副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒的制作方法

专利名称：副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及副鸡禽杆菌抗体的检测方法和检测试剂盒。具体来说，本发明涉及 副鸡禽杆菌抗体的检测方法，该方法包含通过ELISA法检测由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragalliniirum，禾尔力 A. pg。(Hemphilus paragallinarum)) A 型菌和/或C型菌的菌体外膜蛋白(以下也称为“HMT P210多肽”)诱导的抗体，其中，所 述ELISA法以含有该外膜蛋白的非同源区域或其一部分氨基酸序列的肽作为固相抗原；以 及该方法中使用的检测试剂盒。根据构成该肽的氨基酸残基数，肽以二肽、三肽、寡肽、多肽 等名称称呼，本发明中不对它们进行区别，均定义为肽。
背景技术：
由于感染A. pg而发病的鸡传染性鼻炎是鸡的重要的呼吸系统疾病。鸡传染性鼻 炎发病鸡的主要症状是鼻液流出、呈现颜面肿胀或者流泪。鸡传染性鼻炎导致鸡的生长率 降低、产蛋开始的延迟、产蛋率降低或产蛋停止，其经济损失较大。Page等人将A. pg分类为A、B和C型三种型(非专利文献1)，Sawata等人将其分 类为1型和2型两种型(非专利文献2)。之后，Kume等人报道Page等人的A型相当于 Sawata等人的1型，Page等人的C型相当于Sawata等人的2型(非专利文献3和4)。目 前，A. pg的A型(1型)菌(以下也称为“A. pg-A型菌”)和C型(2型)菌(以下也称为 “A. pg-C型菌”)成为鸡传染性鼻炎的主要病因菌。关于鸡传染性鼻炎的预防，以往广泛使用将A. pg-A型菌或A. pg-C型菌的菌体用 福尔马林、硫柳汞(thimerosal)等灭活得到的疫苗。但是，在给予这些疫苗时，存在在接种 鸡的局部形成坏死病灶(非专利文献5)等的副作用的问题，人们强烈期望开发安全性高的疫苗。在上述状况下，人们开发了以下的疫苗等组分疫苗(component vaccine)，只 从菌体或培养上清中取出保护性抗原(protective antigen，感染防御抗原)即有效成分 (component，组分)，制成疫苗；重组疫苗，通过基因重组技术克隆编码保护性抗原的基因， 使该基因在细菌、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等中表达，纯化大量表达的表达产 物，将其作为疫苗；或者是载体疫苗，将编码保护性抗原的基因插入到病毒载体等中。例如德永等人从A. pg-A型菌的培养液中诱导生成红细胞凝集抑制抗体(HI抗 体)，成功地纯化了可防御A. pg-A型菌引起的鸡传染性鼻炎的、来自该A型菌的分子量约 130kDa的多肽(专利文献1)。并发现，克隆编码该130kDa多肽的DNA片段并在大肠杆菌中 表达的该重组蛋白可以防御副鸡禽杆菌A型菌引起的鸡传染性鼻炎的感染。进一步以编码 130kDa多肽的DNA片段作为探针，鉴定了 HMT p210基因，该基因编码含有2，042个氨基酸 的A型HMT p210多肽(具有红细胞凝集活性的菌体外膜蛋白)。还同样地从C型菌中 克隆 了与该DNA片段杂交的DNA片段，获得了来自C型菌的C型HMT p210基因(专利文献2)。 还有报道称，将A型菌和C型菌的HMT p210基因的开放阅读框(0RF，open reading frame) 的核苷酸序列进行比较，两者的同源性占全体的80%，5’一侧的约3. 4kbp的区域(以下称为区域1)和3’ 一侧的约1. 2kbp的区域(以下称为区域3)具有非常高的同源性，由两个 区域夹持的约1. 5kbp的区域(以下称为区域2)则同源性低(专利文献2)。据野吕等人的报道，德永等人发现的HMT p210基因作为型特异性的疫苗的靶区域 是很重要的。野吕等人还报道通过将编码A. pg-A型HMT p210多肽的HMT p210基因的 一部分即由4，SOlbp 5，157bp的DNA片段所编码的肽免疫鸡，则该肽具有诱导对A. pg-A 型菌的HI抗体以及疫苗的效果(专利文献3)。另外，野吕等人在第143回日本兽医学会 (2007年4月3 5日举办，日本)上报道通过将编码C型HMT p210多肽的HMT p210基 因的一部分即由5. 5kbp的DNA片段HPC5. 5所编码的肽免疫鸡，同样具有诱导对A. pg-C型 菌的HI抗体和疫苗的效果。感染了 A. pg的鸡有急性的过程，并且在发病后也难以诱导抗体生成，因此以往并 未进行鸡传染性鼻炎的血清诊断。而给予了疫苗的鸡中，诱导出存在于A. pg菌体表面的对 红 细胞凝集素(Hemagglutinin，以下称为“HA”)的抗体，在体外评价疫苗效果时，可进行利 用抗HA抗体的红细胞凝集抑制试验(以下也称为“HI试验”)。HI试验中使用了新鲜鸡红 细胞或戊二醛固定的鸡红细胞，但也被认为有以下的缺点(1)在A. pg-A型菌的疫苗效果 的评价中必须采用新鲜的鸡红细胞，因此需要确保供血用鸡(在与病原体隔离的状态下的 饲养管理)、采血和血液处理等烦杂且较为费事；(2)受到鸡红细胞批次的影响，并且抗体 效价的判定是根据测定者主观进行判定，难以获得稳定的成绩等。另一方面，Sun等人报道了利用型特异性单克隆抗体的封闭ELISA(B-ELISA)，以 此作为代替HI试验的血清诊断法(非专利文献6)。B-ELISA是以将A型菌或C型菌体超 声波破碎所得的破碎物作为抗原，使用与各血清型反应的单克隆抗体，竞争性检测血清中 的抗体的ELISA法。本方法与HI试验相比，灵敏度高，具有可以对应多检体优点。但是必 须进行血清的添加、单克隆抗体的添加、抗小鼠IgG-HRP标记抗体的添加和显色底物的添 加这四个步骤，与常规的ELISA方式比较多一个步骤，操作烦杂。另外，为了采用本方法，还 必须确保型特异性单克隆抗体。在制备试剂盒方面，除抗原固相化板、参照血清之外还必须 制备单克隆抗体并附在试剂盒中。并且，该B-ELISA是在各血清中检测仅与一个单克隆抗 体所识别的抗原表位相对的抗体的系统。在检测与一个表位相对的抗体的系统中，由于菌 体的变异而失去该表位时，则无法检测菌体感染或疫苗接种抗体的危险性更高。专利文献1 日本特开平10-84969专利文献2 :W098/12331专利文献3 日本特开2005-218414非专利文献1 :Am. J. Vet. Res. ,23 85 95，1962非专利文献2 Jpn. J. Vet. Sci. ,40 645 652，1978非专利文献3 :Am. J. Vet. Res. ,41 757 760，1980非专利文献4 :Am. J. Vet. Res. ,41 1901 1904,1980非专利文献5 =Avian Dis.，15 109 117，1971非专利文献6 :Int. Ass. Bio. (IABS) 35 :317 320，200
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供可分别区别对A. pg的A型菌和C型菌的抗体的抗体检测 方法。具体来说，提供一种抗体检测方法，其特征在于该方法使用可分别区别对A. pg的A 型菌和C型菌的抗体的重组抗原肽。更具体地说，提供一种抗体检测方法，其特征在于使 用含有在A. pg的A型菌和C型菌的外膜蛋白之间同源性低的区域内的氨基酸序列的重组 抗原肽。解决课题的方法
本发明人等为了实现上述目的进行了深入的研究，结果发现在作为疫苗抗原 很重要的HMT p210基因所编码的p210多肽的偏离区域2的氨基酸序列的位置，含有在 A.pg-A型菌和A. pg-C型菌之间同源的氨基酸序列(SEQ ID NO :1所述的A. pg-Α型菌第 243 273号氨基酸序列和SEQ ID NO :2所述的A. pg_C型菌第38 68号氨基酸序列的 31个氨基酸中，29个氨基酸一致，参照图3)，并且发现该氨基酸序列形成表位。并且本发 明人等还发现在由德永等人定义的区域2的C末端区域的一部分含有在A. pg-A型菌和 A. pg-C型菌之间同源性高的氨基酸序列。因此，在A. pg-A型菌和A. pg-C型菌的各HMT p210 多肽中，制备不含有上述两个同源的氨基酸序列的肽，使用所得肽，通过在微量板上固相化 的ELISA法进行抗体测定。结果确认可分别特异性识别由来自A. pg-A型菌的疫苗和来自 A. pg-C型菌的疫苗所诱导的抗体，从而完成了本发明。因此，本申请发明如下所述。(1)副鸡禽杆菌抗体的检测方法，其特征在于，该方法包含使下述肽A或B的至少 一种抗原与检体反应的抗体测定方法肽A 为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含 有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273号氨基酸序列的肽；肽B 为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含 有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68号氨基酸序列的肽。(2)上述(1)所述的检测方法，其特征在于肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。(3)上述(1)所述的检测方法，其特征在于肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。(4)上述⑴所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链肽A:为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序 列第8 236号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273号氨基 酸序列的肽；肽B 为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序 列第69 452号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68号氨基 酸序列的肽。(5)上述⑴所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链肽A 为含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第8 236号氨基酸序列的肽；肽B
为含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第69 452号氨基酸序列的肽。(6)上述(4)所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链肽A:为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序 列第274 445号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273号氨 基酸序列的肽。(7)上述(5)所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链肽A 为含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第274 445号氨基酸序列的肽。(8)上述1 7中任一项所述的检测方法，其特征在于肽A或B是具有1或多个 氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。(9)上述1 8中任一项所述的检测方法，其特征在于抗体测定方法选自ELISA 法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。(10)上述1 9中任一项所述的检测方法，其特征在于检体是感染了副鸡禽杆 菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。(11)副鸡禽杆菌抗体测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒使用下述肽A或B的至少 一种作为抗原肽A 为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含 有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273号氨基酸序列的肽；肽B 为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的一部分、含有6个氨基酸以上的肽链且不含 有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68号氨基酸序列的肽。(12)上述(11)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是10个氨基酸以上 的肽链。(13)上述(11)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于肽A或B是20个氨基酸以 上的肽链。(14)上述(11)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链肽A 为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序 列第8 236号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273号氨基 酸序列的肽；肽B 为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序 列第69 452号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68号氨基 酸序列的肽。(15)上述(11)所述的抗体测定试 剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链肽A 为含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第8 236号氨基酸序列的肽；
肽B 为含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第69 452号氨基酸序列的肽。(16)上述(14)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链肽A 为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序 列第274 445号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273号氨 基酸序列的肽。(17)上述(15)所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链肽A 为含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第274 445号氨基酸序列的肽。(18)上述11 17中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于肽A或B是具 有1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。(19)上述11 18中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于抗体测定方法 选自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。(20)上述11 19中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于检体是感染了 副鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。发明效果根据本发明，可以提供副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒。本发明中使用的来 自A. pg-A型菌和A. pg-C型菌的肽互相不含有同源的氨基酸序列，因此与由来自A. pg-A型 菌的疫苗和A. pg-C型菌的疫苗所诱导的抗体分别特异性结合。因此，本发明的检测方法和 试剂盒不仅是在单独将各疫苗给予鸡时，在给予将两者混合的疫苗时也可以分别识别并测 定存在于鸡血清中的各个菌体的抗体效价。另外，根据本发明，使用纯化重组抗原的结果，与使用A. pg菌体破碎物的以往的 技术相比，可以使更高浓度的抗原固相化，因此可以构建抗体的检测灵敏度更高的抗体测 定系统。另外，本申请发明的抗体的检测方法对于抗原肽具有识别A. pg的血清型的能力， 因此与使用型特异性单克隆抗体的B-ELISA相比更为简便，且从菌体的抗原变异的角度考 虑，可以更确实地检测出对A. pg的抗体。并且，通过本发明的检测方法，不仅可以识别给予疫苗后的鸡血清，也可以识别 A. pg感染鸡血清中的抗体。


图1是表示HMT p210多肽及其片段以及各片段的位置关系的图。涂黑部分表示 区域2内的同源序列，网格部分表示区域2的C末端同源区域。图中所述的氨基酸SEQ ID NO相当于专利文献2的序列表SEQ ID N0:1(A型菌)和序列表SEQ ID NO :5 (C型菌)中 公开的氨基酸SEQ ID NO。图2是表示由大肠杆菌纯化的各多肽的SDS-PAGE结果的图。M 标志物，泳道1 P-A Δ 6b-lb,泳道 2 :P_C Δ 6b_lb图3是表示由HMT p210基因编码的氨基酸序列的非同源区域中同源的氨基酸序 列及其位置的图。图中所述的氨基酸SEQ ID NO相当于专利文献2序列表SEQ ID N0:1(A型菌)和序列表SEQ ID NO :5 (C型菌)中公开的氨基酸SEQ ID NO。图4是观察以A型菌攻击前血清的多肽Ρ-ΑΔ 6b_2#作为抗原的ELISA值与A型 菌攻击后的防御发病的相关性的图。图中的“· ”表示未发病的鸡，“〇”表示发病的鸡。图5是观察以C型菌攻击前血清的多肽P-CA 6b_lb作为抗原的ELISA值与C型 菌攻击后的防御发病的相关性的图。图中的“· ”表示未发病的鸡，“〇”表示发病的鸡。
具体实施例方式本申请发明的特征在于通过以下述的肽作为抗原的抗体测定方法的副鸡禽杆菌 抗体的检测方法和试剂盒，所述肽是将由来自A. pg的HMT p210基因所编码的氨基酸序列 中的少许存在于非同源区域中的A. pg-A型菌和A. pg-C型菌之间的同源的氨基酸序列除去 而得到的肽。本申请发明的副鸡禽杆菌抗体的检测方法中，使用由来自A. pg-A型菌和/或 A. pg-C型菌的HMT p210基因所编码的氨基酸序列的非同源区域或其一部分作为抗原。这 里，非同源区域定义为从夹持在5’ 一侧的约3. 4kbp的DNA区域所编码的氨基酸序列(区 域1)和3’ 一侧的约1. 2kbp的DNA区域所编码的氨基酸序列(区域3)的两个区域的、约 1. 5kbp的DNA区域(区域2)所编码的氨基酸序列中除去C末端一侧的同源序列而得到的 约1.3kbp的区域(SEQ ID N0:1(A型菌)和SEQ ID NO :2 (C型菌))(参照图1)。以下，将 编码该非同源区域的氨基酸序列的基因称为“A. pg-1. 3基因”，在对A型菌和C型菌的两者 进行区别时，分别称为“A. pg-Al. 3基因”、“A. pg-Cl. 3基因”。从A. pg感染鸡中分离的3株A型菌(221株、053株和W株)的相当于HMT p210 基因的非同源区域的核苷酸序列在053株和W株之间完全一致，在两株和221株之间仅有 一个碱基发生变异。而3株C型菌(53-47株、Modest株和NK-I株)之间的同源区域的核 苷酸序列只是Modest株和NK-I株相对于53-47株有3个碱基(1个氨基酸)缺失。因此， 可以说同一血清型之间的非同源区域高度保守，本申请发明中，可以使用同一血清型内的 任何菌株。A. pg-Al. 3基因以及含有该基因的DNA片段可通过以下方法获得。A. pg 的增殖可 以使用适当含有聚胨、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、谷氨酸钠、酵母提取物、氯化钠、鸡汤、β NAD、 鸡血清等的培养基。本申请发明中，为了进行小、中容量的菌体增殖，使用含鸡血清的鸡 肉汤培养基(IOOOmL培养基中含有5g聚胨S、Ig酪蛋白氨基酸、5g氯化钠、5g L-谷氨酸 钠、Ig葡萄糖、IOg酵母提取物、175mL鸡汤、25mL鸡血清、0. 025%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (β-NAD))。培养条件通常在温度37°C、时间16 24小时的范围内设定，这可根据使用目 的、培养形态、接种的菌量、培养基规模等适当调节。培养液中的菌体通过离心(8，000rpm，20分钟)回收在沉淀物中。HMT p210基 因可按照Sambrook等人叙述的常规的基因重组技术(Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. ,1989),以由菌体 提取的总RNA、mRNA或基因组DNA作为起始材料来制备。实际中可使用市售的试剂盒。例 如RNA的提取可以使用TRIzol试剂(4 >匕’卜口夕工 >公司)、ISOGEN( 二 ,水。> 夕一 > 公司)、StrataPr印 Total RNA Purification Kit (StrataPr印总 RNA 纯化试剂盒)(东洋 纺)等的试剂，染色体DNA的提取可以使用力〃 ”一 > 试剂盒(三光纯药)、IS0PLANT (和光纯药)，mRNA的纯化可以使用mRNA Purification Kit(mRNA纯化试剂盒)(了 m “ K < 才寸 < 工 > 7 公司)、Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit (Poly (A) Quick mRNA 分离 试剂盒)(东洋纺)、mRNA Separator Kit (mRNA分离试剂盒)(々口 >〒？々公司)等的 试剂盒，转换为 cDNA 可以使用 SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning ( 4 > 卜 口 夕工 > 公司)、cDNA Synthesis Kit (cDNA 合成试剂盒)(宝 酒造)、SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits (SMART PCR cDNA合成 和文库构建试剂盒)(夕口 > 夕公司)、Directionary cDNA文库构建系统()^ ^工 乂公司)、GeneAmp PCR Gold( ” 八卜、K 4才〉7于Λ文公司)等。
更具体来说，使用七^ ”一 >试剂盒(三光纯药)等，从通过离心回收的菌体中提 取的染色体DNA，将其用适当的限制酶(优选使用EcoRI)切断，插入到市售的克隆载体中 (例如，λ gtll ； 二-一 4 >夕‘，> 卜‘八4才，7" ^ (NEB)公司)，制备DNA文库。以所得 DNA片段为模板，使用LA Taq(夕力，才株式会社)，按照所附的流程，通过PCR法扩增 各种大小的DNA片段。PCR中使用的引物可根据德永等人公开的来自A. pg-A型菌和A. pg-C 型菌的HMT p210基因的核苷酸序列(专利文献1)设计。PCR用引物如果委托DNA合成受 托机构(例如，夕'” m卞” ^ ^ >公司)等，则可以容易地获得。此时，在上游侧引 物的5’末端和下游侧引物的5’可以附加适当的限制酶切位点的核苷酸序列。PCR扩增产 物克隆到基因克隆载体、pCR-XL-T0P0( 4 > ii卜α 7 - >株式会社)中，可获得插入了各 种DNA片段的质粒pCRDNT。所得DNA片段的核苷酸序列先克隆到pBluescript II SK+( ^
卜，夕夕一 > 公司)或pCR2. 1-T0P0 ( 4 > '卜口夕工 > 公司)中，然后由DNA测序仪(ABI Prism 377 ” 八卜、K 4才〉7于Λ文公司)确定。如后所述，只要不会导致灵敏度降低或非特异性反应的增大，一部分中导入了氨 基酸变异的肽也可以作为本申请发明的抗体测定方法中的抗原使用。在肽的特定的氨基 酸中导入变异时，通常是采用向编码该肽的DNA片段的核苷酸序列中导入变异的位点定 向诱变法(site-directed mutagenesis)。实际中可以使用应用了该技术的Takara公司 白勺位‘点定向诱变系统(Site-Directed Mutagenesis System) (Mutan-Super Express Km、 Mutan-Express Km>Mutan-K 等)>Stratagene &司的 QuickChange Multi 胃向式 剂盒、QuickChange XL位点定向诱变试剂盒、Invitrogen公司的GeneTailor位点定向诱变 系统等市售的试剂盒，按照所附的流程来进行。在获得编码在A. pg-A型菌和A. pg-C型菌之间不含有同源氨基酸序列的各种肽的 氨基酸序列的DNA片段时，可以从非同源区域(分别为SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列(A 型菌)和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列(C型菌))中设计引物，使其不含有上述同源序 列，以上述A. pg-1. 3基因以及含有该基因的DNA片段作为模板，通过常规的PCR法进行。如 果是较短的氨基酸序列，则也可以通过人工合成制备该DNA片段。本申请发明中，表1显示 了制备的DNA片段和引物。将这样得到的DNA片段插入适当的表达载体中，将其导入宿主，由此可以进行各 DNA片段的表达。表达载体例如可以使用pQE30(、7 V >公司)或pET22b ()“ ”工> 公司或夕才株式会社制备)等，也可以适当选择。外源蛋白或肽的表达常用细菌、 酵母、动物细胞、植物细胞和昆虫细胞等，可以结合使用目的进行选择。在转化宿主细胞时 可以利用公知的方法。例如可以利用磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用脂转染系统的脂质体的方法、原生质体的聚乙二醇融合法、电穿孔法等，可根据所使用的宿主细胞选择适当的方 法。在表达本申请发明的各DNA片段时，可以使用可大量表达的大肠杆菌。关于大肠杆菌表 达用，已经开发并销售具有trp启动子、T7启动子、cspA启动子等的各种表达载体，因此可 以从中适当选择使用。根据表达载体，可选择适当的大肠杆菌、例如BL21、HMS174、DH5 α、 HBlOU JM109等作为宿主。大肠杆菌的转化可以使用市售的感受态细胞，按照所附的方法 进行。这样，可以获得生产目标多肽的重组大肠杆菌。在大肠杆菌的培养中所使用的培养 基(例如，LB、SOC、SOB等)、转化体的选择所使用的试剂(例如氨苄青霉素等)以及诱导 表达所使用的试剂(例如，吲哚乙酸(IAA)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG))通常可以 使用市售商品。培养基的PH在适合大肠杆菌增殖的范围(ρΗ 6 8)内使用。表达目标肽(目标产物)的重组大肠杆菌的筛选如下进行。在表达诱导剂(本 发明中使用的表达系统中使用IPTG)存在下、通过离心(10，000rpm，5分钟)回收培养、 增殖的菌体，向其中加入一定量的蒸馏水，使其悬浮，然后通过超声波处理或者弗氏压碎 器(French Press)、7 >卜> 丨」> (Manton Golin)等的勻浆器破碎菌体，通过离心 (15，OOOrpm，15分钟)分离、回收在沉淀或上清中。蒸馏水中可以添加适当的表面活性剂 (例如，Triton X100)、螯合剂(例如，EDTA)、溶菌酶等。对一定量的回收到上清和沉淀中 的表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色，然后确认分子大小以及由 染色图像确认目标产物的表达。关于目标产物的确认(或检测)除基于上述的分子大小的 方法之外，还可以采取基于ELISA法、蛋白质印迹法、斑点杂交法等抗原抗体反应的方法。 这均是检测在任何大肠杆菌中表达的外源蛋白或多肽时的常规方法，可以根据目标适当选 择。由重组大肠杆菌纯化目标产物时，通常采用将蛋白质化学中使用的纯化方法、例 如离心、盐析法、超滤法、等电点沉淀法、电泳法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层 析法、疏水层析法、羟基磷灰石法等方法组合的方法。所得蛋白质或多肽的量可使用BCA蛋 白质测定试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc)、蛋白质测定试剂盒(BI0-RAD，Inc)等蛋白 测定试剂进行测定。为了使目标物的纯化容易进行，还可以以与其它多肽或肽融合的形式表达。表达 上述融合蛋白的载体可以例举可附加寡组氨酸的His-tag表达系统()>公司)、 可表达附加了 FLAG标志的融合蛋白的系统(〉V 7公司)、可制备与谷胱甘肽S转移酶 (GST)的融合蛋白的GST融合蛋白质纯化系统(π * 乂 Λ 7 7 > * 7公司)、MagneHis 蛋白质纯化系统(7 π J if公司)等。例如如在本发明的实施例中进行的，以与寡组胺酸 的融合蛋白的形式表达后，使用镍亲和柱(GE > ^ > 7 /W ^ > ^公司)可以特 异性纯化目标多肽。如此得到的不含有A. pg-A型菌和A. pg-C型菌之间的同源氨基酸序列的区域的各 种肽可用于鸡传染性鼻炎疫苗抗体的检测或用于进行A. pg感染鸡的血清学诊断的抗体测 定。具体来说可以适用ELISA法、蛋白质印迹法、斑点杂交法等的抗体测定方 法。需要应对 多个检体时，优选采用使肽固相化的微量板法的ELISA法。微量板中固相化的肽可以使用含有由A. pg-1. 3基因所编码的氨基酸序列中的非 同源区域的肽及其一部分。通常由6 10个左右的氨基酸可以形成被抗体识别的表位(在 线上(http://www. genosys. jp/products/spots/spots_faq. html)公开了被抗体识另lj 的表位有3 6个氨基酸即足够)，因此本申请发明中可以使用非同源区域的一部分、含有连 续的6个氨基酸以上的氨基酸序列的肽。为了提高特异性，优选由含有非同源区域中的连 续的10个氨基酸以上的肽，进一步优选由含有连续的20个氨基酸以上的肽形成表位。最优选使用由A Δ 6b-2#编码的多肽(Ρ_Α Δ 6b_2#)、由C Δ 6b_lb编码的多 肽(P-C Δ 6b-lb)、以及由A Δ 7b-lb编码的多肽(Ρ_Α Δ 7b_lb)、以及含有由包含它们的 A. pg-1. 3基因编码的氨基酸序列中的非同源区域的肽的一部分。只要不会导致在抗体检测 方面出现障碍的灵敏度降低或非特异性反应增大，也可以使用这些肽的一部分中导入了氨 基酸变异的变异肽。这些肽可以根据目的将两种以上的肽分别组合使用。例如确定鸡传染 性鼻炎的病因菌时，优选单独使用各肽，或者分别独立使用将来自A. pg-A型菌的肽之间或 者来自A. pg-C型菌的肽之间混合得到的混合物。如果只是要调查鸡传染性鼻炎感染的流 行病学或鸡传染性鼻炎疫苗的效果，也可以进一步将来自A. pg-A型菌和A. pg-C型菌的混 合物混合使用。给予疫苗后的免疫血清通常可以以1 3次、2 4周的间隔将上述的肽与佐剂 的混合物给予适当的动物皮下、皮内、腹腔内等，然后将采集的血液进行离心(14，000rpm， 5分钟)获得。佐剂可以使用弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝(例如， ImjectAlum(匕°7 — 7公司))等。副鸡禽杆菌感染动物的血清也可以同样地将血液离心获得。更具体来说，可以进行各种方法的ELISA，可以是任何方法。例如首先将检体(免 疫血清或A. pg感染血清)添加到将肽固相化的微量板中，清洗后添加标记的抗鸡抗体作为 二次抗体。还可以通过与抗肽特异性抗体组合，通过竞争法的ELISA来实施，该竞争法的 ELISA是将检体和标记抗肽(固相抗原)抗体同时或分别添加到使肽固相化的微量板中，或 者，抗肽抗体未标记时，添加对抗肽抗体的标记二次抗体。肽在微量板上的固相化通常通过以抗原量1 10μ g/ml、在室温(25°C左右)下 放置30分钟 2小时，或在低温(4°C左右)下放置12 24小时来进行。用于抑制非特异 性反应的封闭试剂例如有7 口 7々-一 ^ (雪印公司)、ELISA用封闭试剂(口 * ^ ·夕’ A >/ m A、” 7公司)、牛血清白蛋白溶液、脱脂乳溶液等，可以适当选择使用。各 反应后的清洗可使用PBS、TBS或其中含有Polysorbate (Tween 20)或防腐剂(叠氮化钠) 等的试剂，反应终止可以使用2 3mol的硫酸进行。作为二次抗体，用HRP、荧光标记、RI、 生物素化标记的抗鸡IgG单克隆抗体，例如抗鸡IgG-HRP(《”千 >公司)等市场有销售， 因此可以使用上述抗体。例如HRP的底物有OPD (邻苯二胺)和TMBZ (3，3’，5，5’ -四甲基 联苯胺)，分别以492nm、450nm测定吸光度。首先，可以在微量板上固定肽的抗体，采用使上述肽与该抗体结合的双抗体夹层 的ELISA法。这种情况下，肽的抗体可以使用多克隆抗体和单克隆抗体的任意一种。多克隆 抗体可通过与上述免疫血清同样的方法获得，免疫所使用的动物例如有鸡、大鼠、豚鼠、仓 鼠、狗、猴等。单克隆抗体可以是从用A. pg菌体或多肽免疫的动物中采集脾细胞或淋巴细 胞等抗体生成细胞，按照Milstein等人的方法(Method Enzymo 1.，73，3 46，1981)，与骨 髓瘤细胞株等融合，通过制备生成本申请发明中使用的肽的抗体的杂交瘤来获得。还可以 通过利用噬菌体展示技术的抗体制备技术(Phage Display of Peptides and Proteins =A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay 等人、Antibody Engineering :A PRACTICALAPPROACH Edited by J. McCAFFERTY等人、ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK)可以制备与本申请发明中使用的肽结合的抗体。采用如此建立的ELISA法的抗A. pg抗体的测定方法可以用于疫苗抗体或由A. pg 感染诱导的抗体的检测。以下按照实施例进一步详细说明本发明，但并不限于下述的实施 例。实施例1A. pr-13基因及其区域内DNA片段的制备按照德永等人的方法(日本特开平10-84969)制备A. pg-Α型菌221菌株和A. pg-C 型菌53-47株的基因组DNA文库。简单来说，使用七〃夕一 >试剂盒(三光纯药)，从通过 离心(8，OOOrpm, 20分钟)回收的菌体中提取染色体DNA，用限制酶Sau3AI消化，制备DNA 文库。以该DNA文库的DNA片段为模板，使用LA Taq(夕力，〃 4才株式会社)，按照所附 的流程，通过PCR法扩增含有A.pg-1.3基因的一部分的片段。PCR反应是使用LA PCR试剂 盒版本2 (宝酒造制备)，在96°C下反应1分钟，然后将96°C 40秒、56°C 60秒、72°C 120秒 的反应进行30个循环，然后进行72°C 10分钟的反应。图1表示各DNA片段的位置关系。 各DNA片段的扩增以及其中使用的PCR引物如表1所示。各引物中附加了限制酶识别序列。[表 1]
DNA片段5，引物3，引物
AA6b-lb 5，A Δ 6b_lb_P (SEQ ID NO 5)3，A Δ 6b_lb_P (SEQ ID NO 6)
A Δ 3-05’ A Δ 3-0-P (SEQ ID NO 7)3’ A Δ 3-0-P (SEQ ID NO 8)
A Δ 5-05’ A Δ 5-0-P (SEQ ID NO 9)3’ A Δ 5-0-P (SEQ ID NO 10)
A Δ 5-15，AA5-1-P(SEQ ID NO 11)3’ AA5_1_P(SEQ ID NO 12)
AA6b-lb 5，C Δ 6b_lb_P (SEQ ID NO 13) 3，C Δ 6b_lb_P (SEQ ID NO 14) A Δ 5-15’ CA5-1-P(SEQ ID NO 15)3’ CA5_1_P(SEQ ID NO 16)
A Δ 6-05’ C Δ 6-0-P (SEQ ID NO 17)3，C Δ 6-0-P (SEQ ID NO 18)
AA6b-2# 5' A Δ 6b-2#-P (SEQ ID NO: 19) 3’ A Δ 6b-2#-P (SEQ ID NO 20) AA7b-lb 5' A Δ 7b-lb-P (SEQ ID NO 21) 3’ A Δ 7b_lb_P (SEQ ID NO 22)实施例2各DNA片段的表达将实施例1所得的各DNA片段用 适当的限制酶消化，通过0. 8%琼脂糖电泳分离，使用 Quantum Prep Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Co试剂盒洗脱并回收扩 增片段。将所得片段预先用相同的限制酶消化，将5’末端与去磷酸化的的质粒pQE30(与r Y >公司制备，6个His-tag序列存在于紧邻起始密码子的下边)或pET22b连接，使用该片 段转化大肠杆菌JM109株。进一步将含有扩增片段的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的Circle Grow培养基(7 t 二〉株式会社)中培养一夜，第二天加入IPTG，使终浓度为ImM，进一步 培养2. 5小时。离心(10，000rpm，5分钟)后舍弃上清，将沉淀物悬浮于培养液的1/10量 的裂解缓冲液 A(Lysis buffer A) (8M 尿素、100mMNaH2P04、IOmM Tris、10mM 咪唑，pH 8.0) 中，溶解菌体。离心(15，OOOrpm，15分钟)后回收细胞裂解物上清。将回收的细胞裂解物 上清与ImL M-NTA琼脂糖凝胶混合，使其吸附在凝胶上，然后填充到带有底栓的柱中。将 柱清洗后用洗脱液(8M尿素、IOOmM NaH2PO4UOmM Tris、IOmM咪唑，pH 8.0)回收洗脱组分， 进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。A型、C型、各片段中作为ELISA抗 原使用的AA6b_lb和CA6b_lb的表达产物的电泳图谱如图2所示。实施例3抗多肽鸡血清的制备将实施例2所得的多肽P-A Δ 5-1用PBS稀释，浓度为10 μ g/剂量，进一步加入 氢氧化铝凝胶，终浓度为20%，将其以3周的间隔对5周龄的SPF鸡的颈部皮下进行免疫， 共进行2次。对于其它多肽P-A Δ 3-0、P-A Δ 5-0、P-C Δ 5-1和P-C Δ 6-0用PBS稀释，浓度 为IOyg/剂量，然后制备与油佐剂乳化的乳化液(每1剂量(0.5mL)中含有0. Olg抗原、
0.OOlmL以下福尔马林、0. OlmL Polysorbate 80、0. 04mL失水山梨醇倍半油酸酯、0. 36mL 轻质液体石蜡、余量为磷酸缓冲液)，对5周龄的SPF鸡的颈部皮下给予1次。在9 11周 龄时采血，得到各多肽的免疫血清。实施例4通过ELISA确认与各多肽免疫血清的反应性将实施例2 所得的多肽 P-AA6b-lb、P_AA6b_2#、P_AA7b_lb 和 P_CA6_lb 用 50mM碳酸氢盐缓冲液稀释，浓度为1. 0 2. 5 μ g/mL,分别向96孔板中加入100 μ L并使其 固相化。在室温下吸附1小时，然后舍弃反应液，用200μ L的PBS-T (8. ImM磷酸氢二钠、
1.5mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、2. 7mM氯化钾、0. 05% Tween 20)清洗，然后加入200 μ L 含5%脱脂乳的PBS-T进行封闭。舍弃封闭液，将血清用含脱脂乳的PBS-T稀释50 100倍，向各孔中分别添加100 μ L，在室温下反应1小时。除去反应液后用PBS-T清洗3 次，将抗鸡IgG-HRP标记抗体用含1 %脱脂乳的PBS-T稀释10，000 20，000倍，分别添加 100 μ L0在暗处、室温下反应1小时。除去反应液后用PBS-T清洗3次，分别添加100 μ L显 色底物液(IOOmM柠檬酸、200mM磷酸氢二钠、0.004%邻苯二胺、过 氧化氢)，在室温下反应 30分钟。分别添加IOOyL 3M硫酸，终止显色。用96孔板读数仪(96well plate reader) (日本* 二一，一^公司制备)测定492nm的波长，其结果如表2所示。[表 2]
权利要求
1.副鸡禽杆菌抗体的检测方法，其特征在于，该方法包含使下述的肽A或B的至少一种 抗原与检体反应的抗体测定方法肽A:为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273号氨基酸序列的肽； 肽B:为SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68号氨基酸序列的肽。
2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于肽A或B是10个氨基酸以上的肽链。
3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于肽A或B是20个氨基酸以上的肽链。
4.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链 肽A:为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第 8 236号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273号氨基酸序 列的肽； 肽B:为SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列第 69 452号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列第38 68号氨基酸序 列的肽。
5.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽链 肽A:为含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第8 236号氨基酸序列的肽； 肽B 为含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第69 452号氨基酸序列的肽。
6.权利要求4所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链 肽A:为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列第 274 445号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273号氨基酸 序列的肽。
7.权利要求5所述的检测方法，其特征在于，肽A是下述的肽链 肽A:为含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第274 445号氨基酸序列的肽。
8.权利要求1 7中任一项所述的检测方法，其特征在于肽A或B是具有1或多个 氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。
9.权利要求1 8中任一项所述的检测方法，其特征在于抗体测定方法选自ELISA 法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。
10.权利要求1 9中任一项所述的检测方法，其特征在于检体是感染了副鸡禽杆菌 的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。
11.副鸡禽杆菌抗体测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒使用下述肽A或B的至少一种作为抗原 肽A:为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273号氨基酸序列的肽； 肽B:为SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的一部分、含有6个氨基酸以上的肽链且不含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68号氨基酸序列的肽。
12.权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是10个氨基酸以上的 肽链。
13.权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于肽A或B是20个氨基酸以上的 肽链。
14.权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链 肽A:为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第 8 236号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273号氨基酸序 列的肽； 肽B:为SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列第 69 452号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列第38 68号氨基酸序 列的肽。
15.权利要求11所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽链 肽A:为含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第8 236号氨基酸序列的肽； 肽B 为含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第69 452号氨基酸序列的肽。
16.权利要求14所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链 肽A:为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列第 274 445号氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273号氨基酸 序列的肽。
17.权利要求15所述的抗体测定试剂盒，其特征在于，肽A是下述的肽链 肽A:为含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第274 445号氨基酸序列的肽。
18.权利要求11 17中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于肽A或B是具有 1或多个氨基酸残基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。
19.权利要求11 18中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于抗体测定方法选 自ELISA法、蛋白质印迹法和斑点杂交法。
20.权利要求11 19中任一项所述的抗体测定试剂盒，其特征在于检体是感染了副 鸡禽杆菌的鸡血清或给予了副鸡禽杆菌疫苗的鸡血清。
全文摘要
本发明提供副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒。具体而言，本发明提供副鸡禽杆菌抗体的检测方法，该方法包含通过ELISA法检测由副鸡禽杆菌A型菌或/和C型菌的菌体外膜蛋白诱导的抗体，其中，所述ELISA法是以含有该外膜蛋白的非同源区域或其一部分的氨基酸序列的肽作为抗原；以及该方法中使用的检测试剂盒。
文档编号C07K16/12GK102007414SQ200980113170
公开日2011年4月6日 申请日期2009年2月6日 优先权日2008年2月8日
发明者今村孝, 坂元隆一, 坂口正士, 牛岛稔大 申请人:一般财团法人化学及血清疗法研究所