例如牛)、运动动物(sport animal)、宠物(例如猫、狗和马)、灵长类动物、小鼠 和大鼠。如本文中所使用的，“载体"是指能够递送并且优选在宿主细胞中表达一个或多 个目的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或RNA表达 载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂(condensing agent)结合的DNA或RNA表 达载体、封装在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞例如生产者细胞(producer cell)ο如本文中所使用的，“表达控制序列"是指指导核酸的转录的核酸序列。表达控 制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列有效地连接至 待转录的核酸序列。如本文中所使用的，“药学上可接受的载体"包括当与活性成分组合时允许所述 成分保持生物学活性，并且不与受试者的免疫系统反应的任何材料。实例包括但不限于，任 何标准药物载体例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂和各种类型的湿润剂。用于 气雾剂或胃肠外施用的优选稀释剂是磷酸缓冲盐溶液或生理盐水(0. 9% )。通过熟知的常 规方法(参见，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 18 版,A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co. , Easton, PA,1990 ；禾口 Remington, The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing, 2000)配制包含此类载体的组合物。如本文中所使用的，术语“外周施用的”是指籍以递送物质、药剂和/或抗CGRP 拮抗剂抗体的途径，特别地其是指不通过中枢、不通过脊柱、非鞘内、非直接地递送入 CNS0该术语是指除了刚才描述的施用途径外的施用途径，其包括口服、舌下、口腔、局部(topical)、经直肠、通过吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、肌内、心脏内、骨内、真皮内、腹 膜内、经粘膜、经阴道、玻璃体内、关节内、关节周、局域(local)或经表皮(印icutaneous) 的途径。术语“在外周起作用”，如本文中所使用的，是指物质、化合物、药剂和/或抗CGRP 拮抗剂抗体的作用部位，相对于中枢神经系统，所述部位在周围神经系统内，当外周施用 时，所述化合物、药剂和/或抗CGRP拮抗剂抗体受到不能穿过屏障到达CNS和脑的限制。术 语“中央渗透(centrally penetrat ing) ”是指物质能够穿过屏障到达脑或CNS。术语"K。ff"，如本文中所使用的，意指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率 常数。术语〃 Kd"，如本文中所使用的，意指抗体-抗原相互作用的解离常数。本发明涉及用于预防和/或治疗个体中慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的药剂以 及用于预防和/或治疗个体中慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的方法。在第一方面，本发明提供了抗CGRP拮抗剂抗体用于制造药剂的用途，所述药剂用 于预防和/或治疗慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状，其中药剂经制备用于外周施用或其中 外周施用药剂。在第二方面，本发明提供了用于预防和/或治疗慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状 的抗CGRP拮抗剂抗体，其中抗体经制备用于外周施用或其中外周施用抗体。在第三方面，本发明提供了抗CGRP拮抗剂抗体用于制造药剂的用途，所述药剂用 于改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状、减少慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的发病 率或延迟慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的发展或进展，其中药剂经制备用于外周施用或 其中外周施用药剂。在该方面的可选方案中，本发明提供了抗CGRP拮抗剂抗体，所述抗体 用于改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状、减少其发病率或延迟其发展或进展，其中 抗体经制备用于外周施用或其中外周施用抗体。在第四方面，本发明提供了预防和/或治疗个体中慢性疼痛和/或慢性疼痛的症 状的方法，该方法包括给个体外周施用有效量的抗CGRP拮抗剂抗体。在第五方面，本发明提供了在个体中改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状、 减少其发病率或延迟其发展或进展的方法，该方法包括给个体外周施用有效量的抗CGRP 拮抗剂抗体。根据本发明的优选实施方案，个体优选是哺乳动物，例如伴侣动物例如马、猫或狗 或家畜例如绵羊、牛或猪。最优选，哺乳动物是人。根据本发明的优选实施方案，药剂和/或抗CGRP拮抗剂抗体经制备用于口服、舌 下、口腔、局部、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、肌内、心脏内、骨内、真皮内、腹膜 内、经粘膜、经阴道、玻璃体内、关节内、关节周、局域或经表皮施用。根据其他优选实施方案，药剂经制备用于在慢性疼痛发展之前和/或期间和/或 之后外周施用。在一个实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体在施用后在外周起作用。在一个实施方案 中，不通过中枢、脊柱或鞘内途径来施用抗CGRP拮抗剂抗体。根据本发明的优选实施方案，慢性疼痛包括慢性伤害性疼痛、慢性神经性疼痛、慢 性炎性疼痛、纤维肌痛、爆发性疼痛(breakthrough pain)和持续性疼痛中的一种或多种。慢性疼痛可包括痛觉过敏、异常性疼痛、中枢致敏、外周致敏、抑制解除(disinhibition) 和增强的易化(facilitation)的一种或多种。根据本发明的另外的优选实施方案，慢性疼痛是癌症疼痛，优选癌症疼痛起因于 恶性肿瘤或起因于优选选自下列中的一种或多种的癌症腺组织中的腺癌、器官的胚性组 织中的母细胞瘤、上皮组织中的癌、形成血细胞的组织中的白血病、淋巴组织中的淋巴瘤、 骨髓中的骨髓瘤、结缔或支持性组织中的肉瘤、肾上腺癌、AIDS相关淋巴瘤、贫血、膀胱癌、 骨癌、脑癌、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、化学疗法(chemotherapy)、结肠癌、血细胞减少、子宫 内膜癌、食管癌、胃癌、头部癌症、颈癌、肝胆管癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、何杰金 氏病、淋巴瘤、非何杰金氏病、神经系统肿瘤、口癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤 癌、胃癌症、睾丸癌症、甲状腺癌、尿道癌、骨癌、结缔组织的肉瘤癌、骨组织的癌症、造血细 胞的癌症、骨髓癌、多发性骨髓瘤、白血病、原发性或继发性骨癌、转移至骨的肿瘤、浸润神 经和空腔脏器的肿瘤、邻近神经结构的肿瘤。更优选，癌症疼痛包括内脏疼痛，优选起因于 胰腺癌和/或腹部中的转移灶的内脏疼痛。更优选地，癌症疼痛包括躯体疼痛，优选由骨 癌、骨中的转移灶、术后疼痛、结缔组织的肉瘤癌、骨组织的癌症、骨髓的造血细胞的癌症、 多发性骨髓瘤、白血病、原发性或继发性骨癌的一种或多种癌症引起的躯体疼痛。根据本发明的优选实施方案，抗CGRP拮抗剂抗体结合CGRP，更优选地结合CGRP并 且抑制CGRP结合CGRP受体的能力。优选抗CGRP拮抗剂抗体结合人和啮齿类动物的CGRP， 优选人和大鼠的CGRP。更优选抗体结合人CGRP，更优选抗CGRP拮抗剂抗体结合人α-CGRP 或结合人α-CGRP和/或β-CGRP。最优选抗CGRP拮抗剂抗体是展示任何一种或多种下列 功能特征的抗体(a)结合CGRP ； (b)阻止CGRP结合其受体；(c)阻断或减少CGRP受体的激 活，包括cAMP激活；(d)抑制、阻断、压制或减少CGRP的生物学活性，包括由CGRP信号转导 介导的下游途径，例如受体结合和/或细胞对CGRP的应答的诱发；(e)预防、改善或治疗慢 性疼痛的任何方面；(f)增加CGRP的清除；和(g)抑制(减少)CGRP的合成、产生或释放。已知本发明的抗体(包括Gl和G2)结合CGRP并且消除其生物利用度，例如在血 清中的生物利用度，从而阻止CGRP接触其受体以及CGRP的下游细胞应答和生物学效应例 如潮红和血管舒张。在本发明的另外的优选实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体结合CGRP的片段，更优选 结合CGRP的片段以及结合全长CGRP。优选，抗CGRP拮抗剂抗体结合CRGP的C末端区域 或片段。CRGP的C末端区域或片段优选包括CGRP的氨基酸19-37或25-37或29-37或备 选地30-37，另外备选地31-37。在另外的实施方案中，CRGP的C末端区域或片段优选包含 CGRP的氨基酸32-37，最优选33至37。优选CGRP是α -CGRP或β -CGRP,更优选人或啮齿 类动物，更优选人或大鼠，更优选人，更优选人α "CGRP或β -CGRP，最优选人α -CGRP。在本发明的另外的优选实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体特异性结合氨基酸序列 GSKAF。优选，CGRP的序列GSKAF是抗CGRP拮抗剂抗体结合的表位，其优选在位点33至37 上，最优选，所述序列是GXXXF (其中X可以是任何氨基酸)，其优选在CGRP的位点33至37 上，其末端由CGRP的氨基酸G 33和F 37确定。在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合由CGRP的氨基酸G33至F37确定的 表位的抗CGRP拮抗剂抗体。抗CGRP拮抗剂抗体可特异性结合由氨基酸序列GSKAF确定的 表位。在一个实施方案中，本发明提供了这样的抗体在本发明的各个方面中定义的应用和
16方法中的用途。在一个实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体抑制或防止CGRP受体的激活。优选抗CGRP 抗体具有0.0001(0. InM)至500 μ M的IC5tl。在一些优选实施方案中，IC5tl是0. 0001 μ M至 250 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、10 μ Μ、1 μΜ、500ηΜ、250ηΜ、100ηΜ、50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、InM 或 0. 5ηΜ 中的任一个，或为大约 250μΜ、100μΜ、50μΜ、10μΜ、1μΜ、500ηΜ、250ηΜ、100ηΜ、 50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、InM或0. 5ηΜ中的任一个，如在体外结合测定中测量的。在一些 另外的优选实施方案中，IC5tl小于500ρΜ或IOOpM或50ρΜ的任一个，如在体外结合测定中 测量的。在另外的更优选的实施方案中，IC5tl是1.2ηΜ或31ηΜ。在另外的优选实施方案中，使用的抗CGRP拮抗剂抗体能够与本文中上述抗体竞 争对CGRP或对CGRP的片段的结合，或对CGRP的片段以及全长CGRP的结合，优选对CRGP 的C末端区域或片段的结合，优选CRGP的C末端区域或片段包含CGRP的氨基酸19-37或 25-37或29-37或备选地30-37，另外备选地31-37。在另外的实施方案中，CRGP的C末端 区域或片段优选包含CGRP的氨基酸32-37，最优选33至37。在另外的优选实施方案中，如本发明中使用的抗CGRP拮抗剂抗体或其抗原结合 部分能够与本文中上述抗CGRP拮抗剂抗体，特别地如本文中描述的Gl或G2 (a)竞争对CGRP或CGRP的片段的结合，或对CGRP的片段以及全长CGRP的结合， 优选对CRGP的C末端区域或片段的结合，优选CRGP的C末端区域或片段包含CGRP的氨基 酸19-37或25-37或29-37或备选地30-37，另外地备选地31-37，优选氨基酸32-37，最优 选33至37，优选CGRP是α或β CGRP,优选β CGRP,更优选啮齿类动物或人CGRP，最优选 人 CGRP，(b)竞争对表位序列GSKAF(其优选在(a)中定义的CGRP的氨基酸位点33至37 上)的结合，更优选对序列GXXXF的结合，其中X是任何氨基酸，优选GXXXF在(a)中定义 的CGRP的氨基酸位点33至37上，(c)以大体上相同的Kd和/或大体上相同的K。ff竞争如(a)或(b)中描述的结 合，和/或(d)竞争对CGRP的结合和抑制/拮抗CGRP生物学活性和/或下游途径，优选CGRP 是α或i3CGRP，优选日061^，更优选啮齿类动物或人061^，最优选人061^。抗CGRP 拮抗剂抗体优选以 0. 000001 μ M (0. 00 InM)或 0. 00001 μ M (0. 0 InM)至 500 μ M的结合亲和力(Kd)结合CGRP、CGRP的区域或CGRP的片段。在一些优选实施方 案中，结合亲和力(Kd)在 0.000001 μΜ 或 0.00001 μΜ 与 250 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、10 μ Μ、 1 μ Μ、500ηΜ、250ηΜ、100ηΜ、50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、1ηΜ、0. 5ηΜ、1ηΜ、0. 05ηΜ 或 0. OlnM, 0. 005ηΜ、0. OOlnM 中的任一个之间，或为大约 250 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、10 μ Μ、1 μ Μ、500ηΜ、 250ηΜ、100ηΜ、50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、1ηΜ、0· 5ηΜ、1ηΜ、0· 05ηΜ 或 0· OlnM,0. 005ηΜ、 0. OOlnM中的任一个，如在体外结合测定中测量的。在一些另外的优选实施方案中，结合亲 和力(Kd)小于500ρΜ或ΙΟΟρΜ，50pM或10pM，5pM，IpM的任一个，如在体外结合测定中测量 的。在另外的更优选的实施方案中，结合亲和力(Kd)是0.04nM或16nM。本发明中使用的抗CGRP拮抗剂抗体可选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段 (例如，Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv, Fe、ScFv等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体 (heteroconjugate antibody)、单链(ScFv)抗体、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白(例如，结构域抗体)、人源化抗体以及包含所需特异性的抗原识别部位的免疫球蛋白分子的任 何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗 CGRP拮抗剂抗体可以是鼠、大鼠、人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实 施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体可以是人源化的，但更优选是人抗体。优选，抗CGRP拮抗剂 抗体是分离的抗体，更优选其是大体上纯的抗体。当抗CGRP拮抗剂抗体是抗体片段时，片 段优选保留原始抗体的功能特征，即如在上述功能特征中描述的CGRP结合和/或拮抗剂活 性。 抗CGRP拮抗剂抗体的实例在本领域内是已知的。因此根据本发明的优选实 施方案，本发明中使用的抗CGRP拮抗剂抗体优选是这样的抗CGRP抗体，其是如⑴ W02007/054809, (ii) W02007/076336，(iii) Tan 等人，Clin. Sci. (Lond) · 89 :565_73，1995， (iv) Sigma (Missouri, US)，产品编号 C7113 (克隆 #4901)，(v) Plourde 等人，PeptidesH 1225-1229，1993的任一项中一般或特别地公开的抗CGRP抗体，或其包含下列或由下列组
成
(a)所述抗体的片段(例如，Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、Fc、ScFv 等)，
(b)所述抗体的轻链，
(C)所述抗体的重链，
(d)来自所述抗体的轻链和/或重链的--个或多个可变区，
(e)所述抗体的一个或多个⑶R(l、2、3、」4、5 或 6 个 CDR)，
(f)来自所述抗体的重链的⑶R H3，
(g)来自所述抗体的轻链的⑶R L3,
(h)来自所述抗体的轻链的3个CDR，
⑴来自所述抗体的重链的3个⑶R，
(J)来自所述抗体的轻链的3个CDR和来自所述抗体的重链的3个CDR，
(k)(a)至(j)的任一项或多项。
根据本发明的优选实施方案，抗CGRP拮抗剂抗体是抗体G2或抗体Gl。；
明的最优选实施方案，使用的抗CGRP拮抗剂抗体是在专利申请W02007/054809中特别地公 开的抗CGRP抗体G1，或包括W02007/054809的表6中显示的其变体，还包括Gl的功能等价 抗体，即包含不显著影响它们的功能特征(例如CRGP结合或拮抗剂活性)的氨基酸残基的 保守置换或一个或多个氨基酸的缺失或添加，以及具有增强或减少的活性和/或结合的变 体。如本文中所使用的，术语“G1”和“抗体G1”可互换使用，其是指由申请W02007/054809 中公开的具有保藏号ATCC PTA-6867和ATCC PTA-6866的表达载体产生的抗体。
根据本发明的另外的实施方案，抗CGRP拮抗剂抗体包含选自下列的多肽或 由选自下列的多肽组成(a) W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体；(b) W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体的片段或区域；(c)W02007/054809的 表6中显示的抗体Gl或其变体的轻链；(d)W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其 变体的重链；(e)来自W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体的轻链和/或重 链的一个或多个可变区；(f)W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体的一个或 多个CDR(1、2、3、4、5或6个CDR) ； (g)来自W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其 变体的重链的CDR H3 ； (h)来自W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体的轻链
18的⑶R L3 ； (i)来自W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体的轻链的3个⑶R ； (j)来自W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体的重链的3个⑶R ； (k)来自 W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体的轻链的3个⑶R和/或重链的3个⑶R ； 和(i)包含(b)至(k)的任一项的抗体。本发明还提供了包含上述的任一项或多项的多 肽。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5或6个⑶R与W02007/054809的表6中显示的Gl 或其变体的至少 1、2、3、4、5 或 6 个 CDR 至少大约 85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、 96%、97%、98%或 99% 同一。CDR区域的确定完全在本领域技术人员的能力之内。应理解，在一些实施方案中， ⑶R可以是Kabat和Chothia⑶R的组合。在一些实施方案中，⑶R是Kabat⑶R。在其他 实施方案中，CDR是Chothia CDR。抗CGRP拮抗剂抗体优选包含W02007/054809的表6中显示的抗体Gl或其变体的 片段或区域(例如，Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、Fe、ScFv等)或由所述片段或区域组成。优 选所述片段或区域具有抗CGRP拮抗剂抗体的功能特征例如CGRP结合活性和/或拮抗剂活 性，并且包含一个或多个轻链、重链、片段(所述片段包含来自轻链和/或重链的一个或多 个可变区，或来自抗体Gl的轻链和/或重链的一个或多个CDR)或由其组成。根据本发明的另外的优选实施方案，抗CGRP拮抗剂抗体包含轻链可变区LCVR和/ 或重链可变区HCVR，所述轻链可变区包含具有选自专利申请W02007/076336的SEQ ID No: 28-32的序列的肽，所述重链可变区包含具有选自专利申请W02007/076336的SEQ ID No 34-38的序列的肽。更优选地，抗CGRP拮抗剂抗体包含专利申请W02007/076336的表1中显示的SEQ ID NO的LCVR多肽并且还包含专利申请W02007/076336的表1中显示的SEQ ID NO的HCVR多肽。根据本发明的另外的实施方案，所使用的抗CGRP拮抗剂抗体包含选自专利申请 W02007/076336 的 SEQ ID No :8_13 的轻链 CDR (CDRL)和 / 或选自专利申请 W02007/076336 的 SEQ ID No 14-22 的重链 CDR(CDRH)。制备和分离申请W02007/076336的抗CGRP拮抗剂抗体的方法以及证明所述抗体 的CGRP结合和拮抗剂特征的数据描述于申请W02007/076336中。优选，用于本发明的抗CGRP拮抗剂抗体包含VH结构域，所述VH结构域与本文中 所示的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :19在氨基酸序列上至少85%、至少86%、至少87%、至 少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一。优选，抗CGRP拮抗剂抗体包含VL结构域，所述VL结构域与本文中所示的SEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 20在氨基酸序列上至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少 89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100%同一。抗CGRP拮抗剂抗体优选包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域和VL结构域 在氨基酸序列上分别与本文中所示的SEQ ID NO :1和2或分别与本文中所示的SEQ ID NO: 19和20至少85 %、至少86 %、至少87 %、至少88 %、至少89 %、至少90 %、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一。优选，抗CGRP拮抗剂抗体包含在氨基酸序列上与本文中所示的SEQID NO 1至少 90%同一的VH结构域和在氨基酸序列上与本文中所示的SEQ ID NO :2至少90%同一的VL 结构域。备选地，抗CGRP拮抗剂抗体优选包含在氨基酸序列上与本文中所示的SEQ ID NO 19至少90%同一的VH结构域和在氨基酸序列上与本文中所示的SEQ ID N0:20至少90% 同一的VL结构域。抗CGRP拮抗剂抗体优选包含至少一个CDR，所述CDR选自(a). SEQID N0:3或21 中所示的 CDR Hl ； (b). SEQ ID NO 4 或 22 中所示的 CDR H2 ； (c). SEQ ID NO 5 或 23 中所 示的 CDR H 3 ； (d). SEQ ID NO 6 或 24 中所示的 CDR Ll ； (e) SEQ ID NO 7 或 25 中所示的 CDR L2 ； (f) · SEQ ID NO 8 或 26 中所示的 CDR L3 ；禾口 (g) · W02007/054809 的表 6 中所示的 CDR Li、CDR L2 和 CDR H2 的变体。根据本发明的优选实施方案，抗CGRP拮抗剂抗体重链恒定区可来自任何类型的 恒定区，例如IgG, IgM, IgD, IgA和IgE ；和任何同种型例如IgGl、lgG2、IgG3和IgG4。更优选，抗CGRP拮抗剂抗体包含由具有ATCC登录号PTA-6867的表达载体产生的 重链。更优选，抗CGRP拮抗剂抗体包含由具有ATCC登录号PTA-6866的表达载体产生的轻 链。更优选，抗CGRP拮抗剂抗体由具有ATCC登录号PTA-6867和PTA-6866的表达载体产 生。优选，用于本发明的抗CGRP拮抗剂抗体是本文中定义的抗体Gl或抗体G2。根据本发明的另外的实施方案，抗CGRP拮抗剂抗体包含修饰的恒定区，如例如 W02007/054809中描述的。优选，修饰的恒定区在免疫学上是惰性的(包括在免疫学上部分 惰性的)，以便其不引起补体介导的裂解，不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)， 不活化小胶质细胞。优选修饰的恒定区的一个或多个此类活性降低。最优选，恒定区如 Eur. J. Immunol. (1999)29 :2613_2624 ；PCT 申请号 PCT/GB99/01441 ；禾口 / 或英国专利申请 9809951. 8中所述进行修饰。根据本发明的优选实施方案，抗CGRP拮抗剂抗体包括含有下 列突变的人重链IgG2恒定区A330、P331至S330、S331 (氨基酸编号参照野生型IgG2序 列)。Eur. J. Immunol. (1999)29 :2613_2624。制备和分离申请W02007/054809的抗CGRP拮抗剂抗体的方法以及证明所述抗体 的CGRP结合和拮抗剂特征的数据描述于申请W02007/054809中。所述申请的SEQ ID No. 1 至14的序列在本文中分别作为SEQ ID No. 1至14提供。根据本发明的另外的实施方案，药剂经制备用于外周施用，每周1至7次，更优选 每月1至4次，更优选每6个月的时期1至6次，更优选每年1至12次。优选，药剂经制备 用于在选自下列的时期内外周施用每天1次，每2、3、4、5或6天1次、每周1次、每2周1 次、每3周1次、每月1次、每2个月1次、每3个月1次、每4个月1次、每5个月1次、每6 个月1次、每7个月1次、每8个月1次、每9个月1次、每10个月1次、每11个月1次或 每年1次。根据优选实施方案，药剂经制备用于通过选自下列的一个或多个的途径外周施 用口服、舌下、口腔、局部、经直肠、通过吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内或肌内、通过心脏 内施用、骨内、真皮内、腹膜内、经粘膜、经阴道、玻璃体内、经表皮、关节内、关节周或局域。根据本发明的另外的实施方案，药剂经制备用于外周施用，以0. 1至200mg/ml的抗体浓度；优选以大约 0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mg/ml+/_10% 的误差中的任一 个的抗体浓度或以 0. 1 至大约 0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mg/ml+/_10 % 的误差中 的任一个之间的抗体浓度，最优选以50mg/ml的抗体浓度。根据本发明的另外的实施方案，药剂经制备用于外周施用，以0. 1至200mg/kg体 重的抗体浓度；优选以大约 0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mg/kg 体重 +/-10% 的误差 中的任一个的抗体浓度或以 0. 1 至大约 0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或 200mg/kg 体重 +/-10%的误差中的任一个之间的抗体浓度，最优选以10mg/kg的抗体浓度。根据本发明的优选实施方案，抗CGRP拮抗剂抗体具有超过2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、
66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、 112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、 150、152，154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、 188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208 或 210 天 +/-1 天中的任一个，更优选超 过7、8、9、10、11或12个月中的任一个的体内半衰期。优选，抗CGRP拮抗剂抗体具有超过6天的体内半衰期。根据本发明的另外的优选实施方案，药剂和/或抗CGRP拮抗剂抗体不产生中枢 神经系统和/或认知损害的作用。优选，药剂和/或抗CGRP拮抗剂抗体不诱导下列的任 一个或多个健忘症、意识错乱(confusion)、人格解体、感觉减退(hypesthesia)、异常思 维、牙关紧闭、眩晕、静坐不能、情感淡漠(apa thy)、共济失调、口周感觉异常、CNS刺激、情 绪不稳、欣快症、幻觉、敌对、感觉过敏、运动过度、张力减退、动作失调、性欲增强(libido increase)、躁狂反应、肌阵挛、神经痛、神经病、精神病、咬死(seizure)、谈话异常、木僵、自 杀意念；头晕、嗜睡、失眠、焦虑、震颤、抑郁或感觉异常。最优选，药剂和/或抗CGRP拮抗剂 抗体不诱导运动协调或注意力的损害。根据本发明的另外的实施方案，药剂和/或抗CGRP拮抗剂抗体不产生呼吸器官、 肾或胃肠的损害。根据本发明的另外的实施方案，药剂和/或抗CGRP拮抗剂抗体不产生身体和/或 心理依赖性的效应。优选，药剂和/或抗CGRP拮抗剂抗体不显示对阿片剂、苯并二氮革、苯 环利定(PCP)或N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体或CNS刺激物的亲和力，或产生任何镇 静或欣快效应。在一个实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体在施用后改善、控制中枢性痛觉、减少其 发病率或延迟其发展或进展。在另一个实施方案中，在相同的慢性疼痛的模型中，抗CGRP拮抗剂抗体的效应等 于和/或优于NSAIDS和/或阿片剂的效应。在一个实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体在治 疗顽固性疼痛群体中是有效的。根据本发明的另外的方面，提供了根据本发明的任何其他方面的用途或方法，其
21中将抗CGRP拮抗剂抗体与一种或多种另外的药学活性化合物或试剂(优选用于治疗慢性 疼痛的化合物或试剂)联合，且分开施用、相继施用或同时施用。优选，另外的试剂选自下 列的一种或多种⑴阿片样物质镇痛药，例如吗啡、海洛因、氢吗啡酮、羟吗啡酮、左啡诺、左洛啡 烷、美沙酮、麦啶、芬太尼、可卡因、可待因、双氢可待因、羟考酮、氢可酮、右丙氧芬、纳美芬、 烯丙吗啡、纳洛酮、纳曲酮、丁丙诺啡、布托啡诺、纳布啡或喷他佐辛；(ii)非类固醇抗炎药物(NSAID)，例如阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳 (diflusinal)、依托度酸、芬布芬、非诺洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、 酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、 托美丁或佐美酸、环氧合酶-2(C0X-2)抑制剂、塞来考昔；罗非考昔；美洛昔康JTE-522 ； L-745,337 ；NS398 ；，或其药学上可接受的盐；(iii)巴比妥类镇静剂，例如异戊巴比妥、阿普比妥、仲丁比妥、布他比妥 (butabital)、甲苯比妥、美沙比妥、美索比妥、戊巴比要、苯巴比妥(phenobartital)、司可 巴比妥、他布比妥、硫戊巴比妥(theamylal)或硫喷妥或其药学上可接受的盐；(iv)具有镇静作用的苯并二氮革，例如利眠宁、氯氮$、地西泮、氟西泮、劳拉西 泮、奥沙西泮、替马西泮或三唑仑或其药学上可接受的盐；(ν)具有镇静作用的H1拮抗剂，例如苯海拉明、美吡拉敏、异丙嗪、氯非尼拉敏或氯 环力嗪或其药学上可接受的盐；(vi)镇静药例如格鲁米特、甲丙氨酯、甲喹酮或氯醛比林或其药学上可接受的
^rt.；(vii)骨骼肌松弛药，例如巴氯芬、卡立普多、氯唑沙宗、环苯扎林、美索巴莫或奥 芬那君(orphrenadine)或其药学上可接受的盐；(viii)NMDA受体拮抗剂，例如右美沙芬((+)_3_羟基_N_甲基吗啡喃)或其代谢 产物右啡烷((+)-3_羟基-N-甲基吗啡喃)、氯胺酮、美金刚、吡咯喹啉醌或顺_4-(膦酰基 甲基)-2_哌啶羧酸或其药学上可接受的盐；(ix) α -肾上腺素能药，例如多沙唑嗪、坦洛新、可乐定或4-氨基-6，7_ 二甲氧 基-2-(5-甲磺酰氨基-1，2，3，4-四氢异喹啉-2-基)-5-(2-吡啶基)喹唑啉；(χ)三环抗抑郁药，例如地昔帕明、丙米嗪、阿米替林(amytriptiline)或去甲替 林(nortriptiline)；(xi)抗惊厥药，例如卡马西平或丙戊酸盐；(xii)速激肽(NK)拮抗剂，特别地NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂，例如(α R， 9R)-7-[3，5-二 (三氟甲基)苄基]-8，9，10，11-四氢 _9_ 甲基 _5-(4_ 甲苯基)-7Η_[1， 4] 二氮芳辛并[2，l-g][l，7]萘啶-6-13-二酮(TAK-637)、5-[[(2R，3S)-2-[(lR)-l-[3， 5_ 二(三氟甲基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]甲基]-1，2-二氢-3H-1，2， 4-三唑-3-酮(MK-869)、拉奈匹坦、达匹坦或3-[[2_甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]甲 氨基]-2-苯基-哌啶(2S，3S)；(xiii)毒蕈碱拮抗剂，例如奥昔布宁(oxybutin)、托特罗定、丙哌维林、曲司氯铵 (tropsium chloride)或达非那新；(xiv)C0X-2抑制剂，例如塞来考昔、罗非考昔或伐地考昔；
(XV)非选择性COX抑制剂(优选具有GI保护作用)，例如硝基氟吡洛芬 (HCT-1026)；(xvi)煤焦油镇痛药(coal-tar analgesic)，特别地对乙酰氨基酚；(xvii)精神安定药例如氟哌利多；(xviii)香草素受体激动剂(例如树脂毒素(resinferatoxin))或拮抗剂(例如 辣椒平)；(xix) β -肾上腺素能药例如普萘洛尔；(XX)局部麻醉剂，例如美西律；(xxi)皮质类固醇，例如地塞米松；(xxii) 5-羟色胺受体激动剂或拮抗剂；(xxiii)胆碱能(烟碱)镇痛药；(xxiv)曲马朵(商标)；(XXV)PDEV抑制剂，例如西地那非、伐地那非或他达拉非(taladafil)；(xxvi) α _2_ δ配体例如加巴喷丁或普瑞巴林；(xxvii)大麻素(canabinoid)；禾口(xxviii)抗抑郁药，例如阿米替林(Elavil)、曲唑酮(Desyrel)和丙咪嗪 (Tofranil)或抗惊厥药例如苯妥英(Dilantin)或卡马西平(Tegretol)。根据本发明的另外的方面，提供了用于在个体中预防和/或治疗慢性疼痛和/或 慢性疼痛的症状或用于改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状或减少其发病率或延迟 其发展或进展的药物组合物，所述药物组合物包含抗CGRP拮抗剂抗体和药学上可接受的 载体和/或赋形剂，其中组合物经制备用于外周施用。根据本发明的另外的方面，提供了试剂盒，其包括(a)如上定义的药物组合物；和(b)用于给个体外周施用有效量的所述药物组合物以预防和/或治疗慢性疼痛和 /或慢性疼痛的症状或改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状、减少其发病率或延迟其 发展或进展的说明书。试剂盒可包括一个或多个装有本文中描述的抗CGRP拮抗剂抗体或多肽的容器以 及根据本发明的任何方法和用途进行使用的说明书。试剂盒还可包括基于鉴定个体是否患 有慢性疼痛或处于患慢性疼痛的风险中来选择适合于治疗的个体的描述。药物组合物的外 周施用的说明书可包括关于用于期望的治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。本发明的各方面的优选特征在就实际情况加以必要的修正后同等地适用于每一 个其他方面。
实施例现参照下列意在举例说明而不在限定本发明的实施例来描述本发明。参照抗体Gl (抗人CGRP人单克隆抗体)以及抗体G2 (抗大鼠CGRP小鼠单克隆抗 体)产生下列实施例和附图(Wong HC等人Hybridomal2 :93-106(1993))。实施例1 啮齿类动物癌症机械性疼痛模型的建立使用的肿瘤细胞是由Novartis Institute(London)捐赠的同基因MRMT-1大鼠乳腺癌细胞。将细胞培养在含有10%胎牛血清(FCS)、1% L-谷氨酰胺、2%青霉素/链霉素 (Gibco)的RPMI 1640 (Gibco)中。用0. 1 % w/v胰蛋白酶进行2次短暂的清洗以释放附着 至培养瓶的细胞，然后用等体积的10%FCS进行淬灭，之后以1200rpm将溶液离心3分钟。 清洗沉淀，将其重悬浮于Hanks培养基中，使用血细胞计数器计算细胞的浓度，用台盼蓝染 色来测定死亡MRMT-I细胞的数目。然后根据看到的细胞的数目通过稀释溶液来获得3 X IO3 个细胞的终浓度。将终溶液保持在冰上直至注射的时间。将在手术时称重接近170g的雄性Sprague-Dawley大鼠用于产生癌症模型。使用 氟烷或异氟烷(1. 5-2% )66% N2O和33% O2在大鼠中诱导麻醉，在适当的区域上剃除腿上 的毛发，然后用氯己定(Animalcare Ltd, UK.)消毒。产生小切口以暴露胫骨远端的前内侧 表面。使用0. 7mm牙钻在骨膜中钻洞，通过该洞将2cm聚乙烯管插入胫骨的髓内腔lcm。通 过使用Hamilton注射器，将预先制备的10 μ 1 3 X IO3个MRMT-I细胞通过管注射至腔中。 然后取出管，使用骨修复材料(IRM，Dentsply USA)塞住洞。然后用0. 9%盐水冲洗伤口， 且用金属夹闭合伤口。使用相同的方法(但用10μ 1单独的Hank' s溶液进行注射)对假 手术动物(sham animal)进行手术。将动物置于温控恢复箱(thermoregulated recovery box)中直至能够将它们放回它们居住的笼子的时刻。实施例2 啮齿类动物抗CGRP抗体G2在癌症疼痛模型中的评估对躯体同侧和对侧的后爪的跖面使用von Frey细丝(North Coast Medical Inc.，USA)以测试针对机械刺激的行为。将大鼠置于具有网格底板(meshfloor)的Perspex 小室中并且让其适应环境10分钟。在同侧和对侧之间交替地对各后爪使用各von Frey 10 次，每次持续2至3秒。使用的Von Frey细丝具有1、5、9和15g的弯曲力，并且在不断加 大的von Frey力之间间隔5分钟的时间。疼痛应答(nocifensive response)(抬起)定 义为后爪的活跃缩足，并且记录在各von Frey上各爪抬起的次数(最多10次)，并且将其 表示为百分比应答。评估啮齿类动物抗CGRP抗体G2在减弱对多种静态机械、冷和整合的刺激的超敏 反应中的功效以及该已验证的癌症诱导的骨痛的模型中背景基线疼痛行为。测量的应答被 标准镇痛治疗例如吗啡和加巴喷丁减弱。所有测量都由相同的科学家以盲测方式(对化合 物/对照的身份和对动物的处理不知情)进行。在第9天以10mg/kg IV提供G2，在处理后2小时，然后在第10、11、12天，和然后 在第14至18天检测大鼠(图1)。G2对应对更高强度的机械性刺激的行为应答具有显著的效应。针对von Frey 8g 的缩足频率在注射后2小时降低，并且在第11和12天(注射后第2和3天，分别地ρ = 0.0164和0.0311)显著低于在媒介物处理组中看到的缩足频率。事实上，G2处理的动物现 具有与基线值相似的疼痛评分。到第14天(G2注射后第5天)，在G2与媒介物处理组之间 没有可辨别的差异。到MRMT-I注射后第18天(处理后第9天)，两组都达到相似水平的对 von Frey 8g的超敏反应。对von Frey 15g的超敏反应的相似的逆转也很明显。与媒介物处理组相比，对 von Frey 15g的超敏反应的降低在注射后2小时是明显的，在药物施用后第2和3天观察 到显著性(分别地ρ = 0. 02和0. 03)。到G2施用后6天，降低消失，并且到MRMT-I注射后 18天，两个组现达到相似的最大缩足频率(图2)。
结果表明G2减少了转移性骨癌大鼠模型中经历的有害疼痛。实施例3 用于运动损伤的转棒测试(rota rod test)骨癌疼痛模型中测试的另一个终点是步行(ambulation)(通过转棒法)。该测试 通过比较抗体处理的动物与对照对物(各自在相同的条件下经历相同的测试)获得运动损 伤的测量。转棒测试由4个被凸缘分开的滚筒(rotateable drum)(用电机驱动滚筒加速) (Ugo Basile, Comerio, VA, Italy)组成。对于给定的试验，将大鼠置于转棒上，旋转速度在 2分钟内从4rpm加速至16rpm。最大进行时间通常设置为120秒。各动物在手术后通常每 天接受3个试验(1小时的间隔)，进行连续数天。跌下转棒的潜伏期表示为3次试验的平 均值。在强迫步行期间从转棒跌下的潜伏期方面，抗体G2组与媒介物组之间没有发现 差异(图3)。这表明G2不损害参与运动协调或注意力的途径，并且表明不存在由抗体产生 的CNS副作用。实施例4:结合测定进行结合测定以测量抗CGRP抗体Gl和G2在SK_N_MC细胞中阻断人α -CGRP与 CGRPl-受体的结合的IC5(I。绘制剂量响应曲线，使用公式=Ki = IC5tl/(1+([配体]/Kd)确定 Ki值；图4，其中人α -CGRP对存在于SK-N-MC细胞中的CGRPl-受体的平衡解离常数Kd = SpM0将报导的IC5tl值(就IgG分子而言)转换成结合部位以便其可与通过Biacore测定的 亲和力(Kd)相比较，以低水平(通常100个响应单位)将N-生物素化的人和大鼠α -CGRP 捕获在单独的流动池上以提供反应表面，同时未修饰的流动池用作参照通道。在芯片表面 上滴定G1。根据动力学速率常数的商(KD = k。ff/k。n)推导出结合亲合力。参见表1。
G2小鼠Mab 7Ε9GlKD (ηΜ), α-Hu171. 00. 04IC50(ηΜ) α -Hu372. 61. 2KD (ηΜ) α-大鼠1. 0581. 2表 1芯片上的N-生
物素-CGRP eC k n(1/Wls0 koff(1/s) T1/2(h) K0 (nM)
α-Λ ‘............251.86χ1037.80x1 (Γ5 6ΒΤδ^
α-Λ37χ 10s3.63 x10 s S.300.063
P-A374.51x10s6,98 χ ItT5 2.760,155
Χ-大鼠25508 χ 104618x10^ 3 121 22
α-大鼠371,55 XlO53,99x10"4 04&2 57
P-大鼠STr6 16χ1057.85 χ σ5 2 4 0.152表2Gl对于人α禾口 β CGRP的结合亲和力相等(分别地Kd = 0. 155和0. 152nM)。G2
25对大鼠α和β CGRP的结合亲和力相等(分别地16和17ηΜ)。此外，对于α -CGRP，人中的 Gl结合亲和力是大鼠的40倍(分别地Kd = 0. 042和1. 22ηΜ)，并且对于β _CGRP，G1结合 亲和力在人和大鼠是等效的(分别地Kd = O. 155和0. 152nM)。抗体Gl还显示了良好的跨 物种选择性并且以与抗体G2相同的亲和力(大约1.2nM)结合大鼠α-CGRP(表2)。
Gl以高亲和力结合人和食蟹猴的α -和β -CGRP (分别地Kd = 63和155pM)。Gl 展示对于人/食蟹猴CGRP的物种选择性并且以更低的亲和力结合来自其他物种例如大鼠 的 α -禾口 β -CGRP (分别地 Kd = 2. 57ηΜ 和 152ρΜ)。
实施例5 抗CGRP的体内半衰期大鼠中抗CGRP的血清测量(图5)显示半衰期为大约7天。由于具有大约150，000 的分子量，抗体被限制在外周，图5a，5b，即其不能进入中枢神经系统或穿过血脑屏障。实施例6 抗CGRP抗体的选择性我们通过使用Biacore芯片“探测”mAb+肽的预混合的复合物的游离浓度来确定 抗体Gl对人或大鼠CGRP的特异性。如所预期的，当我们将抗体Gl与人或大鼠CGRP预温 育时，响应被完全阻断。相比之下，将Gl与过量的胰淀素(amylin)、降钙素或肾上腺髓质素 预温育与对照响应(Gl加缓冲液)相当，这表明Gl不与这些肽形成复合物(图7)。实施例7 抗体Gl结合表位的鉴定使用标准Biacore运行缓冲液(HBS-P)，在配备有链霉抗生物素蛋白包被(SA)的 传感器芯片的Biacore 3000 系统(Biacore AB, Uppsala, Sweden)上于25°C下进行相互 作用分析。首先我们确认N-生物素化的25-37人α-CGRP片段以与全长N-生物素化的人 α -CGRP相同的亲和力结合抗体G1。然后将位点27_37之间的各氨基酸逐个地突变成丙氨 酸，并且探测与野生型片段相比亲和力的倍数损失。以低水平(通常100个响应单位)将 N-生物素化的片段捕获在单独的流动池上以提供反应表面，同时未修饰的流动池用作参照 通道。产生纯化的抗体Gl的Fab片段。使用IyM作为2倍稀释系列的最高浓度，在芯片 上滴定Fab片段。以100 μ 1/分钟监控结合相和解离相，分别进行1分钟和5分钟。使用 35%乙醇+25mM Na0H+0. 5M NaCl的混合物再生表面。丙氨酸扫描结果显示，抗体Gl结合人α -CGRP的C末端区域，特别地残基25至 37，并且显示对可定义为表位并且位于最后5个C末端氨基酸(即，G33A至F37A)中的区 域的特异性结合(即当特异性结合区域被突变时，亲和力丧失显著增加)。G33A和F37A突 变引起亲和力的最大变化(图6)。C末端Phe对于抗体Gl对CGRP(对比相关肽和基因家 族成员)的选择性是非常重要的(图8)。因此，在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合由CGRP的氨基酸G33至F37 确定的表位的抗CGRP拮抗剂抗体。抗CGRP拮抗剂抗体可特异性结合由氨基酸序列GSKAF 确定的表位，更特别地结合确定为GXXXF的CGRP的表位，其中X可以是任何氨基酸，G33和 F37是最重要的表位残基(对于确定抗CGRP拮抗剂抗体的高亲和力结合来说)。实施例8 身体或心理依赖性的指标的分析抗体Gl和抗体G2都不显示CNS渗透。此外，与对照动物相比较，以之前实施例中 使用的水平接受任一抗体的动物(大鼠)的长期观察未显示不利的CNS事件例如镇静或兴 奋/欣快行为。这些观察表明，不存在对于抗体的依赖性危险，从而显示抗体的显著提高的 安全性(优于目前疼痛治疗中使用的现有阿片剂)。
实施例9 :胃肠不良作用的指标的分析使用抗体G2进行的1个月的体内大鼠研究和使用抗体Gl进行的1周对比研究 表明，与对照动物相比较，在行为、食物摄入、粪便产生或组织病理学方面未观察到不良的 胃肠作用。这些观察显示不存在对于抗体的胃肠危险，从而显示抗体的显著提高的安全性 (优于目前疼痛治疗中使用的现有NSAID)。实施例10 ；作为抗CGRP拮抗剂抗体的Gl和G2CGRP生物学活性的已知后果是当体内递送时产生神经源性潮红。Gl和G2经证明 为抗CGRP拮抗剂抗体，因为它们阻止了体内神经源性潮红的发展。通过使用神经源性皮肤潮红大鼠模型，就Gl在体内阻断CGRP效应的能力测试Gl 的功效。电刺激大鼠中的隐神经，从而引起CGRP从神经末梢释放和导致血管舒张，所得的 血流变化可使用激光Dopler法来测量。血流参数的变化表示为曲线下的面积(AUC，任意Dopler通量单位乘以时间的变 化)。CGRP受体拮抗剂CGRP8_37(400nmOl/kg，i.v.)用作阳性对照以验证模型的特异性(数 据未显示)。为了确定在给药前Gl对各动物的效应，用两次隐神经刺激(每次间隔30分 钟)建立针对刺激的基线血流响应。在第二次刺激的血流响应已回到基线水平后(刺激后 大约10分钟)，用Gl处理大鼠，并且以30分钟的间隔进行另外的4次刺激。结果(图9)显示在媒介物处理的动物中，血流响应没有显著变化，但用Gl处理的 大鼠显示血流响应的显著减少(对于10mg/kg和lmg/kg的处理，分别始于给药后90和120 分钟)。使用D2获得相似的活性。此外，在另外的神经源性潮红和血管舒张模型测试中，Gl 在IV给药后7天显示显著的效应(在隐神经刺激模型中，预测的ED5(l = 6ug/ml)。来自进 行的测试的结论是，Gl和G2显示抗CGRP拮抗剂活性。也在出版物，ZellerJ 等人 Br J Pharmacol. 2008Dec ； 155 (7) 1093-103. Epub 2008S印8中显示了抗体的相似的CGRP功能阻断能力。下面提供可用于实施本发明的抗体序列。抗体序列抗体Gl重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO!)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYffGQGTLVTVSS抗体Gl轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO 2)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIK抗体GlCDR Hl (扩展的 CDR) (SEQ ID NO 3)GFTFSNYffIS抗体GlCDR H2 (扩展的 CDR) (SEQ ID NO 4)EIRSESDASATHYAEAVKG抗体GlCDR H3 (SEQ ID NO 5)YFDYG LAIQNY抗体GlCDR Ll (SEQ ID NO 6)KAS KRVTTYVS
抗体GlCDR L2 (SEQ ID NO 7)GASNRYL抗体GlCDR L3 (SEQ ID NO 8)SQSYNYPYT抗体Gl重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO 9)GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCT GCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGC TGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTG ACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCT TACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC抗体Gl轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO=IO)GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTG CAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATC TACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTG ACCATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTC GGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAA杭体Gi 重 车Φ长杭体序歹U (Hma^icψm^mmmm iSG2) (seq ID NO 11)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR WSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK抗体Gl轻链全长抗体氨基酸序列(SEQ ID NO 12)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC抗体Gl重链全长抗体核苷酸序列(包括如本文中所描述的修饰的1^2) (SEQ ID NO 13)GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCT GCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGC TGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTG ACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCT TACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGCCTCCACCAA GGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCT GTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTA CACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTC
28CACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATC TCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGT GGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCG TGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCC AGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTAT TCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA抗体Gl轻链全长抗体核苷酸序列(SEQ ID NO 14)GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGC AAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTA CGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCA TCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAG GGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATA ACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC ACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTC TCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA人和大鼠CGRP(人 α -CGRP(SEQ ID NO 15)；人 β -CGRP(SEQ ID NO 16)；大鼠 α -CGRP(SEQ ID NO 17)；和大鼠 β -CGRP(SEQ ID NO 18))的氨基酸序列比较NH2-AC 麗 TATCVTHRLAGLLSRSGGWK 漏 NFVPTNVGSKAF-C0NH2 (SEQ ID NO 15)
NH2-AC 騰 TATCVTHRLAGLLSRSGG _ VK 謹 NFVPTNVGSKAF_CONH2 (SEQ ID NO 16)NH2- 1 C _ TATCVTHRLAGLLSRSGGVVK 誦 NFVPTNVGS 隱 AF-CONH2 (SEQ ID NO : 17)NH2- ■ C 羅 TATCVTHRLAGLLSRSGGffK 議 NFVPTNVGSKAF_CONH2 (SEQ ID NO 18)抗体G2重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO: 19)EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKAT LTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGNDGYWGQGTTLTVSS抗体G2轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO 20)EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKVLIYRASNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSTIPFTFGSGTKLEIK抗体G2CDR Hl (扩展的 CDR) (SEQ ID NO :21)SSVMH抗体G2CDR H2 (扩展的 CDR) (SEQ ID NO :22)YINPYNDGTKYNEKFKG抗体G2CDR H3 (SEQ ID NO :23)GGNDGY抗体G2CDR Ll (SEQ ID NO :24)
SASSSISSIYLH抗体G2CDR L2 (SEQ ID NO 25)RASNLAS抗体G2CDR L3 (SEQ ID NO 26)QQGSTIPFT抗体G2重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO 27)GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAG GCTTCTGGATACACATTCACTAGCTCTGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGG ATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAAT CCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGGGGT AACGATGGCTACTGGGGCCAAGGCACTACTCTCACAGTCTCCTCA抗体G2轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO 28)GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTG TAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCATTTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAAGTCTTG ATTTATAGGGCATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCT CTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTACTATACCATTCACG TTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA杭体G2重链Φ长杭彳本M某酸序歹Il (不句,括Fc结构域)(SEQ ID NO 29)EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKAT LTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGNDGYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKG YFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRD抗体G2轻链全长抗体氨基酸序列(SEQ ID NO 30)EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKVLIYRASNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSTIPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPRDIN VKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC抗体G2重链全长抗体核苷酸序列(不包括Fc结构域)(SEQ ID NO 31)GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAG GCTTCTGGATACACATTCACTAGCTCTGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGG ATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAAT CCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGGGGT AACGATGGCTACTGGGGCCAAGGCACTACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACT GGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAG TGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTAC ACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGC CAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGAT抗体G2轻链全长抗体核苷酸序列(SEQ ID NO 32)GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGT AGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCATTTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAAGTCTTGAT TTATAGGGCATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTACTATACCATTCACGTTCGGC TCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTT AACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAGAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTG ATGGCAGTGAACGACAAAATGGTGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGC AGCACCCTCACATTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAAC TTCACCCATCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA
权利要求
抗CGRP拮抗剂抗体用于制造药剂的用途，所述药剂用于预防和/或治疗慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状。
2.权利要求1的用途，其中所述药剂经制备用于外周施用。
3.权利要求1的用途，其中外周施用所述药剂。
4.权利要求1至3的任一项的用途，其中所述药剂经制备用于口服、舌下、通过吸入、透 皮、皮下、静脉内、动脉内、关节内、关节周、局域和/或肌内施用。
5.权利要求4的用途，其中所述药剂经制备用于皮下或静脉内施用。
6.前述权利要求的任一项的用途，其中抗CGRP拮抗剂抗体在施用后在外周起作用。
7.前述权利要求的任一项的用途，其中慢性疼痛包括慢性伤害性疼痛、慢性神经性疼 痛、慢性炎性疼痛、纤维肌痛、爆发性疼痛和持续性痛的一种或多种。
8.权利要求7的用途，其中慢性疼痛还包括痛觉过敏、异常性疼痛、中枢致敏、外周致 敏、抑制解除和增强的易化的一种或多种。
9.前述权利要求的任一项的用途，其中慢性疼痛是癌症疼痛。
10.权利要求9的用途，其中癌症疼痛是由下列病况的一种或多种引起的疼痛腺组 织中的腺癌、器官的胚性组织中的母细胞瘤、上皮组织中的癌、形成血细胞的组织中的白血 病、淋巴组织中的淋巴瘤、骨髓中的骨髓瘤、结缔或支持性组织中的肉瘤、肾上腺癌、AIDS 相关淋巴瘤、贫血、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、化学疗法、结肠癌、血细胞 减少、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头部癌症、颈癌、肝胆管癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴 瘤、何杰金氏病、淋巴瘤、非何杰金氏病、神经系统肿瘤、口癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直 肠癌、皮肤癌、胃癌症、睾丸癌症、甲状腺癌、尿道癌、骨癌、结缔组织的肉瘤癌、骨组织的癌 症、造血细胞的癌症、骨髓癌、多发性骨髓瘤、白血病、原发性或继发性骨癌、转移至骨的肿 瘤、浸润神经和空腔脏器的肿瘤和邻近神经结构的肿瘤。
11.前述权利要求的任一项的用途，其中抗CGRP拮抗剂抗体(a)结合CGRP ；(b)阻断CGRP结合其受体；(c)阻断或减少CGRP受体的激活；(d)抑制、阻断、压制或降低CGRP的生物学活性；(e)增加CGRP的清除；和/或(g)抑制CGRP的合成、产生或释放。
12.前述权利要求的任一项的用途，其中抗CGRP拮抗剂抗体(i)是人抗体，( )是人源化的抗体，(iii)是单克隆抗体，(iv)以50nM或更小的Kd结合CGRP(如在37°C下通过表面等离子共振术测量的)；和/或(ν)具有至少7天的体内半衰期。
13.前述权利要求的任一项的用途，其中抗CGRP拮抗剂抗体特异性结合CGRP的C末端 区域。
14.权利要求12的用途，其中抗CGRP拮抗剂抗体特异性识别由序列GSKAF确定的表位。
15.前述权利要求的任一项的用途，其中抗CGRP抗体包含在氨基酸序列上与SEQID NO :1或19至少90%同一的VH结构域。
16.前述权利要求的任一项的用途，其中抗CGRP抗体包含在氨基酸序列上与SEQID NO 2或20至少90%同一的VL结构域。
17.权利要求16的用途，其中抗CGRP抗体还包含在氨基酸序列上与SEQID NO :1或 19至少90%同一的VH结构域。
18.权利要求1至14的任一项的用途，其中抗CGRP抗体包含至少一个选自下列的CDR (a).如SEQ ID NO 3 或 21 中所示的 CDR Hl ；(b)·如 SEQ ID NO 4 或 22 中所示的 CDR H2 ；(c).如SEQ ID NO 5 或 23 中所示的 CDR H3 ；(d).如SEQ ID NO 6 或 24 中所示的 CDR Ll ；(e)如SEQ ID NO 7 或 25 中所示的 CDR L2 ；(f).如SEQ ID NO 8 或 26 中所示的 CDR L3 ；禾口(g).Ll、L2和H2的变体。
19.权利要求1至14的任一项的用途，其中抗CGRP抗体包含在氨基酸序列上与SEQID NO :1至少90%同一的VH结构域和在氨基酸序列上与SEQ ID NO :2至少90%同一的VL结 构域。
20.权利要求1至14的任一项的用途，其中抗CGRP抗体包含由具有ATCC登录号 PTA-6867的表达载体产生的重链。
21.权利要求1至14的任一项的用途，其中抗CGRP抗体包含由具有ATCC登录号 PTA-6866的表达载体产生的轻链。
22.权利要求1至14的任一项的用途，其中抗CGRP抗体由具有ATCC登录号PTA-6867 和PTA-6866的表达载体产生。
23.前述权利要求的任一项的用途，其中所述药剂经制备用于通过皮下或静脉内注射 而外周施用，每个月施用1、2、3或4次之间。
24.前述权利要求的任一项的用途，其中所述药剂经制备用于以5至100mg/ml的抗体 浓度外周施用。
25.前述权利要求的任一项的用途，其中所述药剂经制备用于以1至100mg/kg体重的 抗体浓度外周施用。
26.前述权利要求的任一项的用途，其中所述药剂不产生运动协调或注意力的CNS损伤。
27.前述权利要求的任一项的用途，其中不通过中枢、脊柱或鞘内途径施用抗CGRP拮 抗剂抗体。
28.前述权利要求的任一项的用途，其中抗CGRP拮抗剂抗体不是中枢、脊柱或鞘内渗 透分子。
29.前述权利要求的任一项的用途，其中将抗CGRP抗体与一种或多种另外的药学活性 化合物联合，且分开施用、相继施用或同时施用。
30.权利要求29的用途，其中所述一种或多种另外的药学活性化合物选自⑴阿片样物质镇痛药，例如吗啡、海洛因、氢吗啡酮、羟吗啡酮、左啡诺、左洛啡烷、美 沙酮、麦啶、芬太尼、可卡因、可待因、双氢可待因、羟考酮、氢可酮、右丙氧芬、纳美芬、烯丙 吗啡、纳洛酮、纳曲酮、丁丙诺啡、布托啡诺、纳布啡或喷他佐辛；( )非类固醇抗炎药物(NSAID)，例如阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、芬 布芬、非诺洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那 酸、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁或佐美酸，或其药学上 可接受的盐；(iii)巴比妥类镇静剂，例如异戊巴比妥、阿普比妥、仲丁比妥、布他比妥、甲苯比妥、美 沙比妥、美索比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、他布比妥、硫戊巴比妥或硫喷妥或其 药学上可接受的盐；(iv)具有镇静作用的苯并二氮$，例如利眠宁、氯氮革、地西泮、氟西泮、劳拉西泮、奥 沙西泮、替马西泮或三唑仑或其药学上可接受的盐；(ν)具有镇静作用的H1拮抗剂，例如苯海拉明、美吡拉敏、异丙嗪、氯非尼拉敏或氯环力 嗪或其药学上可接受的盐；(vi)镇静药例如格鲁米特、甲丙氨酯、甲喹酮或氯醛比林或其药学上可接受的盐；(vii)骨骼肌松弛药，例如巴氯芬、卡立普多、氯唑沙宗、环苯扎林、美索巴莫或奥芬那 君或其药学上可接受的盐；(viii)NMDA受体拮抗剂，例如右美沙芬((+)-3_羟基-N-甲基吗啡喃)或其代谢产 物右啡烷((+)-3_羟基-N-甲基吗啡喃)、氯胺酮、美金刚、吡咯喹啉醌或顺_4-(膦酰基甲 基)~2~哌啶羧酸或其药学上可接受的盐；(ix)α-肾上腺素能药，例如多沙唑嗪、坦洛新、可乐定或4-氨基-6，7-二甲氧 基-2-(5-甲磺酰氨基-1，2，3，4-四氢异喹啉-2-基)-5-(2-吡啶基)喹唑啉；(x)三环抗抑郁药，例如地昔帕明、丙米嗪、阿米替林或去甲替林；(xi)抗惊厥药，例如卡马西平或丙戊酸盐；(xii)速激肽(NK)拮抗剂，特别地ΝΚ-3、ΝΚ-2或NK-I拮抗剂，例如(αR，9R) _7_[3， 5_ 二(三氟甲基)苄基]-8，9，10，11-四氢-9-甲基-5-(4-甲苯基)-7Η_[1，4] 二氮芳辛 并[2,1-g] [1,7]萘啶-6-13-二酮(TAK-637)、5-[[(2R，3S)-2-[(lR)-l-[3，5-二(三氟甲 基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]甲基]-1，2-二氢-3H-1，2，4-三唑-3-酮 (MK-869)、拉奈匹坦、达匹坦或3-[[2_甲氧基_5-(三氟甲氧基)苯基]甲氨基]_2_苯 基-哌啶(2S，3S)；(xiii)毒蕈碱拮抗剂，例如奥昔布宁、托特罗定、丙哌维林、曲司氯铵或达非那新；(xiv)COX-2抑制剂，例如塞来考昔、罗非考昔或伐地考昔；(xv)非选择性COX抑制剂(优选具有GI保护作用)，例如硝基氟吡洛芬(HCT-1026)；(xvi)煤焦油镇痛药，特别地对乙酰氨基酚；(xvii)精神安定药例如氟哌利多；(xviii)香草素受体激动剂(例如树脂毒素)或拮抗剂(例如辣椒平)；(xix)β -肾上腺素能药例如普萘洛尔；(XX)局部麻醉剂，例如美西律；(xxi)皮质类固醇，例如地塞米松；(xxii)5-羟色胺受体激动剂或拮抗剂；(xxiii)胆碱能(烟碱)镇痛药；(xxiv)曲马朵(商标)； (XXV) PDEV抑制剂，例如西地那非、伐地那非或他达拉非；(xxvi)α -2- δ配体例如加巴喷丁或普瑞巴林；和(xxvii)大麻素。
31.治疗和/或预防个体中的慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的方法，所述方法包括给 所述个体外周施用治疗有效量的抗CGRP拮抗剂抗体。
32.用于治疗和/或预防个体中的慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的药物组合物，其包 含抗CGRP拮抗剂抗体和药学上可接受的载体，其中所述组合物经制备用于外周施用。
33.一种试剂盒，其包括(a)权利要求32的药物组合物，和(b)给个体外周施用治疗有效量的所述药物组合物以治疗和/或预防慢性疼痛和/或 慢性疼痛的症状的说明书。
全文摘要
本发明涉及用于预防和/或治疗慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的抗CGRP抗体，且涉及使用抗CGRP抗体治疗和/或预防慢性疼痛和/或慢性疼痛的症状的方法。
文档编号C07K16/26GK101959528SQ200980107603
公开日2011年1月26日 申请日期2009年3月3日 优先权日2008年3月4日
发明者D·L·谢尔顿, I·马钦, J·泽勒, K·T·波尔森, L·克拉蒂尼 申请人:辉瑞有限公司