基于纤连蛋白的多价支架结构域蛋白的制作方法

专利名称：基于纤连蛋白的多价支架结构域蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及供诊断、研究和治疗应用中使用的多价的基于纤连蛋白的支架结构 域。本发明进一步涉及包含此类蛋白质的细胞、编码此类蛋白质或其片段的多核苷酸、及包 含编码该创新蛋白质的多核苷酸的载体。
背景技术：
基于纤连蛋白的支架是一个能够演化而结合任何感兴趣化合物的蛋白质家族。这 些蛋白质(一般利用自纤连蛋白III型0 或而3样结构域衍生的支架)以天然或工程 抗体(即多克隆、单克隆、或单链抗体)特征性的方式发挥功能，而且还具备结构优点。具 体而言，这些抗体模拟物的结构被设计以实现最佳折叠、稳定性、和溶解度，甚至在正常情 况下导致抗体结构和功能丢失的条件下亦是如此。基于纤连蛋白的支架蛋白的一个例子是 Adnectins (Adnexus, 一家 Bristol-Myers Squibb 石if发公司)。纤连蛋白是一种在细胞外基质的形成和细胞-细胞相互作用中发挥至关重要作 用的大型蛋白质；它由三类(I型、II型、和III型)小型结构域的许多重复组成(Baron et al.，1991)。Fn3自身是一个大型亚家族的范式，该亚家族包括细胞粘附分子、细胞表面 激素和细胞因子受体、伴侣蛋白(chaperoning)、和碳水化合物结合域的一部分。综述参见 Bork&DooIittle,Proc Natl Acad Sci USA. 19920ct 1 ；89(19) :8990-4 ；Bork et al. ,J Mol Biol.1994 Sep 30 ；242 (4) :309-20 ；Campbell&Spitzfaden, Structure. 1994May 15; 2(5) :333-7 ；Harpez&Chothia, J Mol Biol. 1994May 13 ；238 (4) :528-39)。纤连蛋白III型0^3)结构域包含(N端至C端的次序)β或β样链Α、环ΑΒ、β 或β样链B、环BC、β或β样链C、环CD、β或β样链D、环DE、β或β样链Ε、环EF、β 或β样链F、环TO、和β或β样链G。任何或所有环AB、BC、CD、DE、EF和re可参与靶物 结合。BC、DE、和TO环在结构和功能上都与来自免疫球蛋白的互补决定区(OTR)类似。美 国专利No. 7，115，396记载了这样的而3结构域蛋白质，其中通过对BC、DE、和TO环的改变 获得了高亲和力TNFa结合物。美国专利申请公开No. 2007/01481 记载了这样的而3结 构域蛋白质，其中通过对BC、DEJP TO环的改变获得了高亲和力的VEGFR2结合物。为治疗和诊断目的获得改良的纤连蛋白结构域支架蛋白会是有利的。本公开内容 提供这样的改良的蛋白质。发明概述本申请的一个方面提供多价多肽，其包含N端结构域和C端结构域，该N端结构 域包含以小于500nM的Kd结合第一靶物分子的第一纤连蛋白III型第10结构域(kiFM)， 该C端结构域包含以小于500nM的Kd结合第二靶物分子的第二 ’113。在一些实施方案中，第一和第二 1(1而3结构域是藉由多肽接头连接的，所述多肽接头诸如例如具有1-100、1_50、 1-20、1-10、5-50、5-20、5-10、10-50、或10-20个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，第一和 第二 1(1而3结构域是藉由选自基于甘氨酸-丝氨酸的接头，诸如SEQ ID N0:21和22的多 肽连接的。在一些实施方案中，第一和第二 1(1而3结构域是藉由SEQ ID N0:20所示的多肽 连接的。在一些实施方案中，第一和第二 结构域是藉由选自基于甘氨酸-脯氨酸的接 头，诸如SEQ ID N0:32、33、和34的多肽连接的。在一些实施方案中，第一和第二 1(^n3结 构域是藉由选自基于脯氨酸-丙氨酸的接头，诸如SEQ ID N0:60、61和62的多肽连接的。每个"lFr^结构域包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG，而且每个°Fn3结 构域独立地在选自环BC、DE和TO中的至少一个环中具有相对于人呷113结构域的相应环的 序列发生了改变的氨基酸序列。每个所述结构域包含与SEQ ID NO :1所示的天然存 在人uiFr^结构域至少50、60、70、或80%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一 ’113结构域以小于IOOnM的Kd结合第一靶物分子，而且 第二 kiFM结构域以小于IOOnM的Kd结合第二靶物分子。在一些实施方案中，第一靶物分 子和第二靶物分子是相同的。在一些实施方案中，第一靶物分子和第二靶物分子是不同的。 在一些实施方案中，第一靶物分子是IGF-IR，而且第二靶物分子是VEGFR2。在一些实施方 案中，第一靶物分子是VEGFR2，而且第二靶物分子是IGF-IR。在一些实施方案中，kiFM结构域的至少两个环发生了改变。在一些实施方案中， 环BC和环TO具有相对于人kiFi^结构域的相应环的序列发生了改变的氨基酸序列。在一 些实施方案中，1(1而3结构域的至少三个环发生了改变。在一些实施方案中，kiFM结构域的 至少两个环结合靶物分子。在一些实施方案中，kiFM结构域的三个环结合靶物分子。在一些实施方案中，第一和/或第二 1(1而3结构域在其C端连接至选自SEQID NO 17、18、19、50、51、52、71 或 72 或 E、EI、EID、ES、EC、EGS、或 EGC 的氨基酸序列。在一些实 施方案中，第一 uiFr^结构域在其C端连接至氨基酸序列SEQ ID NO :19或50、或Ε、EI、或 EID0在一些实施方案中，第二 结构域在其C端连接至氨基酸序列SEQ ID NO :17,18, 51、52、71 或 72。在一些实施方案中，提供包含与SEQ ID NO :8-15 J9-31和63-70中的任一序列至 少70、80、90、95、或100%相同的氨基酸序列的多价多肽。在一些实施方案中，多价多肽还包含一个或多个选自下述各项的药动学(PK)模 块聚氧化烯模块、人血清白蛋白结合蛋白质、唾液酸、人血清白蛋白、运铁蛋白、IgG、IgG 结合蛋白、和Fc片段。在一些实施方案中，Hi模块是聚氧化烯模块且所述聚氧化烯模块是 聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG模块经Cys或Lys氨基酸共价连接于多价多肽。 在一些实施方案中，PEG介于约0. 5kDa和约IOOkDa之间。在一些实施方案中，1 模块改善多肽的一项或多项药动学特性，例如生物利用度、 血清半衰期、体内稳定性、和药物分布。在一些实施方案中，相对于单独的多价多肽，I3K模块 将多价多肽的血清半衰期延长至少 20、30、40、50、70、90、100、120、150、200、400、600、800% 或更多。在一些实施方案中，所述进一步包含Hi模块的多价多肽具有至少1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、或14天的血清体内半衰期。在一些实施方案中，1 模块和1(1而3结构域是藉由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚 合糖(polymeric sugar)、或聚乙二醇模块连接的。在一些实施方案中，I3K模块和结
5构域是藉由包含氨基酸序列SEQ ID NO :17，18，或20的多肽连接的。在一些实施方案中，多价多肽进一步包含结合模块。在一些实施方案中，多价多 肽进一步包含抗体模块。在一些实施方案中，抗体模块小于50KDa。在一些实施方案中，抗 体模块小于40KDa。在一些实施方案中，抗体模块是单链Fv(ScFv)、Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2、二硫化物连接的Fv(SdFv)、Fv、双抗体、或完整抗体。在一些实施方案中，抗体 模块是单域抗体。在一些实施方案中，抗体模块结合人蛋白质。在一些实施方案中，抗体 模块结合 IGF-IR、FGFRU FGFR2、FGFR3、FGFR4、c_Kit、人 pl85 受体样酪氨酸激酶、HER2、 HER3、c-Met、叶酸受体、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管内皮生长因子(VEGF) A、 VEGF C, VEGF D、人 CD20、人 CD18、人 CDlla、人凋亡受体-2 (Apo_2)、人 α 4β 7 整联蛋白、人 GPIIb-IIIa整联蛋白、干细胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些实施方案中，多价多肽进一步包含脂笼蛋白衍生物、四连蛋白衍生物、 avimer、或锚蛋白衍生物。在一些实施方案中，多价多肽结合人蛋白质。在一些实施方案 中，多价多肽结合IGF-IR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Kit、Apl85受体样酪氨酸激酶、 HER2、HER3、c-Met、叶酸受体、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管内皮生长因子(VEGF) A、VEGF C, VEGF D、人 CD20、人 CD18、人 CDlla、人凋亡受体-2 (Apo_2)、人 α 4β 7 整联蛋白、 人GPIIb-IIIa整联蛋白、干细胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些实施方案中，多价多肽进一步包含藉由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合 糖、或聚乙二醇模块(PEG)连接的结合模块。在一些实施方案中，PEG介于约0.5kDa和约 IOOkDa之间。在一些实施方案中，PEG是藉由Cys或Lys残基缀合于多肽和结合模块的。在一个方面，本申请提供经过去免疫化(deimmunized)以消除一个或多个T细胞 表位的多价多肽。在一个方面，本申请提供经过去免疫化以消除一个或多个B细胞表位的 多价多肽。在一个方面，本申请提供一种多价多肽，其中1(1而3结构域是通过包括下述步骤 的方法选择的a)生成一群候选核酸分子，每个核酸分子包含与人而3结构域编码序列不 同的候选纤连蛋白III型(1(1而3)结构域序列，所述核酸分子各自包含可操作连接至所述 候选wFM结构域编码序列的翻译起始序列和起始密码子且各自在3'末端可操作连接于 核酸-嘌呤霉素接头；b)在体外翻译所述候选kiFM结构域编码序列以生成一群候选核 酸」°Fn3融合物；c)使所述一群候选核酸」°Fn3融合物与靶物分子接触；并d)选择这样的 核酸」°Fn3融合物，其蛋白质部分对靶物分子的结合亲和力或特异性相对于所述人1(1而3对 靶物分子的结合亲和力或特异性有所改变。在一些实施方案中，对于所选择的核酸」°Fn3 融合物通过下述方式加以进一步优化改变一个或多个核酸残基并再次用靶物分子筛选融 合物以选择改良的结合物(improved binders) 0在一些实施方案中，候选核酸分子是RNA。 在一些实施方案中，候选核酸分子是DNA。在一个方面，本申请提供包含多价多肽的药学可接受组合物。在一些实施方案中， 组合物基本上不含内毒素。在一些实施方案中，组合物基本上没有微生物污染，使之适合于 体内施用。组合物可配制成例如供IV、IP或皮下施用。在另一个方面，本申请提供编码本文所述多价多肽的核酸。还包括包含此类蛋白 质的多核苷酸的载体。合适的载体包括例如表达载体。本申请的又一个方面提供包含编码 多价多肽的多核苷酸、载体或表达载体的细胞。序列优选经过优化以使在所使用的细胞类型中的表达最大化。优选的是在大肠杆菌中表达。也可以在例如真核微生物(包括酵母，例 如毕赤氏酵母(Pichia)或酿酒酵母(cervaisea))或蓝绿藻中表达多价多肽。可以改造酵 母细胞以产生期望的糖基化。本发明的细胞可以是哺乳动物细胞。在一个方面，可以改造 哺乳动物细胞以产生期望的糖基化。在一个方面，细胞表达基于纤连蛋白的支架蛋白。在 一个方面，编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核苷酸经过密码子优化以便于在所选择的细 胞类型中表达。还提供了用于生产本文所述多价多肽的方法，包括培养包含编码多价多肽 的核酸、包含所述核酸的载体、或表达载体的宿主细胞并自培养物回收所表达的多价多肽。附图简述

图1.各种HTPP纯化的基于VAkiFI^的结合物展现相似的表达谱。如所示 的‘GS5' (SEQ ID NO 21)禾口' GSlO' (SEQ ID NO :22)。图2. HTPP纯化的构建物385A08-Fn-V2B的SEC表现出主要是单体蛋白。图3HTPP纯化的构建物V2B-Fn-385A08的SEC表现出单体和二聚体蛋白的混合 物。图4某些基于V/I 10Fn3的结合物的通过LC-MS测量的分子量和DSC Tm测定。如 所示的‘GSlO' (SEQ ID N0:22)。图5385A08-Fn-V2B-cys(PEG化，无his标签)的SEC展现出此蛋白质95. 1 %是单体。图6385A08-Fn-V2B-cys (PEG化，无his标签)DSC分析展现出该蛋白质在56°C解 折叠一半，而且直到45°C没有检测到解折叠。图7给药40kD分支PEG化型或线性PEG化型构建物385A08-Fn-V2B_Cys的小鼠 展现出半衰期为14. 6小时(分支的)和10. 5小时(线性的)。给数只小鼠给药分支的或 线性的PEG化型构建物，如图中所指示的。图8VEGFR2/IGF-IR串联物(tandem)在细胞中与单独的VEGFR2或IGF4R结合物 等效(equipotent)。用Biacore测定法测定构建物对IGF-IR的结合，并用Ba/F3和诎41 测定法测定IC50(见实施例5和7)。实施例1中描述了所述的分子形式的序列。如所示 的‘GS5' (SEQ ID NO 21)禾口' GSlO' (SEQ IDNO 22)。图9评估某些基于V/I 10Fn3的结合物对IGF4R和VEGFR2的动力学行为。如所 示的‘GSlO' (SEQ ID NO 22)。图10评估有his标签和无his标签型的PEG化构建物385A08-Fn-V2B_cys对 IGF4R和VEGFR2的动力学行为。图 11 在细胞系四3 =KDR 上评估 Peg_V2BShort 和 385A08-Fn-V2B_cys (有 PEG 和 his标签)与经标记的Peg-V2BShort竞争细胞结合的VEGFR-2的相对能力。图 12 在细胞系 R+ 上评估 AT580-PEG40 和 385A08-Fn-V2B_cys (有 PEG 和 his 标 签)与经标记AT580-PEG20-AT580竞争细胞结合的IGF-IR的相对能力。图13。在基于细胞的测定法Μι41和HMVEC-L中评估基于V/I 10Fn3的结合物。如 所示的‘GS5' (SEQ ID NO 21)和'GSlO' (SEQ ID NO :22)。图14。对选定的构建物(包括有his标签和无his标签的PEG化构建物 385A98-Fn-V2B-Cys)评估它们在基于细胞的测定法NCI_H^9和Ba/F3中的活性，与对照比 较。
图15。HEK293/KDR和PAE/KDR细胞表达VEGFR2和IGF-IR，而且这两种受体在它 们的关联配体存在下活化。用VEGF、IGF1、或这两种因子(VEGF/IGF1)刺激经KDR(VEGFR2) 转染的HEK293和PAE细胞。对细胞溶胞物的^festern印迹探查磷酸化VEGFR(p_Flk_l/ Tyr996)、磷酸化IGF-IR、磷酸化Akt、磷酸化MAPK、或总肌动蛋白。图16。基于纤连蛋白的支架多聚体阻断VEGFR2和IGF-IR配体诱导的磷酸化 且抑制HEK293/KDR细胞增殖。如实施例8中所述用VEGF和IGFl (“指示不刺激的 对照)及纤连蛋白支架结构域蛋白处理细胞。对细胞溶胞物的Western印迹探查磷酸化 VEGFR(p-Flk-l/Tyr996)、总 VEGFR(Flk-I)、磷酸化 IGF-IR、总 IGF-IR、磷酸化 Akt、总 Akt、 磷酸化MAPK、总MAPK、或总肌动蛋白。暴露于各种构建物后通过[3H]-胸苷掺入评估细胞增 殖，而且以 IC5tl 报告结果。如所示的‘GS5' (SEQ ID NO 21)和'GSlO' (SEQ ID NO 22)。图17。基于纤连蛋白的支架多聚体阻断VEGFR2和IGF-IR配体诱导的磷酸化 且抑制HEK293/KDR细胞增殖。如实施例8中所述用VEGF和IGFl及纤连蛋白支架结构 域蛋白处理细胞。对细胞溶胞物的Western印迹探查磷酸化VEGFR(p Flk_l/Tyr996)、总 VEGFR(Flk-I)、磷酸化IGF-IR、总IGF-IR、磷酸化Akt、总Akt、磷酸化MAPK、总MAPK、或总肌 动蛋白。暴露于各种构建物后通过[3H]-胸苷掺入评估细胞增殖，结果作为IC5tl报告。如 所示的‘GS5' (SEQ ID NO 21)和'GSlO' (SEQ ID NO :22)。图18。细胞增殖测定法暴露72小时后HMVEC细胞中各种基于VAwFr^的结合 物的效果。图19。Western印迹分析将HMVEC-L细胞暴露于渐增浓度的各种构建物1小时， 接着用VEGF/IGF-1配体(二者终浓度均为50ng/ml)于37°C活化10分钟，之后溶胞。通过 在相对于用作加载对照的GAPDH标准化之后比较未处理的对经处理的样品中磷酸信号的 比来测量对pIGF-lR、pAkt、和pMAPK活性的抑制。图20。Western印迹分析将他41细胞暴露于渐增浓度的化合物1小时，接着用 IGF-I配体(50ng/ml)于37°C活化10分钟，之后溶胞。通过在相对于用作加载对照的GAPDH 标准化之后比较未处理的对处理的样品中磷酸信号的比来测量对PlGF-IR和pAkt活性的 抑制。图21。暴露1小时后各种构建物对HMVEC-L细胞中钙释放的影响。将细胞在EBM 培养基中血清饥饿过夜，然后在渐增量的各种构建物存在下温育1小时。用50ng/ml VEGF 配体刺激细胞。添加配体后60秒测量Ca2+通量。图22。PEG化的、有his标签的385A08-Fn-V2B_cys在RH-41肿瘤异种移植物模 型中在单剂量水平的抗肿瘤活性。Ajx周χ 3方案后的生长曲线。B.百分比生长抑制图， 证明了在一个TVDT内与溶媒处理组相比大于50%的TGI。(▼)指示的是给药方案。图23。PEG化的、有his标签的385A08-Fn-V2B_cys在RH-41肿瘤异种移植物模 型中在多剂量水平的抗肿瘤活性。A、B、C、和D中列出每种药剂的制定剂量水平。(▼)指示 给药方案。图M。PEG化的、有his标签的385A08-Fn-V2B-cys在A549肿瘤异种移植物肺模 型中在多剂量水平的抗肿瘤活性。A和C中显示指定剂量水平，B和D中显示相应的％TGI。 (▼)指示给药方案。
图25。PEG化的、有his标签的385A08-Fn-V2B_cys在GEO肿瘤异种移植物结肠 模型中在多剂量水平的抗肿瘤活性。A和C中显示指定剂量水平，B和D中显示相应的％ TGL· (▼)指示给药方案。图26。A673尤因肉瘤异种移植物肿瘤中由PEG化的、有his标签的 385A08-Fn-V2B-cys 介导的肿瘤生长抑制与 mononectin PEG_V2B_short ( 一种 PEG 化的抗 VEGFR-2adnectin)可比较。图 27。385A08-Fn-V2B_cys (有 his)的药动学参数。图 28。385A08-Fn-V2B-cys (有 his)和 mVEGF-A 对携带 A673 肿瘤的裸鼠 IP 施用 20和200mg/kg后的拟合的与观察到的血浆浓度-时间图谱的对照。图四。385A08-Fn-V2B-cys (无his)和mVEGF-A对携带A673肿瘤的裸鼠IP施用 20和200mg/kg后的拟合的与观察到的血浆浓度-时间图谱的对照。图 30。猴中 385A08-Fn-V2B_cys (有 his)的药动学参数。图 31。385A08-Fn-V2B-cys (有 his)和 hVEGF-A 对猴 IV 施用 3 和 30mg/kg 后的 拟合的与观察到的血浆浓度-时间图谱的对照。图32。猴中385A08-Fn-V2B_cys (无his标签)的药动学参数。图 33。385A08-Fn-V2B-cys (无 his)和 hVEGF-A 对猴 IV 施用 3mg/kg (第 1 剂) 后的拟合的与观察到的血浆浓度-时间图谱的对照。发明详述定义“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何序列，无论长度、翻译后修饰、或功能。“多 肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用。多肽可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，诸 如美国专利No. 6，559,1 (通过述及收入本文)中披露的那些。还可以以多种标准化学方 式中任一方式修饰多肽(例如可以用保护基团修饰氨基酸；可以将羧基末端氨基酸变成末 端酰胺基团；可以用基团修饰氨基末端残基以例如增强亲脂性；或者，可以化学糖基化或 以其它方式修饰多肽以提高稳定性或延长体内半衰期)。多肽修饰可包括将另一结构(诸 如环状化合物或其它分子)搭接到多肽上，而且还可包括包含一个或多个构型发生了改变 的(例如R或S ；或者L或D)的氨基酸的多肽。术语“PK”与“药动学”同义，涵盖化合物包括例如下列在内的特性受试者对 它的吸收、分布、代谢、和清除。“Hi调控蛋白”或“Hi模块”指任何在与生物学活性分子 融合或一起施用时可影响生物学活性分子的药动学特性的蛋白质、肽、或模块。1 调控 蛋白或Hi模块的例子包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合物(如美国专利申请公开文本 No. 2005(^87153和20070003M9中所公开的)、人血清白蛋白、Fc或Fc片段、和糖(例如 唾液酸)。“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的至少一项“效应器功能”。例示性的“效应器 功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性(ADCC)、吞噬、细胞表面受体(例如B细胞受体(BCR))的下调等。此类效应器功能 一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合，而且可以使用本领域已知的用于评估此 类抗体效应器功能的各种测定法来加以评估。“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列同样的氨基酸序
9列。“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不 同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的!^c区相比具有至少 一处氨基酸替代，例如天然序列Fc区或区别多肽的Fc区中约1处至约10处氨基酸替代和 优选约1处至约5处氨基酸替代。本文中的变异Fc区会优选与天然序列Fc区和/或区别 多肽的Fc区具有至少约80%序列同一性和最优选至少约90%序列同一性、更优选至少约 95%序列同一性。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞介导的反应，其中表达 Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞、和巨噬细 胞)识别靶细胞上所结合的抗体并随后引起靶细胞的溶解。介导ADCC的主要细胞，即NK 细胞，只表达Fc γ RIII，而单核细胞表达Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII。为了评估感兴趣分 子的ADCC活性，可实施体外ADCC测定，诸如美国专利No. 5，500，362或5，821，337中所记 载的。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细 胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes 等，PNAS(USA)95 :652-656(1998)中所披露的。“百分比(％ )氨基酸序列同一性”在本文中定义为比对序列并在必要时引入缺口 以实现最大百分比序列同一性后，且在不将任何保守替代视为序列同一性的一部分的条件 下，候选序列中与所选择序列中的氨基酸残基同样的氨基酸的百分比。用于测定百分比氨 基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如使用公众可获得 的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技 术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需要 的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比较计 算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech公司创作的，已经 与用户文档一起提交给美国版权局(U. S. Copyright Office, Washington D. C.，20559)，登 记为美国版权注册号TXU510087，而且公众可通过Genentech公司(South San Francisco, Calif.)获得。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统、优选数字UNIX V4. OD上使用。 所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不再变化。就本文而言，给定氨基酸序列A对(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸 序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或针对 给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算100乘以分数X/Y，其中X是序 列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，且其中Y 是B中的氨基酸残基总数。应当理解的是，若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的 长度，则A对B的％氨基酸序列同一性会不等于B对A的％氨基酸序列同一性。“分离的”多肽指已经鉴定且与/自其天然环境的成分分开和/或回收的多肽。所 谓其天然环境的污染成分，是指会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、 和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选的实施方案中，多肽会被纯化(1)至超过 95% (以多肽的重量计，如通过Lowry法所测定的)和最优选超过99% (以重量计)；(2) 至足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端氨基酸序列或内部氨基酸序列 的程度，或( 至通过还原性或非还原性条件下SDS-PAGE并使用考马斯蓝或优选银染色显示均质。分离的多肽包括重组细胞内原位的多肽，这是因为其中不会存在多肽天然环境的 至少一种成分。然而，通常会通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。靶物还可以是所述靶物的片段。如此，靶物还是所述靶物的能够引发免疫应答的 片段。靶物还是所述靶物的能够结合针对全长靶物生成的单域抗体的片段。片段，在用于本文时，指序列的小于100% (例如99%、90%、80%、70%、60%、 50%,40%,30%,20%,10%^ )，但是包含 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、M、25或更多个氨基酸。片段的长度足以使感兴趣的相互作用维持IxKTfiM或 更好的亲和力。片段在用于本文时还指如下所述的一个或多个任选的氨基酸的插入、删除和替 代，所述插入、删除和替代基本上不改变该靶物与针对全长靶物生成的单域抗体结合的能 力。氨基酸插入、删除或替代的数目优选多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69或70个氨基酸。术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情 况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减 缓，优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)肿瘤转 移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状。 以药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞为限，药物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性 的。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展前时间(time to disease progression,TTP) 和/或测定响应率(response rate, RR)来测量体内功效。氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定义为多肽的血清浓度在体内降低 50% (例如由于序列或化合物的的降解和/或天然机制对序列或化合物清除或隔离)所花 费的时间。可以以本身已知的任何方式来测定半衰期，诸如通过药动学分析。合适的技术对 于本领域技术人员会是清楚的，而且例如一般包括下述步骤对灵长类动物适当施用合适 剂量的要处理的氨基酸序列或化合物；以规则时间间隔自所述灵长类动物收集血液样品或 其它样品；测定本发明的氨基酸序列或化合物在所述血液样品中的水平或浓度；并从如此 获得的数据(图)计算到本发明的氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药后的初始水平 相比降低50%时的时间。参考例如标准手册，诸如Kenneth，A等，Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists^PetersPharmacokinete analysis A Practical Approach(1996)。还可参考"Pharmacokinetics" ,M Gibaldi 禾口D Perron, Marcel Dekker 出版，第二修订版(1982)。半衰期可以使用诸如tl/2-α ,tl/2-β和曲线下面积(AUC)等参数来表述。在本 说明书中，“半衰期延长”指这些参数之任一项，如这些参数之任两项，或实质上所有这三项 参数的增大。“半衰期延长”尤其指tl/2-β的增大，同时有或无tl/2-α和/或AUC或二 者的增大。在用于本文时，术语“多价”指整合有两个或更多个生物学活性区段的重组分子。 形成多价分子的蛋白质片段任选可经由多肽接头连接，该多肽接头搭接各组成部分并容许 各组成部分独立发挥功能。
概览本申请提供包含两个或更多个基于纤连蛋白的支架蛋白，诸如而3结构域的多价 多肽。各而3结构域可结合相同靶物(从而提高效价并因此提高靶物结合亲合力)或不同 靶物(从而展现多种效应器功能)。美国专利No. 6，818，418记载了可共价或非共价连接的纤连蛋白支架多聚体。本 申请描述改良的多聚体，它们藉由多肽接头共价键合，从而容许多价多肽作为单一构建物 表达。本申请部分基于下述令人惊讶的发现，即藉由多肽接头连接的各而3结构域彼此独 立地正确折叠，保留高亲和力结合，而且每个结构域保留其功能特性。基于纤连蛋白的支架本申请的一个方面提供包含藉由多肽连接的至少两个而3结构域的多肽，其中每 个Fn3结构域结合靶物分子。每个Fn3结构域包含AB环、BC环、CD环、DE环、EF环、和FG 环。在一些实施方案中，而3结构域是自人纤连蛋白衍生的而3结构域，特别是纤连蛋 白的第十而3结构域(1(lFn3)，如SEQ ID N0:1中所示。已经报告了多种突变型1QFn3支架。 在一个方面，Asp 7, Glu 9、和Asp 23中的一个或多个被替换成另一种氨基酸，例如不带负 电荷的氨基酸残基(例如AsruLys、等)。已经报告了这些突变具有与野生型相比促进突变 型1(^η3在中性pH的更大稳定性的效果(参见PCT公开文本No. W002/04523)。已经公开 了 1QFn3支架中其他多种有益或中性的改变。参见例如Batori等，Protein Eng. 2002Dec ； 15(12) :1015-20 ；Koide 等，Biochemistry 200IAug 28 ；40 (34) :10326_33。变体型和野生型wFM蛋白都具有相同的结构特征，即七个β链结构域序列(称 作A-G)和连接前述七个β链结构域序列的六个环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环、和TO 环)。位置与N-和C-末端最接近的β链在溶液中可采取β样构象。在SEQ ID Ν0:1中， AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基 51-56，EF 环对应于残基 60-66，而 FG 环对应于残基 76-87 (Xu et al. , Chemistry&BioIogy 20029 =933-942)。BC、DE和TO环沿着分子的一个面排列，而AB、CD和EF环沿着分子相对 面排列。在SEQ ID N0:1中，β链A对应于残基9-14，β链B对应于残基17-20，β链C 对应于残基31-38，β链D对应于残基46-50，β链E对应于残基57-59，β链F对应于残 基67-75，而β链G对应于残基88-94。各链经由相应的环彼此连接，例如链A和B藉由环 AB连接形成链Α、环ΑΒ、链B的排列，等等。涉及形成疏水性核心的残基(“核心氨基酸残 基”)包括与SEQ ID NO :1的下述氨基酸对应的氨基酸L8、V10、A13、L18、I20、W22、TO2、 134、Y36、F48、V50、A57、159、L62、Y68、170、V72、A74、188、190 和 Y92，其中核心氨基酸残 基用单字母氨基酸代码后加它们在SEQ ID NO :1内的位置来表示。参见例如Dickinson et al.，J. Mol. Biol. 236 1079-1092 (1994)。在一些实施方案中，1°! 多肽可以与SEQ ID NO 1中所示人1QFn3结构域至少 40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%相同。大部分变异性一般会存在于 一个或多个环中。iciI7I^多肽的每个β或β样链可以基本上由与SEQ ID NO 1的对应β 或β样链的序列至少80^^85%,90^^95%或100%相同的氨基酸序列组成，只要这样的 变异不破坏多肽在生理学条件中的稳定性。在一些实施方案中，本公开内容提供包含第十纤连蛋白III型(1(1而3)结构域的多肽，其中"lFr^结构域包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG，且选自环BC、DE和FG中 的至少一个环具有相对于人kiFM结构域的相应环的序列为改变的氨基酸序列。在一些实 施方案中，BC和re环是改变的。在一些实施方案中，BC、DEJP re环是改变的，即而3结构 域包含非天然存在的环。“改变的”指一处或多处相对于模板序列(对应的人纤连蛋白结构 域)的氨基酸序列改变，包括氨基酸添加、删除、和替代。氨基酸序列的改变可通过有意的、 盲目的、或自发的序列(一般是核酸编码序列)变异来实现，而且可通过任何技术来实施， 例如PCR、易错PCR、或化学DNA合成。在一些实施方案中，选自BC、DEjnre的一个或多个环的长度可以相对于相应的 人纤连蛋白环延长或缩短。在一些实施方案中，环的长度可以延长2-25个氨基酸。在一些 实施方案中，环的长度可以缩短1-11个氨基酸。具体而言，kiFM的re环长12个残基，而 抗体重链中的相应环的范围为4- 个残基。因此，为了优化抗原结合，1(1而3的re环的长 度优选在长度以及序列方面改变以覆盖4- 个残基的CDR3范围，以获得最大可能的抗原 结合灵活性和亲和力。在一些实施方案中，多肽包含如下的第一而3结构域，其包含与SEQ IDNO 1的非 环区至少80，85，90，95，98，或100 %相同的氨基酸序列，其中至少一个选自BC，DE，和TO的 环是改变的。在一些实施方案中，多肽包含如下的第二而3结构域，其包含与SEQ ID NO 1 的非环区至少80，85，90，95，98，或100%相同的氨基酸序列，其中至少一个选自BC, DE，和 re的环是改变的。在一些实施方案中，改变的BC环具有最多10处氨基酸替代、最多4处氨 基酸删除、最多10处氨基酸插入、或其组合。在一些实施方案中，改变的DE环具有最多6 处氨基酸替代、最多4处氨基酸删除、最多13处氨基酸插入或其组合。在一些实施方案中， re环具有最多12处氨基酸替代、最多11处氨基酸删除、最多25处氨基酸插入或其组合。10Fn3结构域一般以SEQ ID NO=I的氨基酸编号1开始。然而，本发明也涵盖具有 氨基酸删除的结构域。在一些实施方案中，SEQ ID NO :1的前8个氨基酸被删除。N端或C 端也可添加额外的序列。例如，可以将额外的MG序列置于而3结构域的N端，特别是第一 而3结构域的N端。M通常会被切掉，留下G在N端。在一些实施方案中，序列可置于kiFM 结构域的C端，例如SEQID N0:17，18，或19。在其它实施方案中，置于C端的序列可以是 SEQ ID NO: 17，18或19的C端截短片段，包括例如下述氨基酸序列之一(用单字母氨基酸 代码表示):E, EI, EID, EIDKP (SEQ ID NO 50), EIDKPS (SEQ ID NO 51)，或 EIDKPC(SEQ ID NO 52)。在一些实施方案中，多肽包含如下的第一和/或第二 kiFM结构域，其中BC环具 有氨基酸序列SEQ ID NO 2, DE环具有氨基酸序列SEQ ID NO :3，而TO环具有氨基酸序列 SEQ ID N0:4，其中而3结构域结合IGF4R。在一些实施方案中，多肽包含如下的第一和/ 或第二 wFM结构域，其中BC环具有氨基酸序列SEQ ID NO :5，DE环具有氨基酸序列SEQ ID NO :6，而TO环具有氨基酸序列SEQ ID NO :7，其中而3结构域结合VEGFR2。在一些实施 方案中，多肽包含SEQ ID N0:8-15J9-31和63-70中的任一氨基酸序列。在一些实施方案 中，多肽包含与 SEQ ID NO :8-15,29-31 和 63-70 中任一序列至少 70，75，80，85，90，95，或 100%相同的氨基酸序列。纤连蛋白天然地借助其整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)结 合某些类型的整联蛋白。在一些实施方案中，多肽包含缺少该(RGD)整联蛋白结合基序的10Fn3结构域。在一个实施方案中，多价多肽包含具有结构A-B-C的多肽，其中A为包含结合 VEGFR2的结构域、基本上由结合VEGFR2的结构域组成、或由结合VEGFR2的1QFn3 结构域组成的多肽，B为多肽接头，而C为包含结合IGF-IR的1(1而3结构域、基本上由IGF-IR 的kiFM结构域组成、或由IGF-IR的1(1而3结构域组成的多肽。在另一个实施方案中，多价 多肽包含具有结构A-B-C的多肽，其中A为包含结合IGF4R的1(1而3结构域、基本上由结合 IGF-IR的1(1而3结构域组成、或由结合IGF4R的kiFM结构域组成的多肽，B为多肽接头，而 C为包含结合VEGFR2的1QFn3结构域、基本上由结合VEGFR2的结构域组成、或由结合 VEGFR2的1(1而3结构域组成的多肽。具有结构A-B-C的多价多肽的具体例子是包含下述各 项的多肽⑴具有SEQ ID NO :8-15,29-31和63-70任一所列氨基酸序列的多肽；或(ii) 包含与SEQ ID NO :8-15, 29-31和63-70任一所列氨基酸序列至少85%, 90%, 95%, 97%, 98%，或99%相同的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，所述A区或C区是包含结合VEGFR2的1(1而3结构域的多肽，其 中1(^η3结构域具有如下的结构(自N端至C端)β链Α、环ΑΒ、β链B、环BC、β链C、环 ⑶、β链D、环DE、β链Ε、环EF、β链F、环TO、β链G，其中BC环具有氨基酸序列SEQ ID NO :5，DE环具有氨基酸序列SEQ IDNO :6，而TO环具有氨基酸序列SEQ ID N0:7，其中1QFn3 结构域折叠成抗体重链可变区样结构，且其中多肽以小于IOOnM的Kd结合VEGFR2。结合 VEGFR2的1(1而3结构域优选折叠成如下的结构，其中7条β链分布在两个β片层之间，这 两个β片层彼此相对挤压，形成一个稳定的核心，且其中各β链通过6个环连接，这些环 暴露于溶剂。在例示性的实施方案中，kiFM结构域长度为80-150个氨基酸。在某些实施方案中，A区或C区是结合VEGFR2的1(^η3结构域，其包含具有 氨基酸序列SEQ ID NO :5的BC环、具有氨基酸序列SEQ ID NO :6的DE环、和具有氨 基酸序列SEQ ID NO :7的TO环，其中该1Vr^结构域以小于IOOnM的Kd结合VEGFR2。 一种例示性的VEGFR2结合物用下述序列表示=EWAATX…SLLIXd SWRHPHFPTR Xa2YYRITYGEXn2MFTVXa3 PLQPPT X.,ATIX^DYTITVYAVXa5 TDGRNGRLLSIP XjJSINYRT (SEQ ID NO :47)。在SEQ ID NO :47中，BC、DE和TO环具有以粗体显示的固定序列，AB环用)(nl表示， CD环用‘表示，而EF环用Xn3表示，而β链A-G标有下划线。X代表任意氨基酸，而X后面 的下标代表氨基酸数目的整数。具体而言，nl可以是1-15，2-15，1-10, 2-10,1-8, 2-8,1-5, 2-5，1-4，2-4，1-3，2-3,或1-2个任意数目基酸；而n2和n3可以各自独立地是2-20, 2-15, 2-10，2-8，5-20，5-15，5-10，5-8，6-20，6-15，6-10，6-8，2-7，57，或 6-7 个氨基酸；而 al_a6 可以各自独立地包含0-10，0-5，1-10，1-5，或2-5个氨基酸。在优选的实施方案中，nl是2 个氨基酸，n2是7个氨基酸，n3是7个氨基酸，而al_a6是0个氨基酸。各β链的序列可 以在所有7个支架区间相对于SEQ ID NO :1所示相应氨基酸序列具有0-10，0-8，0-6，0-5， 0-4，0-3，0-2，或0-1处替代、删除或添加。在一个例示性的实施方案中，β链的序列在所 有7个支架区内可以相对于SEQ ID NO :1所示的相应氨基酸序列具有0-10，0-8，0-6，0-5， 0-4，0-3，0-2，或0-1处保守替代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，且任意替 代、保守替代、删除或添加发生于核心氨基酸残基以外的残基。在某些实施方案中，VEGFR2 结合物用下述氨基酸序列表示
EVVAATPTSLLI SWRHPHFPTR YYRITYGETGGNSPVQEFTV PLQPPT ATISGLKPGVDYTITVYAV TDGRNGRLLSIP ISINYRT (SEQ ID NO :40)。在SEQ ID NO :40中，BC、DE和TO环的序列具有以粗体显示的固定序列(例如具有 氨基酸序列SEQ ID NO :5的BC环，具有氨基酸序列SEQ ID NO :6的DE环，和具有氨基酸序 列SEQ ID NO :7的TO环)，而其余标有下划线的序列(例如7条β链及ABjD和EF环的 序列)相对于SEQ ID NO :40所示相应氨基酸序列具有0-20，0-15，0-10，0-8，0-6，0-5，0-4， 0-3，0-2，或0-1处替代、保守替代、删除或添加。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固 定的，且任意替代、保守替代、删除或添加发生于核心氨基酸残基以外的残基。结合VEGFR2 的10Fn3结构域可以任选包含长度1-20，1-15，1-10,1-8,1-5,1-4,1-3,1-2，或1个氨基酸的 N端延伸。例示性的N端延伸包括(用单字母氨基酸代码表示)M，MG, G，MGVSDVPRDL(SEQ ID NO 45) ,VSDVPRDL (SEQ ID NO :46)，和 GVSDVPRDL (SEQ ID NO :48)，或者 SEQ ID NO :45, 46或48任一的N端截短片段。其它合适的N端延伸包括例如XnSDVPRDL (SEQ ID NO :53)， XnDVPRDL(SEQ ID NO 54), XnVPRDL (SEQ ID NO 55), XnPRDL(SEQ IDNO 56)，XnRDL(SEQ ID NO 57)，XnDL (SEQ ID NO :58)，或 XnL，其中 η = 0，1 或 2 个氨基酸，其中当 η = 1 时，X 是 Met或Gly，而当η = 2时，X是Met-Gly。结合VEGFR2的’n3结构域可以任选包含C端尾。 例示性的C端尾包括长度为1-20，1-15，1-10，1-8，1-5,1-4,1-3,1-2，或1个氨基酸的多肽。 C端尾的具体例子包括EIDKPSQ (SEQ ID NO 17), EIDKPCQ (SEQ ID NO 18)，和 EIDK (SEQ ID N0:19)。在其它实施方案中，合适的C端尾可以是SEQ ID NO 17，18或19的C端截短片 段，包括例如下述氨基酸序列之一(用单字母氨基酸代码表示)E，EI，EID，EIDKP (SEQ ID NO 50), EIDKPS (SEQ ID NO :51)，或 EIDKPC (SEQ ID NO :52)。其它合适的 C 端尾包括例如 ES, EC, EGS, EGC, EGSGS (SEQ ID NO :71)，或 EGSGC (SEQ ID NO :72)。在某些实施方案中，结 合VEGFR2的1(1而3结构域包含N端延伸和C端尾二者。在例示性的实施方案中，A区包含 以Gly或Met-Gly开始的N端延伸和不含半胱氨酸残基的C端延伸，而B区包含不以Met开 始的N端延伸和包含半胱氨酸残基的C端延伸。结合VEGFR2的结构域的具体例子是 包含下述各项的多肽⑴具有SEQ IDNO :16,28和40-44任一所列氨基酸序列的多肽；或 (ii)包含与SEQ ID NO :16, 和40-44任一所列氨基酸序列至少85%，90%，95%，97%， 98 %，或99 %相同的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，A或C区是包含结合IGF4R的wFM结构域的多肽，其中wFM 结构域具有如下的结构(自N端至C端)链Α、环ΑΒ、β链B、环BC、β链C、环CD、β 链D、环 Ε、β链Ε、环EF、0链F、环TO、β链G，其中BC环具有氨基酸序列SEQ ID NO :2， DE环具有氨基酸序列SEQ ID NO :3，而TO环具有氨基酸序列SEQ ID NO :4，其中uiFr^结构 域折叠成抗体重链可变区样结构，且其中多肽以小于IOOnM的Kd结合IGF-IR。结合IGF-IR 的1(1而3结构域优选折叠成如下的结构，其中7条β链分布在两个β片层之间，这两个β 片层彼此相对挤压，形成一个稳定的核心，且其中各β链通过6个暴露于溶剂的环连接。在 例示性的实施方案中，结构域长度为80-150个氨基酸。在某些实施方案中，A或C区是结合IGF-IR的kiFM结构域，其包含具有氨 基酸序列SEQ ID NO :2的BC环、具有氨基酸序列SEQ ID NO :3的DE环、和具有氨基 酸序列SEQ ID NO :4的FG环，其中wFM结构域以小于IOOnM的Kd结合IGF-IR。一 种例示性的IGF-IR结合物用下述序列表示厘YMlXnlMMXal SWSARLKVAR
15X,,YYRITYGEXn,QEFTVX,, PKNVYT X^ATIXnJYTITVYAVX,. TRFRDYQP Xa6ISINYRT (SEQ ID NO 49)。在SEQ ID NO 49中，BC、DE和TO环具有以粗体显示的固定序列，AB环用)(nl表 示，⑶环用‘表示，而EF环用Xn3表示，而β链A-G标有下划线。X代表任意氨基酸，而 X后面的下标代表氨基酸数目的整数。具体而言，nl可以是1-15，2-15，1-10, 2-10,1-8, 2-8，1-5，2-5，1-4，2-4,1-3, 2-3,或 1-2 个氨基酸；n2 和 n3 可以各自独立地是 2-20, 2-15, 2-10，2-8，5-20，5-15，5-10, 5-8，6-20，6-15，6-10，6-8，2-7, 5-7,或 6-7 个氨基酸；而 al_a6 可以各自独立地包含0-10，0-5，1-10，1-5，或2-5个氨基酸。在优选的实施方案中，nl是 2个氨基酸，n2是7个氨基酸，n3是7个氨基酸，而al_a6是0个氨基酸。各β链的序 列在所有7个支架区内相对于SEQ ID Ν0:1所示的相应氨基酸序列可以具有0-10，0-8， 0-6，0-5，0-4，0-3，0-2，或0-1处替代、删除或添加。在一个例示性的实施方案中，β链 的序列在所有7个支架区内相对于SEQ ID NO :1所示的相应氨基酸序列可以具有0-10， 0-8，0-6，0-5，0-4，0-3，0-2，或0-1处保守替代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是 固定的，且任意替代、保守替代、删除或添加发生于核心氨基酸残基以外的残基。在某些 实施方案中，IGF-IR结合物用下述氨基酸序列表示=EVVAATPT SLLI SWSARLKVAR YYRITYGETGGNSPVQEFTV PKNVYT AT ISGLKPGVDYTITVYAV TRFRDYQP ISINYRT (SEQ ID NO 35)。在SEQ ID NO :35中，BC、DE和re环的序列具有以粗体显示的固定序列(例如具有 氨基酸序列SEQ ID NO :2的BC环，具有氨基酸序列SEQ ID NO :3的DE环，和具有氨基酸序 列SEQ ID NO :4的TO环)，而其余标有下划线的序列(例如7条β链及ΑΒ、⑶和EF环的序 列)相对于SEQ ID NO :35所示的相应氨基酸序列具有0-20，0-15，0-10，0-8，0-6，0-5，0-4， 0-3，0-2，或0-1处替代、保守替代、删除或添加。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固 定的，且任意替代、保守替代、删除或添加发生于核心氨基酸残基以外的残基。结合IGF-IR 的10Fn3结构域可以任选包含长度1-20，1-15，1-10,1-8,1-5,1-4,1-3,1-2，或1个氨基酸的 N端延伸。例示性的N端延伸包括(用单字母氨基酸代码表示)M，MG, G，MGVSDVPRDL(SEQ ID NO 45) ,VSDVPRDL (SEQ ID NO :46)，和 GVSDVPRDL (SEQ ID NO :48)，或者 SEQ ID NO :45, 46或48任一的N端截短片段。其它合适的N端延伸包括例如XnSDVPRDL (SEQ ID NO :53)， XnDVPRDL(SEQ ID NO 54), XnVPRDL (SEQ ID NO 55), XnPRDL(SEQ IDNO 56)，XnRDL(SEQ ID NO 57)，XnDL (SEQ ID NO :58)，或 XnL，其中 η = 0，1 或 2 个氨基酸，其中当 η = 1 时，X 是 Met或Gly，而当η = 2时，X是Met-Gly。结合IGF4R的结构域可以任选包含C端尾。 例示性的C端尾包括长度为1-20，1-15，1-10，1-8，1-5,1-4,1-3,1-2，或1个氨基酸的多肽。 C端尾的具体例子包括EIDKPSQ (SEQ ID NO 17), EIDKPCQ (SEQ ID NO 18)，和 EIDK (SEQ ID Ν0:19)。在其它实施方案中，合适的C端尾可以是SEQ ID NO 17，18或19的C端截短片 段，包括例如下述氨基酸序列之一(用单字母氨基酸代码表示)E，EI，EID，EIDKP (SEQ ID NO 50), EIDKPS (SEQ ID NO :51)，或 EIDKPC (SEQ ID NO :52)。其它合适的 C 端尾包括例如 ES, EC, EGS, EGC, EGSGS (SEQ ID NO :71)，或 EGSGC (SEQ ID NO :72)。在某些实施方案中，结 合IGF-IR的1(1而3结构域包含N端延伸和C端尾二者。在例示性的实施方案中，A区包含 以Gly或Met-Gly开始的N端延伸和不含半胱氨酸残基的C端延伸，而B区包含不以Met开 始的N端延伸和包含半胱氨酸残基的C端延伸。结合IGF4R的结构域的具体例子是包含下述各项的多肽⑴具有SEQ IDNO :26-27和35-39任一所列氨基酸序列的多肽；或 (ii)包含与SEQ ID NO J6-27和35-39任一所列氨基酸序列至少85%，90%，95%，97%， 98 %，或99 %相同的氨基酸序列的多肽。B区是多肽接头。例示性的多肽接头包括具有1-20，1-15，1-10，1-8，1-5，1-4， 1-3，或1-2个氨基酸的多肽。合适的多肽接头的具体例子在本文中有进一步描述。在某些 实施方案中，接头可以是本文所述的C端尾多肽、本文所述的N端延伸多肽、或其组合。在一个实施方案中，多价多肽包含具有结构A-A-X2-B-X3-C-X4的多肽，其中&是 任选的N端延伸，A是结合VEGFR2的1(1而3结构域，X2是任选的C端尾，B是多肽接头，X3是 任选的N端延伸，C是结合IGF-IR的wFM结构域，而\是任选的C端尾。在另一个实施方 案中，多价多肽包含具有结构A-A-X2-B-X3-C-X4的多肽，其中\是任选的N端延伸，A是结 合IGF-IR的wFM结构域，X2是任选的C端尾，B是多肽接头，X3是任选的N端延伸，C是结 合VEGFR2的wFM结构域，而&是任选的C端尾。上文描述了合适的N端延伸和C端尾的 具体例子。在某些实施方案中，X1、&、B、&或&中的一个或多个可以包含适合于PEG化的 氨基酸残基，诸如半胱氨酸或赖氨酸残基。在例示性的实施方案中，&包含至少一个适合于 PEG化的氨基酸残基，诸如半胱氨酸或赖氨酸残基。下文进一步描述了合适的多肽接头的具 体例子。具有结构A-A-X2-B-X3-C-X4的多价具体的具体例子是包含下述各项的多肽⑴ 具有SEQ ID N0:8-15J9-31和63-70任一所列氨基酸序列的多肽；或(ii)包含与SEQ ID NO :8-15,29-31 和 63-70 任一所列氨基酸序列至少 85%，90%，95%，97%，98%，或 99%相 同的氨基酸序列的多肽。在例示性的实施方案中，如本文中所定义的X是天然存在的氨基酸。多肽接头本申请提供包含藉由多肽接头连接的至少两个而3结构域的多价多肽。所述的多 肽包含N端结构域和C端结构域，该N端结构域包含第一而3结构域，该C端结构域包含第 二而3结构域。第一和第二而3结构域可以直接连接或藉由多肽接头间接连接。可以在 而3结构域与多肽接头之间在第一而3结构域的C端引入另外的接头或间隔物，例如SEQ ID NO 17,18，或19。可以在而3结构域与多肽接头之间在第二而3结构域的N端引入另外的 接头或间隔物。适合于连接而3结构域的接头是那些容许各别的结构域彼此独立地折叠，从而形 成容许高亲和力结合靶物分子的三维结构的接头。本申请提供了满足这些要求的合适接 头，包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的 接头以及接头SEQ ID N0:20。本文所述实施例证明了藉由这些接头连接的而3结构域保 留它们的靶物结合功能。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接 头包含甘氨酸和丝氨酸残基，而且长度可以是8-50，10-30，和10-20个氨基酸。此类接头的 例子包括SEQ ID N0:23，M，和25。在一些实施方案中，多肽接头选自SEQID NO :21和22。 在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸，而 且长度可以是3-30，10-30，和3-20个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID N0:32，33，和 34。在一些实施方案中，接头是基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨 酸，而且长度可以是3-30，10-30，3-20和6-18个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID NO: 60，61和62。通过本领域公知的常规实验可以确定最佳的接头长度和氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽接头是SEQ ID NO: 20。药动学模块在一个方面，本申请提供进一步包含药动学(PK)模块的多价多肽。改善的药动学 可依照察觉到的治疗需要来评估。往往希望提高生物利用度和/或延长给药的时间间隔， 这可能通过延长服药后蛋白质在血清中保持可利用状态的时间来实现。在有些情况下希望 改善蛋白质的血清浓度随时间的连贯性(例如缩小施药后不久的蛋白质血清浓度与下次 施药前不久的蛋白质血清浓度的差异)。可以将多肽连接于可使多肽在哺乳动物(例如小 鼠、大鼠、或人)中的清除速率相对于未修饰多肽降低超过3倍的模块。改善的药动学的其 它量度可包括血清半衰期，其常常分成α阶段和β阶段。两个阶段之一或二者可通过添 加适宜的模块来显著改善。有减缓蛋白质从血液清除的倾向的模块(在本文中称作“Hi模块”)包括聚氧化 烯模块(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)、和耐受良好的蛋白质模块(例如Fc、Fc片段、 运铁蛋白、或血清白蛋白)。多肽可以与白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体融合，如美 国专利申请公开文本No. 20070048282中所记载的。在一些实施方案中，Hi模块是血清白蛋白结合蛋白，诸如美国专利申请公开文本 No. 2007/0178082 和 2007/0269422 中记载的那些。在一些实施方案中，PK模块是血清免疫球蛋白结合蛋白，诸如美国专利申请公开 文本No. 2007/0178082中记载的那些。在一些实施方案中，多价多肽包含聚乙二醇(PEG)。可以将一个或多个PEG分子 连接于蛋白质上的不同位置，这样的连接可通过与胺、硫醇或其它合适的反应性基团的反 应来实现。胺模块可以是例如存在于多肽N端的伯胺或存在于氨基酸(诸如赖氨酸或精氨 酸)中的胺基。在一些实施方案中，PEG模块连接于多肽上选自下组的位置a)N末端；b)N 末端与最N端的β链或β样链之间；c)位于多肽的与靶物结合位点相对的面上的环；d)C 末端与最C端的β链或β样链之间；和e)C末端。PEG化可通过定点PEG化来实现，其中将合适的反应性基团引入蛋白质中以创建 PEG化优先发生的位点。在一些实施方案中，修饰蛋白质以在期望的位置引入半胱氨酸残 基，容许半胱氨酸上的定点PEG化。在一些实施方案中，多肽包含含有Cys的接头，诸如SEQ ID NO :18，其容许定点PEG化。在一些实施方案中，在第二而3结构域(即多肽中最C端的 结构域)的3'端引入含Cys的接头。PEG的分子量可以广泛变化，而且可以是分支的或线 性的。在一些实施方案中，多价多肽包含而3结构域和1 模块。在一些实施方案中，而3 结构域是kiFM结构域。在一些实施方案中，相对于单独的而3结构域，1 模块将多肽的血清 半衰期延长超过 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000%
或更多。在一些实施方案中，1 模块是经至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合糖、或聚乙二醇 模块连接于而3结构域的。例示性多肽接头包括PSTSTST (SEQID NO 20) ,EIDKPSQ(SEQ ID N0:17)、和GS接头，诸如GSGSGSGSGS(SEQ ID NO 21)及其多聚体。在一些实施方案中，PK 模块是人血清白蛋白。在一些实施方案中，PK模块是运铁蛋白。革巴物
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本申请提供包含结合第一靶物分子的第一而3结构域和结合第二靶物分子的第 二而3结构域的多价多肽。第一和第二靶物分子可以是相同的或不同的靶物分子。当第一 和第二靶物分子相同时，而3结构域(即结合环)可以是相同的或不同的。因此，第一和第 二而3结构域可以结合相同的靶物，但是表位不同。通过向环区，特别是环BC、DE、和TO中 引入序列变异，可生成结合几乎任何靶物分子的而3结构域。可以评估结合靶物分子的多肽的平衡常数(例如解离Kd)及动力学常数(例如结 合速率常数k。n和解离速率常数k。ff)。而3结构域一般会以小于500nM，IOOnM, InM, 500pM, IOOpM或更小的Kd结合靶物分子，尽管在k。ff足够低或k。n足够高的情况下可以容忍更高的 Kd值。在一些实施方案中，第一和/或第二而3结构域结合选自下组的靶物IGF_IR， FGFR, FGFRl, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5, c_Kit，人 pl85 受体样激酶，EGFR, HER2, HER3, HER4, c-Met，叶酸受体，PDGFR, VEGFRl, VEGFR2, VEGFR3，人血管内皮生长因子(VEGF)-A, VEGF-C, VEGF-D,人 CD20,人 CD18，人 CDlla,人凋亡受体 _2 (Apo-2)，人 α 4 β 7 整联蛋白， 人GPIIb-IIIa整联蛋白，干细胞因子(SCF)，人CD3，IGF-IR，Angl, Ang2，成纤维细胞生长 因子，表皮生长因子，肝细胞生长因子，或Tie2. 3。在一些实施方案中，第一而3结构域在N 端位置且结合IGF-IR，而第二而3结构域结合VEGFR2。在一些实施方案中，第一而3结构 域在N端位置且结合VEGFR2，而第二结构域结合IGF-IR。在一些实施方案中，第一而3结 构域在N端位置且结合IGF-1R，而第二结构域结合VEGFR2。在某些实施方案中，多价多肽包含结合不同靶物的第一和第二而3结构域。在此 类实施方案中，可能期望调节某一而3结合域相对于另一而3结合域的效力。例如，如果第 -Fn3结构域的结合亲和力显著高于第二而3结构域的结合亲和力，那么第一 Fn3结构域 的生物学效果会压制第二而3结构域的效果。因而，在某些实施方案中，可能期望多价多肽 的第一和第二而3结构域的结合亲和力彼此相似，例如结合亲和力在彼此100倍，30倍，10 倍，3倍，1倍，0. 3倍或0. 1倍以内，或结合亲和力在彼此0. 1倍-10倍以内，0. 3倍-10倍 以内，0. 1倍-3倍以内，0.3倍-3倍以内，0. 1倍-1倍以内，0.3倍-1倍以内，1倍-10倍以 内，3倍-10倍以内，3倍-30倍以内，或1倍-3倍以内。多域实施方案本申请的一个方面提供进一步包含结合模块的多价多肽。在一些实施方案中，结 合模块以小于IO-fiM，1(TM，10、，10_9M，或IO-9M的Kd结合人靶蛋白质。在一些实施方案中，结合模块结合肿瘤相关靶物或抗原。在一些实施方案中，抗原 靶向会有助于多价多肽的定位(就组织分布或者提高在组织或期望细胞类型中的局部浓 度效应而言)。在一些实施方案中，结合模块结合肿瘤相关靶物或抗原，例如碳酸酐酶IX、A3、对 于 A33 抗体特异性的抗原、BrE3 抗原、CDU CDla, CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、 CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA 95、NCA90, HCG 及其亚基、 CEA (CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp, EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM, Ba733、HER2/neu、低氧诱导 因子(HIF)、KC4 抗原、KS-I 抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、 MUC3、MUC4、PAM-4 抗原、PSA、PSMA, RS5、S100、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰岛素 生长因子-I (IGF-I)、胰岛素生长因子-II (IGF-II)、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、胎盘生长因子(PlGF)、17-1A抗原、血管发生标志物(例如ED-B纤连蛋 白)、癌基因标志物、癌基因产物、和其它肿瘤相关抗原。最近关于肿瘤相关抗原的报告包 括 Mizukami 等 0005，Nature Med. 11 :992-97) ；Hatfield 等 0005，Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48) ；Vallbohmer 等(2005, J. Clin. Oncol. 23 :3536-44)；及 Ren 等(2005, Ann. Surg. 242 :55-63)，通过述及将每一篇收入本文。在一些实施方案中，结合模块选自抗体模块。抗体模块指免疫球蛋白分子和免疫 球蛋白分子的免疫学活性部分，即包含可免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。 因此，“抗体模块”这一术语不仅涵盖完整抗体分子，而且还涵盖抗体多聚体和抗体片段以 及抗体、抗体多聚体和抗体片段的变体(包括衍生物)。抗体模块的例子包括但不限于单链 FV(SCFVS)、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2、二硫化物连接的Fv(sdFv)、和Fv。抗体模块可 以是例如单克隆的、嵌合的、人源的、或人源化的。在一些实施方案中，抗体模块选自⑴Fab片段，其具有VL、CL、VH和CHl结构域；
(ii)Fab'片段，其是在CHl结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；
(iii)Fd片段，其具有Vh和CHl结构域；(iv) Fd'片段，其具有Vh和CHl结构域，并在CHl结 构域C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基；(ν)Fv片段，其具有抗体单臂的结构域； (vi)dAb 片段(Ward 等，Nature 341，544-546 (1989))，其由 Vh 结构域组成；(vii)分离的 ⑶R区；(viii)F(ab' )2片段，一种包含通过铰链区中的二硫桥相连的两个Fab'片段的二 价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链 Fv ；scFv) (Bird 等，Science 242 :423-426(1988)； 及Huston等，PNAS(USA)85 :5879-5883(1988)) ； (χ) “双抗体”，其具有两个抗原结合位 点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(参见例如EP专 利公开文本 No. 404，097 ；WO 93/11161 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 6444-6448(1993))；和(xi) “线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(Vh-CHI-Vh-CHI)，这 些Fd区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 (1995)；及美国专利 No. 5，641，870)。在一些实施方案中，抗体模块是单域抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然不含 轻链的抗体、自常规的四链抗体衍生的单域抗体、工程化抗体和非衍生自抗体的单域支架 (single domain scaffolds) 0单域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆 驼、美洲驼(llama)、山羊、家兔、牛。在一些实施方案中，单域抗体是天然存在的单域抗体，诸如Vra结构域。Vhh是指从 天然不含轻链的免疫球蛋白，诸如那些源自骆驼科(Camelidae)(包括骆驼、单峰驼、美洲 驼、小羊驼(vicuna)、羊驼(alpaca)和大羊驼(guanaco))的免疫球蛋白，衍生的重链可变 域，如W094/04678中所记载的。Vra分子比IgG分子小约10倍。由于已知Vhh结合“非常” 表位，诸如腔(cavities)或沟(grooves)，因此这样的Vra的亲和力可能更适合于治疗性处 理，PCT公开文本号W097/49805。在一些实施方案中，单域抗体是结合血清蛋白质的Vhh,如美国专利申请公开文本 No. 20070178082中所记载的。血清蛋白质可以是在受试者的血清中找到的任何合适蛋白 质，或其片段。在一些实施方案中，血清蛋白质是血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结 合蛋白、运铁蛋白、或纤连蛋白。已经开发了多种抗体片段生产技术，它们可用于制备本发明中所使用的抗体片段。传统上，这些片段是通过对完整抗体的蛋白水解消化衍生的(参见例如Morimoto等， Journal of Biochemical and Biophysical Methods24 :107-117(1992)；及 Brerman 等， kience，229 :81 (1985))。然而，现在可以由重组宿主细胞直接生成这些片段。例如，可以 自上文所讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以自大肠杆菌直接回收Fab' -SH 片段并化学偶联以形成 F (ab' )2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。 依照另一种方法，可以自重组宿主细胞培养物直接分离F(ab' )2片段。用于抗体片段生产 的其它技术对于技术人员会是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片 段(scFv)。参见 WO 93/16185 ；美国专利 No. 5，571，894 ；及美国专利 No. 5，587，458。抗体 片段也可以是“线性抗体”，举例而言，如例如美国专利No. 5，641，870所述的。此类线性抗 体片段可以是单特异性的或双特异性的。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种avimer序列。avimer是通过 体外外显子改组和噬菌体展示从人胞外受体域发展而来的(Silverman等，2005，Nat. Biotechnol. 23 :1493-94 ；SiIverman 等，2006，Nat. Biotechnol. 24 :220)。所得多域蛋白可 包含多个独立的、与单表位结合蛋白相比可展现出改善的亲和力(有些情况下是亚纳摩尔 级)以及特异性的结合域。关于avimer的构建和使用方法的更多细节披露于例如美国专 利公开文本 No. 20040175756，20050048512, 20050053973, 20050089932 和 20050221384,通 过述及将其完整收入本文。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种脂笼蛋白相关序列，例如 anticalins或脂笼蛋白衍生物。anticalins或脂笼蛋白衍生物是一类对多种靶分子(包 括本文中所描述的那些)具有亲和力和特异性的结合蛋白。此类蛋白质在美国专利公开文 本No. 20060058510, 20060088908, 20050106660，和 PCT 公开文本No. W02006/056464 中有记载。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种四连蛋白C型凝集素相关序列或三 连蛋白，例如四连蛋白C型凝集素或四连蛋白C型凝集素衍生物。四连蛋白C型凝集素或 四连蛋白C型凝集素衍生物是一类对多种靶分子(包括本文中所描述的那些)具有亲和 力和特异性的结合蛋白。PCT 公开文本 W02006/053568，W02005/080418, W02004/094478, W02004/039841, W02004/005335, W02002/048189, W098/056906,和美国专利公开文本 No. 20050202043记载了不同的四连蛋白C型凝集素和相关蛋白。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种天然锚蛋白重复蛋白，例如 DARPins(Molecular Partners)。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种Affibodies 。Affibodies 衍生自 葡萄球菌蛋白A的IgG结合域。可通过改变位于蛋白A结构域的结合表面附近的残基来获 得新的结合特性。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种基于半胱氨酸结(cysteineknot) 的蛋白质支架，即微体(Selecore/NascaCell)。在一些实施方案中，结合模块包含一种或多种Trans-bodies 。Trans-bodies 基 于运铁蛋白支架(BioResis/Pfizer)。在一些实施方案中，结合模块包含基于伽马晶体蛋白或遍在蛋白质的结合蛋白。 这些所谓的AffilinTM(Scil Proteins)分子具有这样的特征，即在蛋白质的β片层结构中从头设计了结合区。Affilin 分子已经在美国专利申请公开文本No. 20070248536中有描 述。缀合多价多肽和结合模块可藉由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合糖、或PEG模块连 接起来。在一些实施方案中，多价多肽和结合模块是藉由多肽连接的。在一些实施方案中， 多肽接头是SEQ ID NO 17，18，或20。在一些实施方案中，多价多肽和结合模块是藉由具有血液或靶组织中的蛋白酶可 切割的蛋白酶位点的多肽接头连接的。可利用此类实施方案释放两种以上的治疗性蛋白 质，以实现与分别生成这些蛋白质相比更好的投递或或更高的产生效率。在一些实施方案中，多价多肽和结合模块是藉由生物相容性聚合物(诸如聚合 糖)连接的。这样的聚合糖可以包含能够被血液或靶组织中的酶切割的酶切位点。可利用 此类实施方案释放两种以上的治疗性蛋白质，以实现与分别生成这些蛋白质相比更好的投 递或治疗性质或更高的产生效率。在一些实施方案中，多价多肽和结合模块是藉由聚合物接头连接的。可以利用聚 合物接头来最合适地改变各蛋白质模块间的距离，以创建具有下述一项或多项特征的蛋白 质1) 一个或多个蛋白质结构域在结合感兴趣蛋白质时的结合空间位阻降低或提高，2)蛋 白质稳定性或溶解度提高，而无需搜索别的氨基酸替代来提高稳定性或溶解度(例如溶解 度为至少约20mg/ml，或至少约50mg/ml)，3)蛋白质聚集降低，而无需搜索别的氨基酸替代 来降低稳定性(例如如通过SEC所测量的)，及4)通过添加别的结合域而使蛋白质的整体 亲合力或亲和力提高。在一些实施方案中，多价多肽包含第二 结构域，其包含接头SEQ IDNO :18。接 头序列中的半胱氨酸模块上缀合有PEG，PEG将多价多肽和结合模块连接起来。PEG化的实施方案本申请的一个方面提供连接多价多肽与非蛋白质性的聚合物。在一些实施方 案中，聚合物是聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇、或聚氧化烯，如美国专利No. 4，640，835 ； 4，496，689 ；4, 301，144 ；4, 670，417 ；4, 791，192 或 4，179，337 中所记载的。在一些实施方案 中，多价多肽包含而3结构域。在一些实施方案中，聚合物是PEG模块。另外，本申请提供与 抗体模块(例如骆驼抗体及其衍生物，以及单链和单域抗体；特别是那些由微生物表达的) 和抗体样模块(例如脂笼蛋白、锚蛋白、多重Cys-Cys结构域以及四连蛋白的衍生物；特别 是那些由微生物表达的)的N或C端PEG缀合。PEG是众所周知的水溶性聚合物，其可通过商业途径获得或者可依照本领域众所 周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo，PolymerSynthesis，Academic Press, New York，卷3，页138-161)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，无论 大小或PEG末端的修饰，而且可以由下式来表示X-O (CH2CH2O) ^1CH2CH2OH (1)，其中η为 20-2300，X为H或末端修饰，例如CV4烃基。在一个实施方案中，本发明的PEG的一端以氢或 甲氧基终止，即X是H或CH3 (“甲氧基PEG”)。PEG可进一步包含的结合反应所必需的化学 基团；其源自分子的化学合成；或者其是为获得分子各部分间的最佳距离的间隔物。另外， 这样的PEG可以由一个或多个连接到一起的PEG侧链组成。具有超过一条PEG链的PEG称作多臂的或分支的PEG。分支的PEG可通过例如聚环氧乙烷加成至各种多元醇(包括甘油、 季戊四醇、和山梨醇)来制备。例如，可以自季戊四醇和环氧乙烷制备四臂分支PEG。分支 PEG记载于例如欧洲申请公布No. 473084A和美国专利No. 5，932，462。一种形式的PEG包 括两条经某个赖氨酸的伯氨基相连接的PEG侧链(PEG》(Monfardini，C.等，Bioconjugate Chem. 6(1995)62-69)。PEG对肽或蛋白质的缀合一般包括活化PEG，将活化后的PEG-中间体直接偶联至 目标蛋白质/肽或接头，随后将该接头活化并偶联至目标蛋白质/肽(参见Abuchowski， A.等，J.Biol. Chem.，252，3571 (1977)和 J. Biol. Chem.，252，3582 (1977)，Zalipsky 等， 禾口 Harris 等，-f' ((Poly (ethylene glycol) Chemistry :Biotechnical and Biomedical Applications)) ； (J. M. Harris 编)Plenum Press :New York, 1992 ；第 21 和 22 章)。注意， 包含PEG分子的结合多肽也称作缀合蛋白质，而没有连接PEG分子的蛋白质可称作未缀合 的。所利用的PEG的大小取决于数项因素，包括多价多肽的预期用途。为了延长在身 体、血液、非血液胞外流体和组织中的半衰期，优选较大的PEG。对于体内细胞活性，优选约 10-60kDa范围的PEG，以及小于约lOOkDa、更优选小于约60kDa的PEG，但也可使用大于约 IOOkDa的大小。对于体内成像应用，可使用较小的PEG，一般小于约20kDa，它们增加半衰期 没有大PEG那么多，从而容许更快地分布和更短的半衰期。为了缀合至本发明的结合多肽， 可以选择多种分子量形式的PEG，例如约1，000道尔顿(Da)至100，OOODa (η为20-2300)。 PEG中重复单元的数目“η”是根据以道尔顿描述的分子量而估算的。优选的是，活化后的 接头上的PEG的分子量的总和适合于药用。如此，在一个实施方案中，PEG分子的分子量 不超过100，000Da。例如，如果三个PEG分子连接于接头，其中每个PEG分子具有相同的分 子量12，OOODa(每个的η为约270)，那么接头上的PEG的总分子量为约36，OOODa(总η为 约820)。连接于接头的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在接头上的三个分子中，两个 PEG分子可以是每个5，OOODa (每个η为约110)，而另一个PEG分子可以是12，OOODa (η为 约270)。在一些实施方案中，将一个PEG模块缀合于多价多肽。在一些实施方案中，PEG模 块是约20、30、40、50、60、70、80、或90KDa。在一些实施方案中，PEG模块是约40KDa。在一些实施方案中，PEG化多价多肽含有一个、两个或更多个PEG模块。在一个实 施方案中，PEG模块结合于这样的氨基酸残基其位于蛋白质表面上和/或远离与靶物配 体接触的表面。在一个实施方案中，PEG-结合多肽中PEG的联合分子量或总分子量为约 3，OOODa至60，OOODa,或约10，OOODa至36，OOODa0在一个实施方案中，PEG化结合多肽中 的PEG是基本上线性的直链PEG。本领域技术人员能为PEG选择合适的分子量，例如根据PEG化的结合多肽会如何 用于治疗、期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性、免疫原性、和其它考虑。关于PEG及 其用于增强蛋白质性能的用途的讨论参见N. V. Katre，Advanced Drug Delivery Reviews 10 :91-114(1993)。在一些实施方案中，多价多肽与符合下式的一个聚乙二醇基团共价连 接-C0-(CH2)x-(0CH2CH2)m-0R，其中聚乙二醇基团的-C0(即羰基)与结合多肽的一个氨基 形成酰胺键；R是低级烃基；χ是2或3 ;m是约450至约950 ；并且选择η和m使得缀合物减 去结合多肽的分子量为约10_40kDa。在一个实施方案中，结合多肽的赖氨酸氨基是可利用的(游离的)氨基。在一个具体的实施方案中，使用PEG的碳酸酯来形成PEG-结合多肽缀合物。可以 在与PEG的反应中使用N，N’ - 二琥珀酰亚氨基碳酸酯(DSC)来形成有活性的混合PEG-琥 珀酰亚氨基碳酸酯，其随后可以与接头的亲核基团或结合多肽的氨基起反应(参见美国专 利No. 5，281，698和美国专利No. 5，932，462)。在一种类似类型的反应中，可以使1，1，_(二 苯并三唑基)碳酸酯和二-(2-吡啶基)碳酸酯与PEG起反应以分别形成PEG-苯并三唑基 和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美国专利No. 5，382，657)。多价多肽的PEG化可依照本领域已知方法来实施，例如通过结合多肽与亲电子活 性 PEG 的反应(供应商Shearwater Corp.，USA, WWW. shearwatercorp. com)。本发明的 优选PEG试剂是例如N-羟基琥珀酰亚氨基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥 珀酰亚氨基丙酸酯或分支的N-羟基琥珀酰亚胺诸如mPEG2-NHS (Monfardini，C.，等， BioconjugateChem. 6 (1995) 62-69)。此类方法可用于对结合多肽赖氨酸的ε -氨基或结合 多肽N末端氨基的PEG化。在另一个实施方案中，PEG分子可以被偶联于结合多肽上的硫氢基(sulfhydryl) (Sartore, L.,等，Appl. Biochem. Biotechnol. , 27,45 (1991) ；Morpurgo 等，Biocon. Chem., 7,363-368(1996) ；Goodson 等，Bio/Technology (1990) 8，343 ；美国专利 No. 5，766，897)。 美国专利No. 6，610，281和5，766，897记载了例示性的可偶联于硫氢基的反应性PEG种类。在一些实施方案中，PEG化多价多肽是通过定点PEG化，特别是通过将PEG缀合至 N或C末端处的半胱氨酸模块而生成的。在一些实施方案中，多价多肽是共价结合于PEG模 块的而3结构域，其中所述而3结构域的至少一个环参与靶物结合。PEG模块可通过定点 PEG化连接至而3多肽，诸如通过连接至Cys残基，其中Cys残基可以位于而3多肽的N末 端、或位于N末端和最靠N端的β或β样链之间、或位于而3多肽的C末端、或位于C末 端和最靠C端的β或β样链之间。Cys残基也可以位于其它位置，特别是任何不参与靶物 结合的环。PEG模块也可以通过其它化学来连接，包括通过缀合至胺。在某些PEG分子被缀合至结合多肽上的半胱氨酸残基的实施方案中，半胱氨酸残 基对于结合多肽而言是天然的，而在其它实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基是通过工 程改造引入结合多肽的。可以在结合多肽编码序列中引入突变以产生半胱氨酸残基。这可 以通过，例如，将一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。用于突变成半胱氨酸残基 的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其它亲水性残基。优选的是，待突变成半胱氨 酸的残基是表面暴露的残基。根据蛋白质一级序列预测残基的表面可及性的算法在本领域 是众所周知的。或者，由于结合多肽的设计和改进的基础框架的晶体结构已经得以解析并 且由此鉴定了表面暴露的残基，可以通过比较结合多肽的氨基酸序列来预测表面残基(参 见 Himanen 等，Nature. (2001)20-27 ；414 (6866) :933-8)。在一个实施方案中，将半胱氨酸 残基引入结合多肽中的N和/或C末端或其附近，或者环区内。半胱氨酸残基的PEG化可 以使用例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺、或PEG-正吡啶基二硫化物。在有些实施方案中，PEG化的结合多肽包含共价连接至N末端氨基酸的α氨基的 PEG分子。位点特异性N末端还原性氨化记载于P印insky等OOOl) JPET，297,1059和美 国专利No. 5，824，784。利用其它可获得的亲核氨基用PEG-醛进行蛋白质还原性氨化的用 途记载于美国专利 No. 4，002, 531 ；Wieder 等(1979) J. Biol. Chem. 254，12579 ；和 Chamow 等(1994)Bioconjugate Chem. 5,133。在另一个实施方案中，PEG化的结合多肽包含一个或多个共价连接至接头的PEG 分子，而该接头连接于结合多肽N末端氨基酸残基的α氨基。这样的方法披露于美国专利 申请公开文本No. 2002/0044921和PCT公开文本No. W094/01451。在一个实施方案中，结合多肽的C末端被PEG化。在一个具体的实施方案中， 通过引入C末端叠氮-甲硫氨酸，随后借助Maudinger反应来缀合甲基-PEG-三芳基 膦，将蛋白质的C末端PEG化。这种C末端缀合方法记载于Cazalis等，C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004 ； 15 (5) :1005_1009。可以使用本领域已知的常规分离和纯化技术来纯化PEG化结合多肽，诸如大小排 阻(例如凝胶过滤)和离子交换层析。也可以使用SDS-PAGE来分离产物。可以分离的产 物包括单PEG化、二 PEG化、三PEG化、多PEG化和未PEG化的结合多肽，以及游离PEG。可 以通过合并洗脱峰周围的较宽的级分(broader fractions)，提高组合物中单PEG的百分 比，来控制单PEG缀合物的比例。单PEG缀合物占约90 %则代表了产量和活性的优良平衡。 如下所述的组合物可能是理想的其中例如至少92%或至少96%的缀合物是单PEG种类。 在本发明的一个实施方案中，单PEG缀合物的百分比为约90%至96%。在本发明的一个实施方案中，PEG化多价多肽中的PEG在羟胺测定(例如450mM 羟胺pH6. 5，室温，8-16小时)中不会从PEG化氨基酸残基水解，因此是稳定的。在一个实 施方案中，组合物的超过80%、更优选至少90%、最优选至少95%是稳定的单PEG-结合多 肽。在另一个实施方案中，PEG化多肽优选将保留与未修饰蛋白质相关的生物学活性 的至少约25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。在一个实施方案中，生物 学活性指其结合靶物分子的能力，以&、1^或1^。 来评估。在一个具体的实施方案中，相对 于未PEG化的结合多肽，PEG化结合多肽蛋白显示出升高的对靶物分子的结合。相对于未修饰的结合多肽的血清清除速率，PEG修饰多肽的清除速率可以降低约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或甚至90%。相对于未修饰蛋白质的半衰 期，PEG修饰多肽的半衰期(t1/2)可以延长。PEG-结合多肽的半衰期可以相对于未修饰的 结合多肽的半衰期延长至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、 125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或 500%、或甚至 1000% 在有些实施方案 中，蛋白质半衰期是在体外测定的，诸如在缓冲盐水溶液中或在血清中。在其它实施方案 中，蛋白质半衰期是体内半衰期，诸如蛋白质在动物的血清或其它体液中的半衰期。多价多肽的去免疫在一个方面，本申请提供去免疫(deimmunized)的多价多肽。在一些实施方案中， 多价多肽的序列经过改变以消除一个或多个B或T细胞表位。多价多肽可以去免疫以使得它对于给定物种无免疫原性或免疫原性降低。去免疫 可以藉由对多肽的结构改变来实现。可采用本领域技术人员知道的任何去免疫技术。例如， WO 00/34317记载了一种合适的用于蛋白质去免疫的技术，将其公开内容完整收入本文。总 的来说，其中所述一般方法内的典型方案包括下述步骤。1.测定多肽的氨基酸序列；
2.通过任何方法来鉴定多肽的氨基酸序列内的潜在T细胞表位，包括测定肽对 MHC分子的结合，测定肽HLA复合物对来自要接受治疗性蛋白质的物种的T细胞受体的结 合，使用具有要接受治疗性蛋白质的物种的HLA分子的转基因动物来测试多肽或其部分， 或测试用来自要接受治疗性蛋白质的物种的免疫系统细胞重建的此类转基因动物；及3.通过遗传工程或其它生成修饰多肽的方法来改变多肽以消除一个或多个潜在 T细胞表位，并生成这样的改变多肽供测试用。在一个实施方案中，可以分析多肽的序列以确定MHC II类结合基序的存在。例 如，可以与MHC结合基序的数据库进行比较，例如通过搜索万维网上sitewehil. wehi. edu. au的“基序”数据库。或者，可以使用计算穿线法(computational threading method) 来鉴定MHC II类结合肽，诸如由Altuvia等(J. Mol. Biol. 249244-250 (1995))设计的穿 线法，测试来自多肽的连续重叠肽对MHC II类蛋白质的结合能。预测结合的计算机算法 (computational bindingprediction algorithms)包括 iTope 、Tepitope、SYFPEITHI、 EpiMatrix(EpiVax)、和MHCpred。为了帮助鉴定MHC II类结合肽，可搜索诸如两亲性和 Rothbard基序等与被成功呈递的肽关联的有关序列特征，及组织蛋白酶B和其它加工酶的 切割位点。鉴定出潜在的(例如人)T细胞表位后，通过改变一个或多个氨基酸(视消除T细 胞表位的需要)来消除这些表位。通常，这会涉及T细胞表位自身内的一个或多个氨基酸 的改变。这可能涉及改变这样的氨基酸，其在蛋白质的一级结构上邻近于所述表位，或者在 分子的一级结构上不邻近但在二级结构中邻近于所述表位。所考虑的通常的改变是氨基酸 替代，但是在某些情况下有可能氨基酸添加或删除是适宜的。所有改变均可通过重组DNA 技术来实现，这样最终的分子可通过重组宿主表达来制备，例如借助已确立的方法，但是也 可使用蛋白质化学或任何其它改变分子的手段。将鉴定出的T细胞表位去除之后，可以对去免疫的序列再次进行分析以确保没有 产生新的T细胞表位，如果有新的T细胞表位，那么可删除该表位。并非所有通过计算鉴定出的T细胞表位都需要消除。本领域技术人员会理解特定 表位的“强度”(或者更恰当的说是潜在免疫原性)的重要性。各种计算方法可为潜在表位 打分。本领域技术人员会理解，只有得分高的表位才可能需要消除。本领域技术人员还会 认识到，消除多肽的潜在表位与维持结合亲和力之间有一种权衡。因此，一种策略是向多肽 中依次地引入替代，然后测试抗原结合和免疫原性。在一个方面，去免疫的多肽在人受试者中的免疫原性比原始多肽要低(或者更恰 当的说，引发更低的HAMA应答)。用于测定免疫原性的测定法完全在熟练技术人员的知识 范围内。可实施本领域公认的测定免疫应答的方法来监测特定受试者中的或临床试验中的 HAMA应答。对施用了去免疫的多肽的受试者可在施用所述疗法开始时和整个期间给予免疫 原性评估。HAMA应答可以例如通过使用本领域技术人员知道的方法，包括表面等离振子共 振技术(BIAC0RE)和/或固相ELISA分析等，测定来自受试者的血清样品中针对去免疫多 肽的抗体来加以测量。或者，设计用于测量T细胞活化事件的体外测定法也能指示免疫原 性。其他修饰在一些实施方案中，多价多肽是糖基化的。Fn3结构域在正常情况下不含有糖基化
26位点，然而，可以将此类糖基化通过工程化改造引入蛋白质。蛋白质的糖基化通常是N-连接或是0-连接的。N-连接指碳水化合物模块连接于 天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-χ-丝氨酸和天冬酰胺-χ-苏氨酸(其中X是除 脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。可以 将这些序列通过工程化改造引入本发明的蛋白质，特别是基于纤连蛋白的支架蛋白及其相 应的多核苷酸中。如此，这两种三肽序列中的任一种在多肽中的存在可产生潜在的糖基化 位点。0-连接的糖基化是指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖等糖类之一连接于羟基氨基 酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向蛋白质中添加糖基化位点是通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三 肽序列(用于N-连接的糖基化位点)而便利地完成的。也可通过向原始抗体的序列中添 加或替换入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于0-连接的糖基化位点)来进行改变。在一些实施方案中，修饰多价多肽以增强抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC) 和/或补体依赖性细胞毒性(⑶C)。在一些实施方案中，多价多肽是进一步包含Fc区的而3 结构域。在一些实施方案中，Fc区是增强ADCC或⑶C的变体。Fc区变体可包含在一个或 多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4Fc 区)。在一个实施方案中，变异的Fc区可以比天然序列Fc区更有效地在人效应细胞 存在下介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，或以更好的亲和力结合Fc伽马受体 (Fe y R)。此类 Fc 区变体可以在 Fc 区的第 256、290、298、312、326、330、333、334、360、378 或430位中的一个或多个处包含氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号方式是如Kabat中的 EU索引的。核酸-蛋白质融合技术在一个方面，本申请提供多价多肽，其包含结合人靶物例如EGFR、VEGFR2、IGF-IR 或其它蛋白质的纤连蛋白III型结构域。一种快速产生并测试具有特定结合特性的而3 结构域的方式是Adnexus (—家Bristol-MyersSquilA研发公司)的核酸-蛋白质融合物 技术。本公开内容描述此类体外表达和标记技术的使用，该技术称作PROfusion ，利用核 酸-蛋白质融合物(RNA-蛋白质融合物和DNA-蛋白质融合物)来鉴定对于结合蛋白质重 要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质融合物技术是一种共价偶联蛋白质与其编码 遗传信息的技术。关于RNA-蛋白质融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的 详细描述参见 Szostak 等，美国专利 No. :6，258，558 ；6，261，804 ；6，214，553 ；6，281，344 ； 6，207，446 ；6，518，018 ；PCT 公开文本号 W000/34784；W001/64942 ；W002/032925；及 Roberts 和 Szostak，Proc Natl. Acad. Sci. 94 12297-12302，1997，通过述及收入本文。关 于核酸-蛋白质融合技术的进一步讨论可见于本申请的实施例及材料和方法部分。载体和多核苷酸实施方案编码本文中所公开的各种蛋白质或多肽之任一的核酸可以化学合成。可以选择密 码子用法以改善在细胞中的表达。此类密码子用法会取决于所选择的细胞类型。已经开 发了用于大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞专门的 密码子用法。参见例如Mayfield 等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2003Jan 21 ； 100 (2) 438-42 ；Sinclair 等，Protein Expr Purif.2002 Oct ；26(1) :96-105 ；Conne11 ND.，Curr
27Opin Biotechnol. 20010ct ； 12(5) :446-9 ；Makrides 等，Microbiol Rev. 1996S印；60(3) 512-38 ；及 Sharp 等，Yeast. 19910ct ；7 (7) :657_78。通用核酸操作技术记载于例如Sambrook等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual, ^ 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 1989, 或 F. Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience =New York, 1987)和定期更新，通过述及收入本文。编码多肽的DNA与 合适的源自哺乳动物、病毒、或昆虫基因的转录或翻译调节元件可操作连接。这样的调节元 件包括转录启动子、任选的操纵基因序列(用以控制转录)、编码合适的mRNA核糖体结合位 点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。还加入在宿主中复制的能力(通常由复制起点 赋予)和选择基因(用以帮助转化子的识别)。本文所述蛋白质可以重组生产，不仅是直接的重组生产，还可以作为与异源多肽 的融合蛋白，所述异源多肽优选是信号序列或其它位于成熟蛋白或多肽的N末端、具有特 异性切割位点的多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别和加工(即被信 号肽酶切割)的异源信号序列。对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，用原核 信号序列替换信号序列，原核信号序列选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒 素II前导序列。对于酵母分泌，可以用例如下述序列替换天然信号序列酵母转化酶前导 序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces) α -因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母(C. albicans)葡糖淀粉酶前导 序列、或PCT公开文本NO.W090/13646中记载的信号。在哺乳动物细胞表达中，有哺乳动物 信号序列以及病毒分泌前导序列(例如单纯疱疹gD信号)可供使用。可以将这样的前体 区域的DNA与编码蛋白质的DNA以符合读码框的方式相连接。表达载体和克隆载体都包含使载体能够在选定的一种或多种宿主细胞中复制的 核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列使载体能够不依赖于宿主染色体DNA而复制，这 种序列包括复制起点或自主复制序列。多种细菌、酵母和病毒的此类序列是公知的。来自 质粒PBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适合于酵母，而各 种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通 常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早 期启动子)。表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下 蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，的抗 性；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用 于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trpl基因(Minchcomb等， Nature 282 :39(1979))。trpl基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(例如ATCC No. 44076 或 PEP4-1)提供了选择标志。Jones,Genetics 85:12(1977)。于是，酵母宿主细 胞基因组中trpl损伤的存在提供了有效的环境用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转 化。类似的，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)被携带Leu2基因的已知质粒 所补足。表达载体和克隆载体通常包含被宿主生物体识别的、与编码本发明蛋白质(例如基于纤连蛋白的支架蛋白)的核酸可操作连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括 PhoA启动子、β -内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂 合启动子(诸如tac启动子)。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的 启动子还将包含与编码本发明蛋白质的DNA可操作连接的Siine-Dalgarno (S. D.)序列。真核细胞的启动子序列是已知的。几乎所有真核基因在位于起始转录的位点上游 大约25至30个碱基处都具有富AT区。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处还 可找到另一种序列，即CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是 AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加polyA尾的信号。所有这些序列合适的插 入真核表达载体。适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启 动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄 糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构 酶和葡糖激酶。其它酵母启动子(它们是诱导型启动子，具有通过生长条件控制转录的额外优 点)有醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油 醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体 和启动子进一步记载于EP专利公开文本No. 73，657。酵母增强子也可以有利地与酵母启动 子一起使用。对于哺乳动物宿主细胞中载体的转录，可通过例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘 病毒、腺病毒(诸如腺病毒幻、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝 病毒和更优选的猿猴病毒40 (SV40))基因组、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子 或免疫球蛋白启动子)、及热休克启动子获得的启动子来控制，条件是这样的启动子应与宿 主细胞系统相容。方便地以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还 包含SV40病毒复制起点。方便地以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即 早期启动子。美国专利No. 4，419，446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿 主中表达DNA的系统。美国专利No. 4，601，978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠 细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见 Reyes等，Nature 297:598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为 启动子。常常通过在载体中插入增强子序列来增加高等真核细胞对编码本发明蛋白质的 DNA的转录。现在知道许多来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和 胰岛素)的增强子序列。然而，典型的是使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40 复制起点晚期一侧的增强子(bpl00-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起 点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv， Nature 297:17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中多价抗体编码序列的5'或3'方 向的位置，但是优选位于启动子的5'方向的位置上。用于真核宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物 体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和(偶尔可从3'端)获得。这些区域包 含这样核苷酸区段，其被转录为编码多价抗体的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段。 一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/110 及其中披露的表 达载体。重组DNA还可包含任何类型的可能对蛋白质纯化有用的蛋白质标签序列。蛋白 质标签的例子包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、或GST标签。与 细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适宜的克隆和表达载体可见于Cloning Vectors :A Laboratory Manual, (Elsevier, New York，1985)，以此通过述及收入其相关公 开内容。使用对宿主细胞适宜的方法将表达构建物导入宿主细胞中，这对本领域技术人员 而言是显而易见的。本领域已知多种用于将核酸导入宿主细胞中的方法，包括但不限于电 穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、或其它物质的转染；微粒轰击；脂转 染；和感染(其中载体是传染剂)。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。合适的细菌包 括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E. coli)或芽孢杆菌 属(Bacilli spp)。酵母(优选来自酵母属物种，诸如酿酒酵母(S. cerevisiae))也可用 于生产多肽。也可采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。关于在昆虫细 胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统的综述见Luckow和Summers，(Bio/Technology, 6 :47， 1988)。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括内皮细胞、C0S-7猴肾细胞、CV-U L细胞、 C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CH0)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T、和BHK细胞系。为了制备纯 化的多肽，培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白。对于许多应用，本文中所公开的许 多多肽的小尺寸会使得大肠杆菌表达成为优选的表达方法。然后从培养液或细胞提取物纯 化蛋白质。适于表达本发明的糖基化蛋白质的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动 物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许 昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。有多种转染用病毒株是公众可获得 的，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-I变体和家蚕NPV的& -5株，而且 此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。在有些情况下会希望在脊椎动物细胞生产蛋白质，诸如为了糖基化，而且培 养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用的哺乳动物宿主细胞 系的例子是用SV40转化的猴肾CVl系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系093或为了 在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J. Gen Virol. 36 :59 (1977))；幼 仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR (CHO，Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216(1980))；小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；猴肾细胞(CVl, ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VER0-76， ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠 (buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(Wl38,ATCC CCL 75)；人肝细胞
30(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51) ；TRI 细胞(Mather 等，AnnalsN. Y. Acad. Sci. 383 :44-68(1982) ；MRC5细胞；FS4细胞；人肝瘤系(Hep G2)；和骨髓瘤或淋巴 瘤细胞(例如Y0、J558L、P3和NSO细胞)(参见美国专利No. 5，807，715)。还可利用棉花、 玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。蛋白质生产用本文所述用于生产蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动 子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。在 本文所示实施例中，用于高通量蛋白质生产(HTPP)和中等规模生产的宿主细胞是HMS174 细菌株。可以在多种培养基中培养用于生产本发明蛋白质的宿主细胞。商品化培养基诸 如 Ham 氏 FlO(Sigma)、极限必需培养基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏 改良的fegle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记 载的任何培养基作为宿主细胞的培养基Ham等，Meth. Enz. 58 :44(1979) ；Barnes等，Anal. Biochem. 102 :255(1980)；美国专利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090/03430 ；WO 87/00195 ；或美国专利No. Re. 30, 985。任何这些培养基可以根 据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如 氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如 GENTAMYCIN 药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和 葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。 培养条件(诸如温度、PH等)为先前表达选用的宿主细胞所用的培养条件，这对于普通技 术人员而言是显而易见的。本文中所公开的蛋白质也可以使用无细胞翻译系统来生产。为了该目的，必须修 饰编码多肽的核酸以容许体外转录产生mRNA，并容许mRNA在所利用的特定无细胞系统(真 核型如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统；或原核型如细菌无细胞翻译系统)中进行无细胞 翻译。本发明的蛋白质也可以通过化学合成来生产(例如使用Solid PhasePeptide Synthesis，第 2 版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford, IL 中记载的方法)。对蛋 白质的修饰也可以通过化学合成来产生。本发明的蛋白质可以通过蛋白质化学领域普遍知道的蛋白质分离/纯化方法来 纯化。非限制性的例子包括抽提、再结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超 滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲 和层析、电泳、逆流分配或这些手段的任意组合。纯化后，可以通过本领域已知的多种技术 (包括但不限于过滤和透析)将多肽更换到不同的缓冲液中和/或浓缩。纯化后的多肽优选是至少85%纯、更优选至少95%纯、最优选至少98%纯。无论 纯度的确切数值如何，多肽对于用作药品是足够纯的。成像、诊断和其它应用在一个方面，本申请提供用可检测模块标记的多价多肽。该多肽可用于各种诊断 应用。可检测模块可以是任何能够直接或间接产生可检测信号的模块。例如，可检测模块 可以是放射性同位素，诸如H3、C14或13、P32、S35、或1131 ；荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明、或萤光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根过氧化 物酶。任何本领域已知的将蛋白质缀合至可检测模块的方法均可以采用，这样的方法包 括 Hunter 等，Nature 144:945(1962) ；David 等，Biochemistry 13:1014(1974) ；Pain 等， J. Immunol. Meth. 40 :219 (1981)；及 Nygren, J.Histochem. andCytochem. 30 :407 (1982)所 记载的方法。体外方法包括本领域众所周知的缀合化学，包括与蛋白质相容的化学，诸如对 特定氨基酸(诸如Cys和Lys)的化学。为了将模块(诸如PEG)连接至本发明的蛋白质， 使用连接基团或反应性基团。合适的连接基团是本领域众所周知的，包括二硫化物基团、硫 醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。取决于应用，优 选的连接基团是二硫化物基团和硫醚基团。对于不含Cys半胱氨酸的多肽，可以通过工程 化在某个位置引入Cys，以便在创建缀合位置的同时容许蛋白质的活性存在。连有可检测模块的多价结合多肽也可用于体内成像。可将多肽与不透射线 (radio-opaque)的药剂或放射性同位素连接，施用给受试者(优选进入血流)，然后测定经 标记的蛋白质在受试者中的存在和位置。这种成像技术在恶性肿瘤的分期和治疗中是有用 的。蛋白质可以用任何在受试者中可检测(通过核磁共振、放射学、或本领域已知的其它检 测手段)的模块来标记。多价多肽也可以用作亲和纯化剂。在这种方法中，使用本领域众所周知的方法将 多肽固定化在合适的支持物上，诸如kphadex树脂或滤纸。多价多肽可用于任何已知的测定法中，诸如竞争性结合测定、直接和间接夹心 测定、禾口 免疫沉淀测定(Zola, Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques,页 147-158(CRC Press, Inc.，1987))。在某些方面，本公开内容提供了用于检测样品中的靶物分子的方法。该方法可包 括使样品接触本文中所描述的多价多肽，其中所述接触在容许多肽-靶物复合物形成的条 件下进行，并检测所述复合物，由此检测所述样品中的所述靶物。检测可使用本领域已知的 任何技术来进行，如放射线照相术、免疫学测定法、荧光检测、质谱、或表面等离子共振。样 品常常会是生物学样品，诸如活检，特别是肿瘤、疑似肿瘤的活检。样品可以来自人或其它 哺乳类动物。多价多肽可以用标记模块，诸如放射性模块、荧光模块、生色模块、化学发光模 块、或半抗原模块来标记。多价多肽可以固定化在固体支持物上。治疗/体内用途在一个方面，本申请提供在病症的治疗中有用的多价多肽。本申请还提供用于对 受试者施用多价多肽的方法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，多价多 肽对于哺乳动物，特别是人而言是药学可接受的。“药学可接受的”多肽指对动物施用时没 有显著的不利医学后果的多肽。药学可接受的多价多肽的例子包括缺少整联蛋白结合域 (RGD)的结构域和基本上不含内毒素或具有很低的内毒素水平的wFM结构域。多价多肽在病症，诸如癌症中特别有用。在一个例示性实施方案中，多价多肽包含 结合两种不同靶物的而3结构域。两种靶物可以在同一信号传导途径内或在两种分开的信 号传导途径内。靶物分子之一可“募集”多价多肽至特定位点，诸如癌细胞，而与第二靶物 分子结合可影响特定信号传导途径。本申请的一个方面提供靶向一种或多种涉及肿瘤生物学的蛋白质诸如例如VEGFR2、IGF-IR、和EGFR的多价多肽。在一些实施方案中，施用多价多肽在体内抑制肿瘤 细胞生长。肿瘤细胞可衍生自任何细胞类型，包括但不限于表皮、上皮、内皮、白血病、肉瘤、 多发性骨髓瘤、或中胚层细胞。异种移植物肿瘤研究中使用的常用肿瘤细胞系的例子包括 A549(非小细胞肺癌)细胞、DU-145(前列腺)细胞、MCF_7(乳腺)细胞、Colo 205 (结肠) 细胞、3T3/]GF-IR(小鼠成纤维细胞)细胞、NCI H441细胞、HEP G2 (肝癌)细胞、MDA MB 231 (乳腺)细胞、HT-29 (结肠)细胞、MDA-MB-435s (乳腺)细胞、U266细胞、SH-SY5Y细 胞、Sk-Mel-2细胞、NCI-H929、RPM18226jPA431细胞。在一些实施方案中，相对于未处理 动物中肿瘤的生长，多肽抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，相对于未处理动物中肿瘤 的生长，多肽将肿瘤细胞生长抑制50、60、70、80%或更多。在一些实施方案中，对肿瘤细胞 生长的抑制是在开始用多肽处理动物后至少7天或至少14天测量的。在一些实施方案中， 与多肽一起给动物施用另一种抗肿瘤剂。在某些方面，本公开内容提供施用多价多肽以治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转 移的方法，其中肿瘤特别优选选自下组脑瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统肿瘤、胃肿瘤、喉 肿瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，不限于这些。在某些方 面，本公开内容提供施用多价多肽以治疗选自下组癌性疾病的疾病的方 法鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、乳腺癌、头癌、颈癌、食管癌、妇科癌 症、甲状腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病。可以与本发明的适宜实施方案一起使用的其他药剂本发明的一个方面提供与细胞毒剂相连的多价多肽。此类实施方案可视情况通过 体外或体内方法来制备。体外方法包括本领域众所周知的缀合方法，包括与蛋白质相容的 化学，诸如对特定氨基酸(诸如Cys和Lys)的化学。为了将细胞毒剂与多肽相连，使用连接 基团或反应性基团。合适的连接基团是本领域众所周知的，包括二硫化物基团、硫醚基团、 酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团是二硫 化物基团和硫醚基团。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过在抗体和细胞毒剂之间形 成硫醚键来构建缀合物。优选的细胞毒剂是美登木素生物碱、紫杉烷和CC-1065类似物。在一些实施方案中，将多价多肽与细菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋 白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、蛋白酶、葡萄球菌肠毒素-A、商陆(pokeweed)抗病毒蛋 白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、Ranpimase(Rap)、Rap (N69Q)、 酶、或荧光蛋白相连。在一些实施方案中，将多价多肽与美登木素生物碱或美登木素生物碱类似物相 连。合适的美登木素生物碱的例子包括美登醇和美登醇类似物。合适的美登木素生物碱披 露于美国专利 No. 4，424，219 ；4，256，746 ；4，294，757 ；4，307，016 ；4，313，946 ；4，315，929 ； 4，331，598 ；4，361，650 ；4，362，663 ；4，364，866 ；4，450，254 ；4，322，348 ；4，371，533 ； 6，333，410 ；5，475，092 ；5，585，499 ；和 5，846，545。在一些实施方案中，将多价多肽与紫杉烷相连。美国专利No. 6，372，738和 6，340，701披露了适合用于本发明的紫杉烷。在一些实施方案中，将多价多肽与CC-1065或其类似物相连。美国专利 No. 6，372，738 ；6，340, 701 ；5，846，545 和 5，585，499 披露了 CC-1065 及其类似物。用于制备此类细胞毒性缀合物的一种令人感兴趣的候选物是CC-1065，其是一种从泽耳链霉菌(Str印tomyces zelensis)培养液中分离得到的强有力的抗肿瘤抗生 素。CC-1065在体外比常用的抗癌药(诸如多柔比星、甲氨蝶呤和长春新碱)强约1000倍 (B. K. Bhuyan 等，Cancer Res.，42，3532-3537 (1982))。细胞毒性药物(诸如甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、 丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、和加利车霉素)也适合于制备本发明的缀合物，而且，也可以通过 中间载体分子(诸如血清白蛋白)将药物分子与多价多肽连接。 在其它治疗性处理或组合物中，将多价多肽与一种或多种其他的治疗剂共同施用 或顺序施用。合适的治疗剂包括但不限于靶向治疗剂、其它靶向生物制品、和细胞毒性或细 胞抑制性药剂。在有些情况下，优选从同一个或各别的、装有液体配制剂的治疗可接受管形 瓶、注射器或其它施用装置中施用药剂。癌症治疗剂指那些旨在杀死癌细胞或限制癌细胞生长同时对患者具有最低限度 影响的药剂。如此，此类药剂可利用与癌细胞的性质(例如代谢、血管化或表面抗原呈递) 与健康宿主细胞相比的任何差异。肿瘤形态学差异是潜在的干预位点例如，第二治疗剂可 以是抗体，如可以用来阻碍实体瘤内部血管化由此减缓其生长速率的抗VEGF。其它治疗剂 包括但不限于辅助剂诸如盐酸格拉司琼(granisetron HCl)、雄激素抑制剂诸如醋酸亮丙 瑞林(leuprolide acetate)、抗生素诸如多柔比星、抗雌激素诸如他莫昔芬、抗代谢物诸如 干扰素α _2a、细胞毒剂诸如紫杉醇、酶抑制剂诸如ras法尼基转移酶抑制剂、免疫调控剂 诸如阿地白介素(aldesleukin)、和氮芥衍生物诸如盐酸美法仑、诸如此类。可以与多价多肽组合以改善抗癌效果的治疗剂包括肿瘤学实践中所使用的多种 药剂(参考文献Cancer, Principles&Practice of Oncology, DeVita, V. Τ. , HelIman, S.，Rosenberg, S. Α.,第 6 版，Lippincott-Raven, Philadelphia，2001)，诸如多西他塞、 帕利他塞、多柔比星、表柔比星、环磷酰胺、曲妥单抗、卡培他滨、他莫昔芬、托瑞米芬、来曲 唑、阿那曲唑、氟维司群、依西美坦、戈舍瑞林、奥沙利钼、卡钼、顺钼、地塞米松、安肽、贝伐 单抗、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、左旋咪唑、伊立替康、依托泊苷、托泊替康、吉西他滨、长春瑞 滨、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑来膦酸盐、链佐星、利妥昔单抗、伊达比星、白消安、苯 丁酸氮芥、氟达拉滨、伊马替尼、阿糖胞苷、替伊莫单抗(ibritumomab)、托西莫单抗、干扰 素a_2b、美法仑、硼替佐米(bortezomib)、六甲蜜胺、天冬酰胺酶、吉非替尼、埃罗替尼、 抗EGF受体抗体(例如西妥昔单抗或panitumab)、伊沙匹隆(ixabepilone)、埃博霉素 (epothilones)或其衍生物、和细胞毒性药物与针对细胞表面受体的抗体的缀合物。优选 的治疗剂是钼剂(诸如卡钼、奥沙利钼、顺钼)、紫杉烷(诸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他 滨、和喜树碱。可以在施用多价多肽之前、同时、或之后施用一种或多种其他的治疗剂。熟练技 术人员会理解，对于每种治疗剂，可能有特定的有利的施用次序。类似地，熟练技术人员会 理解，对于每种治疗剂，施用药剂与本发明的抗体、抗体片段或缀合物之间的时间长度会变 化。配制和施用本申请进一步提供包含本文所述多价多肽的药学可接受组合物，其中所述组合 物基本上不含内毒素。通过将具有期望纯度的所述蛋白质与任选的生理学可接受的载 体、赋形剂或稳定剂(Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol, Α·编(1980))混合，以水溶液、冻干或其它干燥配制剂的形式制备包含多价多肽的治疗用配制 齐U。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓 冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂 (诸如氯化十八烧基二甲基节基铵(octadecyidimethylbenzyl ammonium chloride)；氯 化己烧双胺(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯索氯铵 (benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkylparabens)， 诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚(catechol)；间苯二酚；环己醇；3_戊醇；和间 甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋 白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨 酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合 齐U，诸如EDTA ；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子(salt-forming counter-ions)，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂， 诸如 TTOEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制剂还可含有多于一种治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活 性互补且彼此没有不利影响的化合物。本文中提供了活性化合物组合的例子。这样的分子 以对预定目的有效的量合适的组合存在。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如 分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统 中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类 技术披露于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences，第 16 版，Osol，Α·编(1980)。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实 现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明蛋白质的固体疏 水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例 子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国 专利No. 3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、 可降解的乳酸_乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林构成的可注射微球体)及聚-D-(_)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙 醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶 囊化抗体或免疫偶联物在体内长时间维持时，它们可能因为暴露于37°C的潮湿环境而变性 或聚集，导致生物学活性的损失和可能的免疫原性改变。可以根据相关的机理来设计合理 的稳定化策略。例如，如果发现聚集机理是经由硫醇_ 二硫化物互换的分子间S-S键形成， 那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物 基质组合物来实现稳定化。虽然熟练技术人员会理解每种治疗剂的剂量会取决于药剂本身，但是优选的剂量 范围可以是约IOmg/平方米至约2000mg/平方米、更优选约50mg/平方米至约IOOOmg/平 方米。为了治疗性应用，以药学可接受剂量形式将多价多肽施用于受试者。它们可以静 脉内(作为推注或持续一段时间的连续输注)、肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径施用。蛋白质也可以通过肿瘤内、肿瘤周围、病变内、或病变周围路径施 用，以发挥全部以及全身治疗效果。合适的药学可接受载体、稀释剂、和赋形剂是众所周知 的，而且可以由本领域技术人员根据临床情况来决定。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的 例子包括(I)Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，pH约7. 4，含有约lmg/ml至25mg/ml人血清白 蛋白；(2)0.9%盐水(0.9% w/v NaCl)；和(3)5% (w/v)右旋糖。本发明的方法可以在体 夕卜、在体内、或回体实施。以治疗应用为目的，可以如上所述地进行多价多肽与一种或多种其他治疗剂的施 用(无论是共同施用或者是顺序施用)。熟练技术人员会了解，适合于共同施用的药学可接 受载体、稀释剂和赋形剂取决于共同施用的具体治疗剂本身。在以水性剂型而非冻干剂型存在时，蛋白质通常配制成约0. lmg/ml至100mg/ml 的浓度，但也容许在这些范围以外广泛变化。就疾病治疗而言，多价多肽的适宜剂量将取决 于待治疗疾病的类型(如上文所定义的)、疾病的严重程度和进程、施用抗体是出于预防目 的还是治疗目的、先前疗法的过程、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断等。 合适地以一次性处理或一系列处理的方式施用蛋白质。其他专利参考文献以下别的专利申请和专利中所记载的方法和组合物也包括在本公开内容中 美国专利申请公开文本 No. 20050186203 ；20050084906 ；20050008642 ；20040202655 ； 20040132028 ；20030211078 ；20060083683 ；20060099205 ；20060228355 ；20040081648 ； 20040081647 ；20050074865 ；20040259155 ；20050038229 ；20050255548 ；20060246059 ； 和美国专利No. 5，707, 632 ；6, 818，418 ；和7，115，396 ；及PCT国际申请公开文本 No. W02005/085430 ；W02004/019878 ；W02004/029224 ；W02005/056764 ；W02001/064942 ；和 W02002/032925。通过提述的引证本文以提述方式将所记载的所有文件和参考文献(包括专利文件和网站)个别地 引证到本文件中，如同它们完整地或部分地书面记载在本文件中一样。序列表具有BC、DEJP FG 环(标有下划线)的 10Fn3 (SEQ ID NO 1)VSDVPRDLEVVAATPTSLLI SWDAPAVTVR YYRITYGETGGNSPVQEFTV PGSKST AT ISGLKPGVDYTITVYAV TGRGD SPAS SKP ISINYRT385A08BC 环(SEQ ID NO 2)SffSARLKVAR385A08DE 环(SEQ ID NO 3)PKNVYT385A08FG 环(SEQ ID NO 4)TRFRDYQPV2B BC 环(SEQ ID NO 5)SffRHPHFPTRV2B DE 环(SEQ ID NO 6) PLQPPT
V2B FG 环(SEQ ID NO 7)TDGRNGRLLSIP385A08-Fn-V2B(Ser 尾)(SEQ ID NO 8)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETG GNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ385A08-Fn-V2B(Cys尾)(SEQ ID NO 9)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNS PVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ385A08-GS5(SEQ ID NO :21)-V2B(Ser 尾)(SEQ ID NO 10)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETG GNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ385A08-GS10(SEQ ID NO :22)-V2B (Ser 尾)(SEQ ID NO 11)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTR YYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQV2B-Fn-385A08(Ser 尾)(SEQ ID NO 12)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGET GGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO 2)V2B-Fn-385A08(Cys尾)(SEQ ID NO 13)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGET GGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQV2B-GS5 (SEQ ID NO :21)-385A08 (Ser 尾)(SEQ ID NO 14)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQV2B-GS10(SEQ ID NO :22)-385A08 (Ser 尾)(SEQ ID NO :15)MGVSDVPRDLEVVAATPT SLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYR TEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQV2B (Ser 尾)(SEQ ID NO 16)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ Ser 尾(SEQ ID NO : 17)EIDKPSQ
Cys 尾(SEQ ID NO :18)EIDKPCQ短尾(SEQID NO 19)EIDK 基于Fn 的接头(SEQ ID NO 20)PSTSTSTGS5 接头(SEQ ID NO 21)GSGSGSGSGSGS10 接头(SEQ ID NO 22)GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(GGGGS) 3 (SEQ ID NO 23)GGGGS GGGGS GGGGS(GGGGS)5 (SEQ ID NO 24)GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGSG4SG4SG3SG (SEQ ID NO 25)GGGGSGGGGSGGGSGAT577(SEQ ID NO 26)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQAT580(SEQ ID NO 27)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQV2BShort(SEQ ID NO 28)GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVT DGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ385A08-GPG(SEQ ID NO :32)-V2B(SEQ ID NO 29)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffSAR LKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGVSDVPRDLE VVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSI PISINYRT385A08-GPGPGPG(SEQ ID NO :33)-V2B(SEQ ID NO 30)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGPGPGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT385A08-GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO :34)-V2B(SEQ ID NO 31)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGPGPGPGPGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNS PVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTGPG (SEQ ID NO : 32)GPGPGPG (SEQ ID NO 33)
GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO 34)385A08 核心(SEQ ID NO 35)EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTR FRDYQPISINYRT具有完整N端延伸(标有下划线)的385A08核心(SEQ ID NO 36)MGVSDVPRDL EVVAATPTSLLI Sff SARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISG LKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT具有完整N端延伸(标有下划线)和短尾(标有下划线)的385A08核心(SEQID NO 37) MGVSDVPRDL EVVAATPTSLLI SWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTAT ISG LKPGVDYT I TVYAVTRFRDYQP ISINYRT EIDK具有N端延伸(标有下划线)和Ser尾(标有下划线)的385A08核心(SEQ IDNO
38)VSD VPRDL EVVAATPTSLLI SWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTAT ISGLKP GVDYTI TVYAVTRFRDYQP ISINYRT EIDKPSQ具有N端延伸(标有下划线)和Cys尾(标有下划线)的385A08核心(SEQ IDNO
39)VSD VPRDL EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTAT ISGLKP GVDYTI TVYAVTRFRDYQP ISINYRT EIDKPCQV2B 核心(SEQ ID NO 40)EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTD GRNGRLLSIPISINYRT具有N端延伸(标有下划线)的V2B核心(SEQ ID NO 41)VSD VPRDL EVVAATPTSLL ISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKP GVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT具有N端延伸(标有下划线)和短尾(标有下划线)的V2B核心(SEQ ID NO 42)
MGVSDVPRDL EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYT I TVYAVTDGRNGRLLS IPISINYRT EIDK具有完整N端延伸(标有下划线)和Ser尾(标有下划线)的V2B核心(SEQ IDNO
43)VSD VPRDL EVVAATPTSLL ISWRHPHFPTRYY RI TYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTAT ISGLKP GVDYTI TVYAVTDGRNGRLLS IPISINYRT EIDKPSQ具有完整N端延伸(标有下划线)和Cys尾(标有下划线)的V2B核心(SEQ IDNO
44)VSD VPRDL EVVAATPTSLL ISWRHPHFPTRYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTAT ISGLKP GVDYTI TVYAVTDGRNGRLLS IPISINYRT EIDKPCQ完整N 端延伸(SEQ ID NO 45)MGVSDVPRDLN 端延伸(SEQ ID NO 46)
VSDVPRDLN 端延伸(SEQ ID NO 48)GVSDVPRDLPA3 接头(SEQ ID NO 60)PAPAPAPA6 接头(SEQ ID NO 61)PAPAPAPAPAPAPA9 接头(SEQ ID NO 62) PAPAPAPAPAPAPAPAPA385A08-Fn-V2B (改良 Ser 尾)(SEQ ID NO 63)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQ EFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS385A08-Fn-V2B (改良 Cys 尾)(SEQ ID NO 64)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQ EFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC385A08-PA3 (SEQ ID NO :60)_V2B (改良 Ser 尾)(SEQ ID NO 65)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS385A08-PA3 (SEQ ID NO :60)-V2B (改良 Cys 尾)(SEQ ID NO 66)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC385A08-PA6 (SEQ ID NO :61)_V2B (改良 Ser 尾)(SEQ ID NO 67)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGG NSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS385A08-PA6 (SEQ ID NO :61)-V2B (改良 Cys 尾)(SEQ ID NO 68)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGG NSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC385A08-PA9 (SEQ ID NO :62)_V2B (改良 Ser 尾)(SEQ ID NO 69)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS385A08-PA9 (SEQ ID NO :62)-V2B (改良 Cys 尾)(SEQ ID NO 70)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC改良Ser 尾(SEQ ID NO 71)EGSGS改良Cys 尾(SEQ ID NO 72)EGSGC
实施例 现在参考以下实施例来描述本发明，实施例只是例示性的，并非意图限制本发明。 虽然上文中已经结合具体实施方案详细地描述了本发明，但对本领域技术人员显然能够想 到可以进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。实施例1 多价纤连蛋白支架结构域蛋白，包括数个基于VAkiFM的结合物。生成了多价纤连蛋白支架结构域蛋白的多种构建物。下表给出的是本文所述的构 建物及其SEQ ID NO。
权利要求
1.一种多肽，包含(a)N端结构域，其包含第一纤连蛋白III型第10结构域(kiFM)，其中所述1(1而3结构 域(i)包含环AB、环BC、环⑶、环DE、环EF、和环FG ;(ii)选自环BC、DE和FG中的至少一 个环相对于人1Vr^结构域的相应环的序列具有改变的氨基酸序列；(iii)包含与SEQ ID NO 1至少60%相同的氨基酸序列；且(iv)以小于500nM的Kd结合第一靶物分子；(b)C端结构域，其包含第二纤连蛋白III型第10结构域(kiFM)，其中所述1(1而3结构 域(i)包含环AB、环BC、环⑶、环DE、环EF、和环FG ;(ii)选自环BC、DE和FG中的至少一 个环相对于人lc^n3结构域的相应环的序列具有改变的氨基酸序列；(iii)包含与氨基酸序 列SEQ ID NO 1至少60%相同的氨基酸序列；且(iv)以小于500nM的Kd结合第二靶物分 子；其中所述第一和第二 1(1而3结构域是藉由选自下列的多肽连接的基于甘氨酸-丝氨酸 的接头，基于甘氨酸-脯氨酸的接头，或氨基酸序列SEQ ID N0:20。
2.权利要求1的多肽，其中所述第一kiFM结构域以小于IOOmM的Kd结合第一靶物分 子，且所述第二 kiFM结构域以小于IOOmM的Kd结合第二靶物分子。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述第一和第二1(1而3结构域的环BC和环TO相对于 人wFM结构域的相应环的序列具有改变的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述第一结构域在其C端连接于氨基酸 序列 SEQ ID NO :19ο
5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述第二结构域在其C端连接于氨基酸 序列 SEQ ID NO 17 或 18。
6.权利要求1的多肽，其选自⑴包含SEQ ID NO 8-15和29-31中任一氨基酸序列的多肽；和(ii)包含与SEQ ID NO :8_15和四_31中任一氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列 的多肽。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，进一步包含一个或多个选自下列的药动学(PK)模 块聚氧化烯模块、人血清白蛋白结合蛋白、唾液酸、人血清白蛋白、IgG、IgG结合蛋白、运 铁蛋白、和Fc片段。
8.权利要求7的多肽，其中所述1 模块是聚氧化烯模块，且所述聚氧化烯模块是聚乙
9.权利要求7的多肽，其中所述1 模块和所述多肽是藉由至少一个二硫键、肽键、多 肽、聚合糖、或聚乙二醇模块连接的。
10.权利要求1-5或7-9中任一项的多肽，其中所述第一和第二靶物分子是相同的。
11.权利要求1-9中任一项的多肽，其中所述第一和第二靶物分子是不同的。
12.权利要求1-9或11任一项的多肽，其中所述第一靶物分子是IGF-IR，且所述第二 靶物分子是VEGFR2。
13.权利要求1-9或11任一项的多肽，其中所述第一靶物分子是VEGFR2，且所述第二 靶物分子是IGF-IR。
14.权利要求1-13中任一项的多肽，其中所述多肽已经过去免疫而消除了一个或多个 T细胞表位。
15.权利要求1-14中任一项的多肽，其中所述第一和第二1(1而3结构域是藉由基于甘 氨酸-丝氨酸的接头连接的。
16.权利要求15的多肽，其中所述基于甘氨酸-丝氨酸的接头选自氨基酸序列SEQID NO 21 禾口 22。
17.权利要求1-16任一项的多肽，其中所述第一和第二1(1而3结构域是通过包括下述步 骤的方法选择的a)生成一群候选RNA分子，它们各自包含与人1(ι ^3结构域编码序列不同 的候选1(^n3结构域序列，所述RNA分子各自包含可操作连接于所述候选wFM结构域编码 序列的翻译起始序列和起始密码子且各自可操作连接于3'末端的核酸-嘌呤霉素接头； b)在体外翻译所述候选结构域编码序列以生成一群候选RNA-1(^n3融合物；c)使所 述一群候选RNA-1(^n3融合物与靶物分子接触；并d)选择这样的RNA-wFM融合物，其蛋白 质部分对所述靶物分子的结合亲和力或特异性相对于所述人1Vr^对所述靶物分子的结合 亲和力或特异性有所改变。
18.—种包含权利要求1-17中任一项的多肽的药学可接受组合物，其中所述组合物基 本上不含内毒素。
19.权利要求1-14任一项的多肽，其中所述第一和第二1(1而3结构域是藉由基于甘氨 酸-脯氨酸的接头连接的。
20.权利要求19的多肽，其中所述基于甘氨酸-脯氨酸的接头选自氨基酸序列SEQID NO :32，33，和 34。
21.一种多肽，包含(a)N端结构域，其包含第一纤连蛋白III型第10结构域(kiFM)，其中所述1(1而3结构 域(i)包含环AB、环BC、环⑶、环DE、环EF、和环FG ;(ii)选自环BC、DE和FG中的至少一 个环相对于人1Vr^结构域的相应环的序列具有改变的氨基酸序列；(iii)包含与SEQ ID NO 1至少60%相同的氨基酸序列；且(iv)以小于500nM的Kd结合第一靶物分子；(b)C端结构域，其包含第二纤连蛋白III型第10结构域(kiFM)，其中所述1(1而3结构 域(i)包含环AB、环BC、环⑶、环DE、环EF、和环FG ;(ii)选自环BC、DE和FG中的至少一 个环相对于人lc^n3结构域的相应环的序列具有改变的氨基酸序列；(iii)包含与氨基酸序 列SEQ ID NO 1至少60%相同的氨基酸序列；且(iv)以小于500nM的Kd结合第二靶物分 子；其中所述第一和第二 1(^n3结构域是藉由基于脯氨酸-丙氨酸的多肽接头连接的。
22.权利要求20的多肽，选自⑴包含SEQ ID NO 63-70中任一氨基酸序列的多肽；和(ii)包含与SEQ ID NO :63-70中任一氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的多肽。
23.权利要求21的多肽，其中所述第一靶物分子是IGF-IR且所述第二靶物分子是 VEGFR2。
24.权利要求21的多肽，其中所述第一靶物分子是VEGFR2且所述第二靶物分子是 IGF-IR0
全文摘要
本发明涉及包含至少两个藉由多肽接头连接的纤连蛋白支架结构域的多价多肽。本发明还涉及供诊断、研究和治疗应用中使用的多价多肽。本发明进一步涉及包含此类蛋白质的细胞、编码此类蛋白质或其片段的多核苷酸、及包含编码该新蛋白质的多核苷酸的载体。
文档编号C07K14/78GK102099373SQ200980127966
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月21日 优先权日2008年5月22日
发明者H.N.马什, 埃里克.普法恩, 欧维思.M.卡瓦杰尔, 理卡多.M.阿塔, 琼.卡博尼, 雷.坎普豪森, 马科.M.戈塔迪斯 申请人:百时美施贵宝公司