专利名称：人源化抗人干扰素-α抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗人干扰素α (IFN-α)的人源化抗体及其在治疗或预防人类患者的 多种疾病和紊乱中的应用。
背景技术：
基于许多不同的研究，干扰素a (IFN-a)是据信与大量自身免疫病有关的细胞 因子。尽管系统性红斑狼疮(SLE)患者通常没有可检测到的血清IFN-a水平，他们似乎具 有清楚的IFN-a基因标签。另外，通过用SLE患者血清处理DC诱导树突细胞(DC)成熟可 以被抗-IFN-α抗体抑制。也已证明具有SLE表型的新西兰黑(NZB)鼠中IFN-a/β受体 的敲除导致接近正常的表型(Santiago-Raber 等人·，J Exp Med. 2003 ； 197 (6) 777-88)。因此提示抗IFN-α抗体可以作为中和该细胞因子的活性的工具，单独或联合地 用于治疗这些自身免疫病。识别宽范围的不同IFN-a亚型的特异性鼠抗体(AC0-1至 AC0-6)如作为W020060086586公布的国际专利申请所述产生和表征。但是，鼠抗体不适合 用于人类，因为它们具有免疫原性，因此希望产生其中将鼠CDR移植到人支架抗体上的人 源化抗体。但是，人源化抗体与鼠亲本抗体相比通常具有功能缺陷，例如，较低的亲和力和 /或稳定性和/或不希望的免疫原性。人源化抗体的这些缺陷在有些情况下可能通过进行 一个或几个回复点突变来补偿。通常希望不进行或只进行极少的回复点突变，因为太多回 复突变的百分比倾向于导致不希望的低稳定性和/或不希望的程度的免疫原性。因此希望 提供具有希望的生物学性质如保持人源化抗-IFN-α抗体对大量IFN-α亚型的亲和力和 效价的安全且稳定的人源化抗-IFN-α抗体。因此本领域需要在例如稳定性、特异性、安全性、免疫原性等特征方面具有理想的 特征的人源化抗-IFN-α抗体。此外，本领域也需要有效的生产这样的抗体的方法。
发明内容
第一方面，本发明涉及特异性结合人干扰素-a (IFN-a)的人源化抗体或其抗 原结合片段，该人源化抗体是鼠抗体AC0-1或AC0-2或其组合的人源化形式，包含比根据 Kabat的鼠互补决定区(CDR)更少的供体氨基酸残基。另一方面，本发明进一步涉及特异性结合IFN-α的人源化抗体或其抗原结合片 段，其中所述抗体能够结合IFN-a亚型A、2、B2、C、F、G、H2、I、Jl、K、4a、4b和WA，但不结合 亚型1或D，并且其中所述抗体包含比根据Kabat的非人CDR更少的供体氨基酸残基。本发明进一步涉及获得这样的抗体的方法以及这样的抗体在治疗目的方面的应 用和包含这样的抗体的组合物。本发明的抗体可能适用于治疗各种炎性疾病。
图1显示显示用于人源化(hz =人源化的)的鼠AC0-1VH㈧和VL⑶序列的分析，其中遮罩(mask)以阴影文本显示，Kabat⑶R以粗体显示，小鼠序列与人种系序列的差 异以下划线文本显示，潜在的体细胞超突变残基以下划线粗体文本显示，潜在的回复突变 残基以阴影下划线文本显示。AC0-1VH = SEQ ID NO 1 ；人种系VH1_46/JH4 = SEQ IDNO 2 ；hzACO-lVH = SEQ ID NO 3 ；AC0-1VL = SEQ ID NO 4 ；人种系 VKIII_L6/JK2 = SEQ ID NO 5 ；hzACO-lVL = SEQ ID NO :6。图2显示AC0-1和AC0-2VH(A)和VL(B)序列之间的比对，以及相应的小鼠种系序 列。AC0-2VH = SEQ ID NO 7 ；小鼠种系 J558. 33/D_/JH3_l = SEQ ID NO 8 ；AC0-2VL = SEQ ID NO 9 ；小鼠种系 ae4/JK4_l = SEQ ID NO :10。图3显示为引入hzACO-1内而选择的AC0-2残基的位置。图4显示在CPE试验中除对IFN- α D和IFN- α 1以外，hzACO-Ι对检测的所有干 扰素亚型的保护效果的抑制。图5显示通过报道基因(RG)分析，hzACO-Ι对12个IFN- α种的抑制。将每个抗 体浓度值标准化，并计算4次重复的平均值。数据表示为平均值+/_标准误差。采用 软件计算最佳拟合S形反应曲线。所有数据集的R2值均高于0. 98 (除了未进行曲线拟合 的IFN- α D以夕卜)ο图 6 显示使用 IFN- α A(A)或 IFN- α F (B)，hzACO-Ι 与具有 AC0-2-衍生突变 A93V 的hzACO-Ι变体的RG分析比较。数据计算如图5所述进行。图7显示在不含添加剂的情况下，hzACO-Ι和变体在pH 3. 5 (A)、4. 5 (B)和5. 5 (C)
时的转变温度。图8显示通过X-射线结晶学确定的与0^-0 8结合的1!^0)-明油片段链(H，L) 的结构。图 9 显示对于 IFNARl 和 IFNAR2 的 IFN- α 8 结合表位(Quadt-Akabayov S. R.等 人.Protein Sci. 15，2656-2668，2006 和 RoismanL. C 等人.J. Mol. Biol. 353，271-281， 2005)，如IFN-α 8序列下方的彩色方框所示。灰色方框所示的残基在所有IFN-α亚型之 间部分保守，而黑色方框所示的残基完全保守。采用4人距离截值，IFN-α 8上的hzACO-1 结合表位以IFN-a 8氨基酸序列上方的“*”表示。图10显示小鼠ACO-ImAb与hzAC0_l及其两种变体在RG分析中的比较。一种变体 是携带完整CDRH2的人源化AC0-1 (命名为hzACO-l-kabat CDRH2)，而hzAC0_l如实施例2 所述用较短的CDRH2构建。另外，该图显示另外一种为与IFN-α s(hzAC0-lY32E，T30R)相 互作用而通过合理的设计优化的突变hzACO-Ι。如图所示，在抑制5种不同的代表性IFN- α 亚型方面比较这四种重组mAb变体。图11显示以人IgGl、IgG2和IgG4同种型表达的hzAC0_l的蛋白质稳定性研究。 在组氨酸缓冲液中孵育5周后通过HPLC测定聚集。图12显示51Cr释放试验，说明hzAC0_lIgG4、IFN- α及其不同组合在不同效应细 胞靶细胞比值(Ε Τ)下缺乏ADCC。细胞+单独的PBMC而没有IFN-α pr hzAC0_l确定 背景裂解，而Triton-X 100显示了最大裂解。包括Rituxan作为阳性对照，其在所有E T 比时均诱导可检测的细胞裂解。图13显示通过ELISA进行的补体结合研究。表达为IgG4的hzAC0_l当结合到 IFN-α时不能固定补体。作为阳性对照，hzACO-Ι与抗-IgG4pAb交叉结合，并且检测到清楚的C4与抗-IgG4的剂量依赖性结合。发明详述本发明部分基于具有适合治疗人类患者的性质的抗-IFN-α抗体，所述患者患有 IFN-α -相关病症或疾病，例如，狼疮疾病或紊乱，例如，SLE ；移植物抗宿主病；1型糖尿病， AIDS,自身免疫性甲状腺炎，牛皮癣，幼年型皮肌炎和舍格伦综合征。这些抗体一般基于鼠 AC0-1和/或AC0-2抗体的人源化形式。已经确定AC0-1和AC0-2能够阻断13种重组IFN- α亚型以及病毒感染后产生的 2种IFN-复杂混合物的生物活性(参见W02006086586)。AC0-1和AC0-2也一致地阻断来 自经微阵列分析确定为表现出IFN-α特征的SLE患者的血清的生物活性。AC0-1和AC0-2 不明显中和IFN- α蛋白质亚型D和1的生物活性，但是中和SLE血清的IFN- α生物活性。 尽管不限于理论，因此可能亚型D和1与SLE的病因学无明显相关性。如实施例所述，可变区的结构模建揭示了可以使用比Kabat CDR更少的供体(鼠) 残基对AC0-1和AC0-2进行人源化，从而进一步降低了人类患者中不利免疫应答的风险。该 分析也确定了回复突变的有利位点。进一步发现，可能是由于AC0-1和AC0-2可变区之间 的高序列相似性(仅有13个位点不同)，人源化ACO-l(hzACO-l)序列中的某些氨基酸残基 可以在相应的位置被AC0-2残基代替。在CDR区内，可以在不使该抗体序列少于人类的情 况下正常地进行突变。这种人源化程序导致人源化抗体具有提高的功能性质，如亲和力、稳 定性、表达水平和IFN- α -抑制活性。在人源化AC0-1抗体中，hzAC0-lVH(SEQ ID NO :3)中示例性的突变包括V5Q、 T28S、M69L、R71V、T73K、S76I、S76N、T77I、V78A、Y79F 和 A93V 及其任意组合，采用 Kabat 编 号。hzAC0-lVL(SEQ IDNO 6)中的示例性的突变包括 E1Q、D^G、L33F、L47W、S50G、I58V 和 F71Y及其任意组合。在一个实施方案中，hzACO-lVH区包含选自D8S、N31S和A93V的突 变。在另一实施方案中，hzACO-lVH区包含选自D8S、N31S和A93V的突变，及其任意组合， 例如，T28S和N31S、T28S和A93V,以及N31S和A93V。在另一实施方案中，hzACO-lVH区包 含选自T28S、N31S和A93V的突变，或其组合，例如，T28S和N31S、T28S和A93V,或N31S和 A93V ；以及至少一个额外的突变。定义为了更好地理解本发明，正面定义了许多术语。“AC0-1禾口 AC0-2抗体”在W020060086586中表征和描述。AC0-1以ATCC登录号 PTA-6557 (W02006086586)保藏，AC0-2 以 ATCC 登录号 PTA-7778 (W02008021976)保藏。本 发明的抗体是AC0-1和AC0-2的人源化变体。但是，本发明的AC0-1和AC0-2的人源化形 式不包含全长鼠Kabat序列。在优选的实施方案中，至少一个⑶R序列包含大约3-10个氨 基酸、优选3-8个、更优选4-7个氨基酸的截短。该抗体优选地在CDR H2中包含截短，所述 ⑶R H2优选地截短3-10个，优选3-8个，更优选4_7个，最优选6个氨基酸。此外，确定偶 然的点突变可引入一个或多个⑶R序列以及人支架抗体内。然而，术语“AC0-1和AC0-2抗 体”还可包括任何能够结合IFN-α亚型4、2、82、(4、6、!12、1、1、1(、43、413和14但不结合 亚型1或D的IFN-α抗体。但是应当理解，AC0-1和AC0-2因此可以视为只是一种抗体， 因为其CDR序列的差异只有几个氨基酸。似乎AC0-1和AC0-2代表同一抗体的体内体细胞 超突变的两个阶段。本发明的AC0-1/AC0-2抗体因此是包含⑶R序列的人源化抗体，该⑶R序列具有与AC0-1和AC0-2的⑶R序列至少90%的同一性，更优选为至少92%，最优选为 至少95%。术语“⑶R截短”、“ ιΗ向突变”和“⑶R的缩短”在整个文件中可以互换使用。对于 本发明，这些术语通常是指⑶R-截短可以视为一行大量正向突变的事实——意味着缩短的 鼠CDR片段可以移植到人构架上。较短CDR的移植倾向于产生免疫原性程度降低的抗体并 不令人惊讶，实际上令人惊讶的是人源化抗体的其它有利特征可以得到保留，例如稳定性、 特异性等。“回复突变”总是指构架中的突变(即，不是在CDR中)，回复突变一般是在选择 的位点引入一个或多个“鼠”氨基酸残基，例如为了稳定化抗体结构。此处使用的术语“干扰素α ” (IFN-α)是指包括先天免疫性的一些主要效应物的 蛋白质家族。人IFN-a有至少15个已知的亚型。IFN-a蛋白质亚型的名称和相应的编码 基因列于下面的表1中。表lIFN-α蛋白质亚型和基因
权利要求
1.一种人源化抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人干扰素-α (IFN-α)，该人源 化抗体为鼠抗体AC0-1或AC0-2或其组合的人源化形式，包含比根据Kabat的鼠互补决定 区(CD 更少的供体氨基酸残基。
2.一种特异性结合IFN-α的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能够结合 IFN-α亚型六、2、82、(、？、6、拟、1、1、1(、4￡1、413和骱，而不结合亚型1或D，并且其中所述 抗体包含比根据Kabat的非人CDR更少的供体氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2中的任一项所述的抗体，其中所述CDRΗ2供体残基包含Kabat 残基50-59。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体，其中所述抗体竞争和/或结合IFN-α亚 型上与AC0-1和/或AC0-2抗体所竞争和/或结合的相同的表位。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG4亚型。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含根据SEQID N0:21的 CDR H2序列。
7.—种生产根据权利要求1-6中任一项所述的抗体的方法，其中所述方法包括在适当 的条件下孵育编码所述抗体的宿主细胞，然后分离所述抗体。
8.通过权利要求7的方法获得的抗体。
9.包含根据权利要求1-6和8中的任一项所述的抗体的组合物。
10.一种制备权利要求9的组合物的方法，其中所述方法包括混合抗体或其片段与赋 形剂。
11.可通过权利要求9的方法获得的组合物。
12.一种预防、控制、治疗或改善IFN-α相关炎性疾病或紊乱的方法，所述方法包括给 需要的受试者施用预防或治疗有效量的根据权利要求1-6和8中的任一项所述的抗体。
13.根据权利要求1-6和8中的任一项所述的抗体在制备适合用于治疗炎性疾病的药 物中的用途。
全文摘要
本发明提供可用于人类治疗应用的人源化抗人IFN-α单克隆抗体。优选的抗体是鼠抗体ACO-1和ACO-2的人源化形式及其变体。
文档编号C07K16/24GK102083859SQ200980116496
公开日2011年6月1日 申请日期2009年5月6日 优先权日2008年5月7日
发明者B·奥尔森克罗格, B·弗莱德里施森, I·路德佩德森, J·菲勒克纳, L·A·斯文森, S·帕德克杰尔 申请人:阿哥斯医疗公司