专利名称：具有磷脂酶抑制活性的分离的肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂肪酶领域。具体而言，其涉及具有磷脂酶抑制活性的分离的肽和 编码该肽的分离多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主 细胞以及产生和使用该肽的方法。其另外涉及具有磷脂酶抑制活性的多肽和能够受上述 肽和/或多肽抑制的脂肪酶。
背景技术：
脂肪酶(EC3丄1.3)水解三酰甘油的酯键并在非水系统中催化酯化和酯交换(酸 解、醇解和相互酯化)。一些脂肪酶，如磷脂酶，水解磷脂中的酯键，所述磷脂为对于 细胞膜结构和功能是极为重要的，且为膜脂质中最丰富的极性脂质。Nagao等，1998， J.Biochem.124 1124-29 描述了异孢镰孢(Fusarium heterosporum)磷脂酶的 26 个氨基酸 C-末端肽在增加所述脂肪酶的热稳定性中起重要作用，且该肽对酶活性无影响。考虑到脂质的广泛用途，例如，作为消化剂，用于在面团和面团焙烤产物中产 生味道；作为治疗剂，洗涤剂的成分，作为光学解析(optical resolution)的催化剂等，期 望有控制脂肪酶酶活性的手段。此外，从生产的角度而言，期望控制脂肪分解活性，因 为可选择制备其酶活性可再现的酶产物。
发明内容
本发明的目标是提供具有脂肪酶抑制活性的肽和编码该肽的多核苷酸，以及包 含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞和产生并使用所述肽的方法。本发明的 目标另外还在于提供具有脂肪酶抑制活性的多肽和能够受上述肽和/或多肽抑制的脂肪酶。本发明涉及具有磷脂酶抑制活性的分离的肽，选自(a)分离的肽，包含与SEQ ID NO 1的289-310残基或SEQ ID NO 9的154-175残基具有至少65%、至少70%、 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或100%同一性的 氨基酸序列；(b)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸在中等严格条件或高严格 条件下与SEQ ID NO 1的肽编码序列或所述SEQ ID NO 1的肽编码序列的互补链杂 交；(c)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO: 1的289-310 残基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%,至少97%或100%同一性的核苷酸序列；或(d)包含具有下列氨基酸序列的基序的 分离的肽M^DAXsL^XsKgl^NnX^WMX^XwDnX^EwU^K^ 其中 X4、X5、 X8、X12、X15、X16、X18和X21独立地可为任何氨基酸，其中该肽的大小小于60个氨基 酸(aa)。
本发明亦涉及包含所述肽和脂肪酶的多肽，其中所述脂肪酶在平板测定法中具 有低于 50PHLU/mg，低于 45PHLU/mg，低于 40PHLU/mg，低于 35PHLU/mg，低于 30PHLU/mg,低于 25PHLU/mg，低于 20PHLU/mg，低于 15PHLU/mg，低于 10PHLU/ mg，低于5PHLU/mg或低于lPHLU/mg磷脂酶活性，和/或不显示磷脂酶活性。本发明亦涉及具有磷脂酶抑制活性的多肽，其中具有a-螺旋的至少三个溶剂 可接近的(solvent acessible)残基位于其表面的亲本蛋白质在该a-螺旋中在对应于位置 D3、L6、L10, Y13、V14、D17和X21的至少一个溶剂可接近的残基处和/或对应于该基序 的位置E7、K9、Nn、乂18和Y2(1边缘残基处经修饰。本发明亦涉及分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、包含所述肽或多 肽的重组宿主细胞，以及产生具有磷脂酶抑制活性的分离的肽或多肽的方法。本发明亦涉及将所述肽或多肽结合于所述脂肪酶时，所述肽或所述多肽用于抑 制脂肪酶的酶活性的用途。本发明亦涉及具有在平板测定法中磷脂酶活性低于50PHLU/mg，低于 45PHLU/mg,低于 40PHLU/mg，低于 35PHLU/mg，低于 30PHLU/mg，低于 25PHLU/ mg,低于 20PHLU/mg，低于 15PHLU/mg，低于 10PHLU/mg，低于 5PHLU/mg 或低于 lPHLU/mg和/或不显示磷脂酶活性的脂肪酶，其能够受所述肽抑制，其中所述脂肪酶 包含至少一个改变，所述改变独立地为插入、缺失或取代，由此在结合(a)具有磷脂酶抑 制活性的分离的肽；或(b)在所述多肽中包含的具有磷脂酶抑制活性的肽中至少之一时 所述脂肪酶的活性受到抑制。附图简述
图1显示尖镰孢(F.oxysporam)磷脂酶的序列比对。图2显示a - 3和全a蛋白质序列。图3显示来自尖镰孢a螺旋的残基的溶剂可接近性(solvent accessiblility)。图4显示GZEL的晶体。图5显示GZEL晶体的代表性衍射图样。图6显示FoL PI的肽诱导改变。图7显示莫尼糖蛋白(Monellin)变体1(即MON1)和莫尼糖蛋白变体2(即 MON2)序列。图8显示对于多种肽的初始反应速率的变化。图9显示对于多种肽和脂肪酶的％抑制的变化。序列表SEQIDNO: 1:尖镰孢，FoLSEQ ID NO 2 禾谷镰孢(Fusarium Graminearium)SEQ ID NO 3 丛赤壳属(Nectria)脂肪酶 1SEQ ID NO 4 丛赤壳属脂肪酶2SEQ ID NO 5 异孢镰孢SEQ ID NO 6 半裸镰孢(Fusarium semitectum)SEQ ID NO 7 腐皮镰孢(Fusarium solani) LipCSEQ ID NO 8 腐皮镰孢 LipD
SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO 定义
磷脂酶活性
9:细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)，TLL 10:镶片镰孢(Fusariumvenenatum)PLA2，FVPLA2 11 菌丝霉素(plectasin) 12莫尼糖蛋白
13 Protegrin
14芽孢杆菌RNA酶(Barnase)
15胱蛋白(Cystatins)
16载脂蛋白E
术语“磷脂酶活性”在本文中定义为磷脂分解(EC号3丄1.4)活 性，其将磷脂转化为脂肪酸和其他亲脂性物质。就本发明而言，磷脂酶活性根据在下文 段落“材料和方法”中描述的PHLU和平板测定法的步骤来确定。磷脂酶抑制活性术语“磷脂酶抑制活性”在本文中定义为抑制磷脂酶活性的 活性。本发明的肽具有SEQIDNO 1的成熟多肽的至少20%，至少40%，至少50%， 至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或100%的磷脂酶抑制活性。分离的肽/多肽术语“分离的肽”或“分离的多肽”在本文中分别指自源 (source)分离的肽或多肽。在某些方面，所述肽/多肽如通过SDS-PAGE或HPLC所确定 的为至少纯，至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯， 至少80 %纯或至少90 %纯。肽纯度通过HPLC确定。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一 性”来描述。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS 程序包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等， 2000，Trends in Genetics 16 276-277)(优选版本 3.0.0 或更新的版本)的 Needle 程 序中执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48 443-453)来确定的。使用的可选参数是缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和 EBLOSUM62CBLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的 Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的(相同的残 基xl00)/(比对的长度-比对中的缺口总数)。就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序 列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程 序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定。使用 的可选参数是缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL (NCBI NUC4.4 的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief 选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的(相同的脱氧核糖核苷酸xl00)/(比对 的长度-比对中的缺口总数)。
同源序列术语“同源序列”在本文中定义为在tfasty检索(Pearson，W.R., 1999,于 Bioinformatics Methods and Protocols, S.Misener 禾口 S.A.Krawetz 编，185-219 页)中给出小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。同源性的程度可适当的通 过本领域已知的计算机程序来确定，如GCG程序包中提供的GAP (Program Manual forthe Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B.和 Wunsch，C.D., (1970)， Journal of Molecular Biology, 48，443-45)。 在本发明中，禾谷镰孢、丛赤壳属脂肪
酶、腐皮镰孢、半裸镰孢、尖镰孢、异孢镰孢和细毛嗜热霉(同物异名疏棉状腐质霉 (Humicolalanuginose))的脂肪酶序列的相应(或同源)位置由图1所示的比对定义。为 了寻找未显示于比对中的脂肪酶序列的同源位置，将目标序列和图1所示的序列进行比 对。将新序列与图1的现有比对通过使用由所述GAP程序所找到的最具同源性序列的 GAP比对来进行比对。对于多肽序列比较使用下述设定GAP产生罚分(GAP creation penalty)为 3.0 而 GAP 延伸罚分(GAP extension penalty)为 0.1。分离的多核苷酸术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷 酸。在某些方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少纯，至少5%纯， 至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯或至少90%纯。编码序列当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨 基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起 始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG 和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。核酸构建体术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核 酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自 然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有 表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。控制序列(control sequence)术语“控制序列”在本文定义为包括对编码本发 明多肽的多核苷酸的表达是必需的所有组分。各个控制序列对于编码所述多肽的核苷酸 序列可以是天然的或外源的，或各个控制序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些控 制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转 录终止子。最少的情况，控制序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。控制序列可以 和接头一起提供，所述接头目的为引入特异性限制位点的，所述特异性限制位点促进控 制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将控制序 列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得控制序列指导多肽编码序列的 表达。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转 录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含 编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作 地连接。宿主细胞如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞 类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易 感的(susceptible)。改变术语“改变”在本文的意思是，对由SEQIDNO: 1的成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学改变，以及对编码这样的多肽的DNA的遗传操作。所述改 变可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个) 氨基酸侧链的置换。为了易于参考，在描述本发明的经修饰的氨基酸序列时，采用了以 下命名法原始氨基酸位置取代氨基酸。根据这种命名法，例如，在位置195中用 谷氨酸(E)取代甘氨酸(G)表示为G195E。在相同的位置中缺失甘氨酸表示为G195'， 而插入额外的氨基酸残基例如赖氨酸(K)表示为G195GK。与其它脂肪酶相比，当特定 脂肪酶含有“缺失”并且在该位置进行插入的情况，就在位置36插入天冬氨酸(D)而 言，将这种情况表示为'36D。用加号分隔多个突变，即R170Y+G195E，分别表示在位 置170用酪氨酸(Y)取代精氨酸(R)，和在位置195用谷氨酸(E)取代甘氨酸(G)。当 应用所述比对方法时，X231表示在亲本多肽中对应于位置231的氨基酸。X231R表示 用R置换所述氨基酸。就SEQ ID NO : 2而言，X是T，因此X231R表示用R取代位 置231的T。当某个位置(例如231)中的氨基酸可以由选自一组氨基酸(例如由R和P 和Y组成的组)的另一个氨基酸取代时，将这种情况表示为X231R/P/Y。在所有的情况 下，采用公认的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。一个给定的氨基酸残基是否在所述酶的表面可根据W.Kabsch和C.Sander (1983). Biopolymers 22, 2577-2637 页.Dictionary of protein secondary structure pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features确定，例如当其溶剂可接近的表面用DSSP程 序计算超过30人2时。发明详述本发明人发现了一种肽，其可自尖镰孢或禾谷镰孢(玉米赤霉(Gibberella zeae))的C-端分离，并能够结合所述脂肪酶。他们另外还显示了尖镰孢的肽具有磷 脂酶抑制活性。因此表明自任何合适的磷脂酶，例如，丛赤壳属脂肪酶、红球丛赤壳 (Nectria haematococca)(真马特镰孢(Fusarium eumartii))、腐皮镰孢、大刀镰孢(Fusarium culmorum),半裸镰孢和异孢镰孢分离的类似的C_端肽，可用于抑制磷脂酶活性。在第一方面，本发明涉及具有磷脂酶抑制活性的分离的肽，选自(a)分离的 肽，包含与SEQ ID NO 1的289-310残基或SEQ ID NO 9的154-175残基具有至少 65%,至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97% 或100%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸在中等严 格条件或高严格条件下与SEQ ID NO 1的肽编码序列或所述SEQ ID NO 1的肽编码 序列的互补链杂交；(c)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:
1的289-310残基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%,至少95%、至少97%或100%同一性的核苷酸序列；或(d)包含具有下列氨基酸 序列的基序的分离的肽Mi^DsXAsL^TXsIQI^NnUnVMXuXwD 17X18E19Y2OX21K22 其中X4、X5、X8、X12、X15、X16、X18和X21独立地可为任何氨基酸，其中该肽的大小 小于60个氨基酸(aa)。在另一方面，本发明涉及具有长度少于55aa，少于50aa，少于45aa，少于 40aa,少于35aa或少于30aa的肽。在另一方面，本发明涉及具有长度至少15aa，至少20aa或至少25aa的肽。在另一方面，本发明涉及这样的肽，其中所述肽具有a-螺旋的二级结构。
在另一方面，本发明涉及这样的肽，其中在基序中存在的X4、X5、X8、X12、 X15、X16、&8和乂21位置中每一个处的氨基酸独立选取，使得&为A或E;或 Q ； X8为K或A ； X12为S或N ； X15为E、Q或A ； X16为L或M ； X18为K或Q ；而 X21为I或V。尖镰孢脂肪酶(FoL)的肽可经改变以改进或减少所述肽抑制所述脂肪酶的能 力。上述改变的实例示于表1。表1:在来源于尖镰孢脂肪酶的，具有磷脂酶抑制活性的肽中，对应于SEQID NO 1的残基317-346处的改变，以通过改变的肽获得对野生型脂肪酶改进的或减少的 抑制。
权利要求
1.一种具有磷脂酶抑制活性的分离的肽，选自(a)分离的肽，其包含与SEQID NO 1的289-310残基或SEQ ID NO 10的 154-175残基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、至少97%或100%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸在中等严格条件或高严格条件下与 SEQ IDNO 1的肽编码序列或所述SEQ ID NO 1的肽编码序列的互补链杂交；(C)由多核苷酸编码的分离的肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO: 1的289-310 残基具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%,至少97%或100%同一性的核苷酸序列；或(d)分离的肽，其包含具有下列氨基酸序列的基序M1T2D3X4X5L6E7X8K9LltlN11X12Y1 I3V14X15X16D17X18E19Y20JC21IC22, X4> Χδ> Xs、Χ 2> X15、X16> X18和X21独立地可为任 何氨基酸，其中该肽的大小小于60个氨基酸(aa)。
2.权利要求1的肽，其具有少于55aa，少于50aa，少于45aa，少于40aa，少于35aa， 或少于30aa的长度。
3.权利要求1或2的肽，其具有至少15aa，至少20aa或至少25aa的长度。
4.权利要求1的肽，其中所述肽具有α-螺旋的二级结构。
5.权利要求1的肽，其中在基序中存在的X4、X5>X8> X12> X15、X16> X18和X21位 置中每一个的氨基酸独立地选取，使得X4SA或E ； X5 SE或Q ； X8SK或A ； X12为 S或N ； X15为E、Q或A ； X16为L或M ； X18为K或Q ；而X21为I或V。
6.权利要求1-4任一项所述的肽，其与SEQID NO: 1相比在对应于FoL残基D291 ； L294 ； E295 ； K297 ； L298 ； N299 ； Y301 ； D305 ； K306 ； Y308 ；或 V309 的位置处包 含至少一个氨基酸取代。
7.权利要求5所述的肽，其与SEQID NO: 1相比在对应于FoL残基D291E ； L294A ； E295T, S ； K297R ； L298A ； N299D, E ； Y301W ； D305A ； K306R ； Y308E, D ；或V309I，N，Q处包含至少一个氨基酸取代。
8.编码权利要求1-7任一项所述的肽的分离多核苷酸。
9.一种核酸构建体，其包含权利要求8的多核苷酸，所述多核苷酸可操作连接于至少 一个控制序列，其在表达宿主中引导所述肽的产生。
10.包含权利要求9的核酸构建体的重组表达载体。
11.包含权利要求9的核酸构建体或权利要求10的重组表达载体的重组宿主细胞。
12.—种制备权利要求1-7任一项所述的分离的肽的方法，包括下列步骤(a)在有益于所述肽产生的条件下培养包含所述核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构 建体包含编码所述肽至少一个拷贝的多核苷酸；和(b)回收所述肽。
13.权利要求1-7任一项所述的肽在将所述肽结合于脂肪酶时抑制所述脂肪酶酶活性 的用途。
14.包含权利要求1-7任一项所述的肽和脂肪酶的多肽，其中所述脂肪酶在平板测 定法中具有低于50PHLU/mg，低于45PHLU/mg，低于40PHLU/mg，低于35PHLU/mg，低于 30PHLU/mg，低于 25PHLU/mg，低于 20PHLU/mg，低于 15PHLU/mg，低于 lOPHLU/mg,低于5PHLU/mg或低于lPHLU/mg的磷脂酶活性，和/或不显示磷脂酶活性。
15.权利要求14的包含脂肪酶的多肽，所述脂肪酶与细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus) (SEQ ID NO 9)具有至少 70%，至少 75%，至少 80%，至少 85%，至少 90%,至少95%，至少97%或100%的同一性。
16.权利要求14-15任一项所述的多肽，其中所述脂肪酶包含至少一个改变，其独立 地为插入、缺失或取代。
17.权利要求16的多肽，其中所述脂肪酶的至少一个改变包含对应于细毛嗜热霉 (SEQ ID NO 9)的残基 E87R、I90L、G91T、I202P、R209L、E210I 或 T244L 的一个或 多个氨基酸取代。
18.权利要求15的多肽，其中所述脂肪酶包含用尖镰孢(Fusariumoxysporum) (SEQ ID NO 1)的残基246-254取代对应细毛嗜热霉(SEQ ID NO 9)的248-255的残基，或 用尖镰孢(SEQ ID NO 1)的残基247-252取代细毛嗜热霉(SEQ ID NO 9)的248-253。
19.一种具有磷脂酶抑制活性的多肽，其中具有α-螺旋的至少三个溶剂可接近的残 基位于其表面的蛋白质在该α-螺旋中对应于位置D3、L6、L10, Y13、V14, D17和X21的 至少一个所述溶剂可接近的残基处和/或对应于权利要求1的基序的位置E7、K9、Nn、 X18和Y2tl的边缘残基处经修饰。
20.权利要求19的多肽，其中所述亲本蛋白质具有与菌丝霉素(SEQID NO: 11)； 莫尼糖蛋白(SEQ IDNO 12) ； Protegrin (SEQ ID NO 13)；芽孢杆菌RNA酶(Bamase) (SEQ ID NO 14)；胱蛋白(SEQ ID NO 15)；或载脂蛋白 E (SEQ ID NO 16)具有至 少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%或100% 同一性的氨基酸序列。
21.制备权利要求14-18任一项所述的多肽的方法，包括将权利要求1-7任一项所述 的肽附加于脂肪酶的步骤，其中所述脂肪酶具有在平板测定法中低于50PHLU/mg，低于 45PHLU/mg,低于 40PHLU/mg，低于 35PHLU/mg，低于 30PHLU/mg，低于 25PHLU/ mg,低于 20PHLU/mg，低于 15PHLU/mg，低于 10PHLU/mg，低于 5PHLU/mg 或低于 lPHLU/mg的磷脂酶活性，和/或不显示任何磷脂酶活性。
22.—种制备多肽的方法，包括下述步骤(a)选择在蛋白质表面具有α-螺旋的蛋白质，由此所述α-螺旋的至少三个，至少 四个，至少五个或至少六个残基是溶剂可接近的；(b)将所述蛋白质的α-螺旋与权利要求1-7任一项所述的肽进行比对；(C)鉴定出所述蛋白质的α-螺旋上溶剂可接近的残基，其对应于权利要求1的所述 基序的位置 D3、L6、L1q、Y13、V14、D17 和 X21 ；(d)在步骤(c)中鉴定出的蛋白质中改变至少一个，至少两个，至少三个，至少四 个，至少五个，至少六个或至少七个氨基酸；(e)测试所述多肽的磷脂酶抑制活性；(f)选择具有磷脂酶抑制活性的多肽；和(g)产生(f)中选出的多肽。
23.权利要求22的方法，其还在步骤(C)中鉴定所述蛋白质的α-螺旋中的残基，其 潜在地为溶剂可接近的，对应于权利要求1的所述基序的位置E7、K9、N11 > X18和义。。
24.权利要求23的方法，其还包括在所述蛋白质中一个或多个位置进行至少一个改变 的步骤。
25.权利要求14-20任一项所述的多肽在将包含于所述多肽中的肽结合于脂肪酶时抑 制所述脂肪酶的酶活性的用途。
26.—种脂肪酶，其在平板测定法中具有低于50PHLU/mg，低于45PHLU/mg，低于 40PHLU/mg,低于 35PHLU/mg，低于 30PHLU/mg，低于 25PHLU/mg，低于 20PHLU/ mg，低于 15PHLU/mg，低于 10PHLU/mg，低于 5PHLU/mg 或低于 lPHLU/mg 的磷脂 酶活性，和/或不显示任何磷脂酶活性，其能够受权利要求1-7任一项所述的肽抑制，其 中所述脂肪酶包含至少一个改变，其独立地为插入、缺失或取代，由此所述脂肪酶的活 性在结合(a)权利要求1-8任一项所述的具有磷脂酶抑制活性的分离的肽；或(b)权利要 求15-21任一项所述的包含于所述多肽中具有磷脂酶抑制活性的肽至少之一时受抑制。
27.权利要求26的脂肪酶，其中所述脂肪酶与细毛嗜热霉(SEQID NO: 9)具有至少 70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%或100%的同 一性。
28.权利要求27的脂肪酶，其中至少一个改变是对应于细毛嗜热霉(SEQID NO: 9) 的残基 L92 ； R96 ； L203 ； 1207 ； R211 ； L243 ； L250 ；或 L252 的取代。
29.权利要求28的脂肪酶，其中所述至少一个改变是对应于细毛嗜热霉(SEQID NO: 9)的残基 L92D，E, W ； R96E, D, A ； L203W, K, M ； I207D, E ； R211H ； L243W, KL250D, E, R 和 L252S，T 的取代。
全文摘要
本发明提供了来自具有磷脂酶抑制活性的脂肪酶的C-端肽，包含磷脂酶抑制活性的多肽和能够受包含磷脂酶抑制活性的分离的肽和/或多肽抑制的脂肪酶。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，以及产生并使用具有脂肪酶抑制活性的肽和多肽的方法。
文档编号C07K14/37GK102016042SQ200980115692
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者伦纳多·D·玛利亚, 克里斯琴·I·乔尔根森, 李明, 杰斯珀·文德, 汤姆·A·B·尼尔森, 金·博尔奇 申请人:诺维信公司