利用白介素-21受体结合蛋白的治疗方法

专利名称：利用白介素-21受体结合蛋白的治疗方法
利用白介素-21受体结合蛋白的治疗方法相关申请本申请要求2008年5月28日提交的美国临时专利申请No. 61/055，543和2008 年9月23日提交的美国临时专利申请No. 61/099, 476的优先权,通过述及将其内容完整收 入本文。本发明涉及结合白介素-21受体(IL-21R),特别是人IL-21R的结合蛋白及其抗 原结合片段，及其在调节IL-21R相关活性(例如IL-21对IL-21响应性基因表达水平的影 响)中的用途。本文中公开的结合蛋白在治疗和/或诊断IL-21R相关病症例如炎性病症、 自身免疫性疾病、变态反应(al lergies)、移植排斥、高增殖性血液病症、和其它免疫系统病 症中有用。本发明进--步提供用于测定本发明抗体的药效学和药动学特性的方法。
背景技术：
抗原激起免疫应答并激活最大的两群淋巴细胞T细胞和B细胞。遭遇抗原后，T 细胞增殖并分化成效应器细胞,而B细胞增殖并分化成抗体分泌浆细胞。这些效应器细胞 分泌和/或响应细胞因子,细胞因子是由淋巴细胞和其它细胞类型分泌的小蛋白质(小于 约 30kDa)。人IL-21是与IL-2、IL-4和IL-15显示序列同源性的细胞因子(Parrish-Novak 等Q0(K))NatUre 408 :57-63)。尽管白介素细胞因子间序列同源性低，但是细胞因子分享 共同的折叠，折叠成该家族代表性的“四螺旋束”结构。大多数细胞因子结合I类或II类 细胞因子受体。II类细胞因子受体包括IL-10和千扰素的受体，而I受细胞因子受体包括 IL-2至IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、和IL-15以及造血生长因子、瘦蛋白、和生长激素 的受体(Cosraan (1993) Cytokine 5 :95-106)。人IL-21R是I类细胞因子受体。编码人IL-21及其受体(IL-21R)的核苷酸和氨基 酸序列记载于国际申请公幵号WO 00/053761和WO 01/085792 ；Parrish-Novak等(2000) 出处同上；及 Ozaki 等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :11439-44。IL-21R 与 IL-2 受 体β链和IL-4受体α链具有最高的序列同源性(Ozaki等(2000)出处同上)。在配体结 合时，IL-21R与IL-2、IL-3、IL_4、IL_7、IL_9、IL-13和IL-15的受体复合物分享的共同伽 马细胞因子受体链(Y c)联合(Ozaki等(2000)出处同上；Asao等(2001) .J. Immunol. 167 IL-21R在淋巴样组织中，特别是在T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细 胞(DC)和巨噬细胞上表达(Parrish-Novak等(2000)出处同上)，这容许这些细胞响应 IL-21 (Leonard and Spolski (2005) Nat. Rev. Immunol. 5 :688-98)。IL-21R 的广泛淋巴样 分布指示IL 21在免疫调节中发挥重要作用。体外研究显示了 IL-21显著调控B细胞、 CIM+和CDS+T细胞、及NK细胞的功能(Parri sh-Novak等(2000)出处同上；Kasaian等 (2002) Immunity 16 =559-69) 最新的证据提示IL-21介导的信号传导可具有抗肿瘤活性 (Sivakumar等Q004) Immunology 112 :177-82)，而且IL-21能在小鼠中预防抗原诱导的消除(Shang 等(2006)Cell. Immunol. 241 :66-74)。在自身免疫中,破坏IL-21基因和注射重组IL-21显示出分别调控实验性自身免 疫性重症肌无力(EAMG)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发展(King等Q004)Cell 117 :265-77 ；Ozaki 等(2004) J. Immunol. 173 :5361-71 ；Vollmer 等(2005) J. Immunol. 174 2696-2701 ；Liu 等(2006) J. Immunol. 176 6247-54)。在这些实验系统中，提示操纵丨丄-21 介导的信号传导直接改变CD8+细胞、B细胞、T辅助细胞、和NK细胞的功能。如此，本发明提供通过阻断IL-21信号传导途径来起作用，用于治疗例如自身免 疫性疾病的新治疗剂，即抗IL-21R抗体。为了使治疗剂(诸如抗IL-21R抗体)在体内有 效,应当测定调控丨丄-21应答所必需的抗IL-21R抗体最小血清浓度；因此,需要容许精确测 定此类最小血清浓度的方法。发明概述本发明描述了特异性结合人和鼠IL-21R的结合蛋白例如人抗体及其片段的分离 和表征。本文中描述的结合蛋白衍生自抗体18A5，其披露于美国专利No. 7，495，(招5，通过 述及将其全部收入本文。本发明的结合蛋白具有程度比亲本18A5抗体大得多的对人和！ 或鼠IL-21R的亲和力。本发明至少部分提供以高亲和力和特异性结合IL-21R，特别是人IL-21R的 IL-21R结合剂(诸如结合蛋白及其抗原结合片段)。本发明的结合蛋白及其抗原结合片段 在本文中也分别称作“抗IL-21R结合蛋白”及“其片段”。在一个实施方案中，结合蛋白或 其片段降低、抑制、或拮抗IL-21R活性。此类结合蛋白可用于通过拮抗IL-21R活性来调节 免疫应答或IL-21R相关病症。在其它实施方案中，抗IL-21R结合蛋白可用于诊断，或作为 靶向结合蛋白用于将治疗剂或细胞毒剂投递至IL-21R表达细胞。如此,本发明的抗IL-21R 结合蛋白在诊断和治疗IL-21R相关病症例如炎性病症、自身免疫性疾病、变态反应、移植 排斥、血液高增殖性病症、和其它免疫系统病症中有用，如本文中更完整描述的。因而,在一个方面，本发明的结合蛋白特征为一种结合IL-21R，特别是人IL-21R 的分离的结合蛋白(例如分离的抗体)或其抗原结合片段。在某些实施方案中,抗IL-21R 结合蛋白(例如抗体)可具有一项或多项下述特征(1)它是单克隆或单特异性结合蛋白； (2)它是人结合蛋白；(3)它是体外生成的结合蛋白；(4)它是体内(例如转基因小鼠系统) 生成的结合蛋白；(5)它抑制IL-21结合IL-21R;(6)它是IgGl ; (7)它以至少约IO5M1s1 的结合常数结合人IL-21.R ； (8)它以至少约SxlO4M-1S-1的结合常数结合鼠IL-21R ； (9)它 以约KTV1或更少的解离常数结合人IL-21R ； (10)它以约KT2P或更少的解离常数结合 鼠IL-21R ;(11)它以约1. 75nM或更少的IC5q抑制人IL-21R介导的人IL-21R表达性BaF3 细胞增殖；(12)它以约0. 5nM或更少的IC5tl抑制鼠IL-21R介导的鼠IL-21R表达性BaF3 细胞增殖；(13)它以约14. OnM或更少的IC50抑制人IL-21.R介导的人IL-21R表达性TFl 细胞增殖；(14)它以约1.9nM或更少的IC5ci抑制IL-21介导的人原代B细胞增殖；(15) 它以约1. 5nM或更少的IC50抑制IL-21介导的人原代CD4+T细胞增殖；(16)它以约5. OnM 或更少的IC5tl抑制IL-21介导的鼠原代CD4+T细胞增殖；(17)它在例如静脉内(i. v.)施 用于动物(例如哺乳动物,例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约().1^7. Sral/ hr/kg的均值总身体清除；(18)它在例如i. v.、皮下(s. c.)、或腹膜内(i. p.)施用于动物 (例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约20-700小时的均值消除半衰期；(19)它在动物(例如哺乳动物,例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)中具有约 40-1500ml/lig的均值稳态分布体积；(20)它在例如s. c.施用于动物(例如哺乳动物,例如 人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约35-100%的生物利用度；Ql)它在例如i. v.、 s.c.、或i. p.施用于动物(例如哺乳动物,例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有 约200-10，000 μ g*hr/ml (每lmg/kg剂量)的均值剂量标准化AUC ； (22)它在例如i. v.、 s. c.、或i.p.施用于动物(例如哺乳动物,例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有 约0. 5-30 μ g/ml的均值剂量标准化Cmax (最大血清浓度)；和(23)它调控IL-21响应性细 胞因子或IL-21响应性基因的表达。本发明的结合蛋白(术语“结合蛋白”根据需要还包括及指其抗原结合片段) 的非限制性例示性实施方案在本文中称作AbA-AbZ,而且这些术语与美国临时专利申请 No. 61/055，543中使用的术语的关系呈现于表2A。本发明的结合蛋白的其它例示性实施方 案，即scFv，在本文中称作H3-H6、Li-L6、L8-L21、和L23-L25,如表2B中详述的。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白是抗体。在进一步的实施方案中,抗体是多 克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、人的、单链的、嵌合的、 合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的(grafted)、体外生成的和/或多特异性的(例如自 至少两种完整抗体形成的双特异性抗体)。本发明的一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21.R相关病症的方法,包括 以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合 蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段 包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO :14,16, 18, 20, 22，24, 26, 28, 30, 32，34, 36, 38, 40, 42，44,46, 48, 50, 52，54, 56, 58,60, 62，64, 66, 68, 70，72，74，76，78，80，82,84, 86，88，90，92，94，96,98,100，102’ 104，106’ 108，110’ 112， 114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142,144，146,148，150， 152,154,156,158,160,162,165-168,171-193,213-229,240,242,244,246,和 248。在本发明的实施方案中，所述结合蛋白或抗原结合片段可以是例如抗体、scFv、 VH、VL、和 / 或 CDR。本发明的另一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包 括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结 合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片 段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸序列编码的氨基酸 序列SEQ ID NO :13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51， 53, 55, 57, 59, 61,63, 65，67，69, 71, 73, 75, 77, 79, 81，83，85, 87,89, 91,93, 95，97, 99,101’ 103,105，107,109，111,113，115,117，119,121，123,125，127,129，131,133,135,137,139， 141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和 247。在本发明的一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种选自下组的 氨基酸序列:SEQ ID NO :14,16,18, 20，22, 24, 26, 28，30, 32, 34, 36，38,40,42,44，46,48,240, 242, 244, 246,和 248。 本发明的另一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法,包 括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结 合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片 段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO :6,
60
10，12，14’ 16’ 18，20，22，24，26，28，30, 32, 34，36，38，40，42，44, 46,48，50，52，54，56，58， ，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106， 108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130,132，134,136，138,140，142，144， 146,148,150’ 152,154,156,158,160,1.62-1.95, 213-229, 240, 242, 244, 246,和 248,且其中， 如果所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自下组的序列至少约95%相同的氨 基酸序列=SEQ ID NO 6,8,10,12，163,164,169,170,194,和195，那么所述结合蛋白或抗 原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列 SEQ ID KO 14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36，38,40,42,44,46,48,50,52,54,56, 58，60，62，64，66, 68，70，72，74，76, 78，80，82，84，86, 88，90，92，94，96, 98，100，102’ 104， 106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134,136，138，140,142， 144，146，148，150，152，154，156，158，160,162，165-168，171-193，213-229，240,242，244, 246,和 248。本发明的另一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法,包 括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的 结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合 片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸序列编码的氨基 酸序列SEQ ID NO :5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43, 45，47,49，51,53，55，57,59，61，63，65，67,69，71，73，75，77,79，81，83，85，87,89，91，93， 95,97,99,101，103，105，107，109，111,113，115，117，119，121，123,125，127，129，131，133, 135，137,139，141,143，145,147，149,151，153,155，157,159，161, 239，241, 243, 245,和 M7,且其中，如果所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的序列至少约 95%相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列SEQ ID N0:5，7，9，和11，那么所述结合蛋白或 抗原结合片段必须还包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸 序列编码的氨基酸序列=SEQ ID NO :13,15,17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 81, 38, 35, 37, 89,41, 43, 45，47，49，51，53, 55，57，59，61，63,65，67，69,71，73,75，77，79,81，83，85，87，89,91， 93,95,97,99,101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131， 133,135，137,139，141,143，145,147，149,151，153,155，157，159，161，239，241，243，245， 和 247。在本发明的一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种选自下组 的氨基酸序列:SEQ ID NO :6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，组的序列至少约95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :6，8，10,12，163，164，169，170，194， 和195,那么所述结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少--种与选自下组的氨基酸序列 至少约 95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO 14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38， 40, 42，44, 46, 48，50, 52，54, 56, 58，60, 62, 64, 66,68，70, 72, 74, 76, 78，80, 82, 84, 86, 88， 90,92,94,96,98,100，102,104,106,108,110,112，114，116,118,120,122,124,126，128， 130，132，134，136，138，140，142,144，146,148，150，152，154，156，158，160，162，165-168， 171-193,213-229,240，242，244，246，和 248。本发明的又一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包 括对受试者施用特异性结合IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 其抗原结合片段包含轻链和重链,且其中该重链包含至少一种选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO 14,16，18，20，68，70，72，88，90，92，94，213，218，219，240，和 242。在一个实施方案 中，结合蛋白或抗原结合片段包含\域和Vh域，且该Vh域包含至少一种选自下组的序列 SEQ ID NO 14,16,1.8,和 20。本发明的另--个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法,包 括对受试者施用特异性结合IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 其抗原结合片段包含轻链和重链,且其中该轻链包含至少一种选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO :22, 24，26, 28, 30, 32, 34，36, 38, 40, 42，44, 46, 48, 50，52, 54, 56, 58，60, 62, 64, 66， 74,76，78，80，82，84,86，96，98，100，102，104,106，108，214-217，220-229，244,246，和 248。在一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含\域和Vh域，且该\域包含至 少一种选自下组的序列:SEQ ID NO :22，24，26，沘，30，32，34，36, 38，40，42，44,46，48，50， 52, 54, 56, 58，60,62,64,66，215,217,221,223,225,227,和 229。在本发明方法的另--个实施方案中，重链包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO :88，90，92，94，213，218，219，240，和242，且轻链包含选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO :96,98,100,102,104,106，108，214，216，220，222，224，226，228，244，246，和 248。本发明的一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21.R相关病症的方法,包括 以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合选自下组的结合 蛋白识别的人IL-21R表位的结合蛋白或其抗原结合片段AbA-AbW，H3-H6, L1-L6，L8-L21, 和L23-L25,由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或抗原结合片段竞争性抑制选 自下组的结合蛋白结合人IL-21.R =AbA-AbW, H 厂H6, Li-L6, L8-L21,禾口 L23-L25。在另一个 实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段包含重链、轻链、或Fv片段,其包含选自下组的氨 基酸序列:SEQ ID NO :14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50， 52, 54，56，58,60, 62,64, 66,68, 70，72，74, 76, 78,80, 82, 84，86，88,90, 92,94, 96,98,100, 102，104,106，108,110，112,114，116,118，120,122，124,126,128,1.30,132,134,136,138, 140’142，144’146，148’150，152’154,156’158，160’162，165-168，171-193，213-229，240’ 242，244，246，和M8。在又一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段包含重链、轻链、 或Fv片段，其包含由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列SEQ ID NO 13,15,17,19, 21, 23, 25，27, 29, 31, 33, 35，37, 39, 41,43, 45，47, 49, 51, 53, 55，57, 59, 61，63, 65，67, 69, 71，73，75，77，79，81，83,85,87，89，91，93，95，97，99,101,103,105，107，109，111’ 113’ 115， 117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143,145，147,149，151，153，155,157,159,161, 239, 241, 243, 245,和247。在又一个实施方案中，结合蛋白特异性结合受 AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、AbV^P /'或 AbW 识别的 IL-21R 表位，且其中所述结合蛋 白竞争性抑制 AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、AbV、和 / 或 AbW 对人 IL-21R 的结合。在本发明方法的一个实施方案中，IL-21R相关病症选自下组自身免疫性病症、 炎性状况、变态反应、移植排斥、和血液高增殖性病症。在另一个实施方案中，IL 21R相关 病症选自下组免疫性病症、血液高增殖性病症、移植排斥、移植物抗宿主病、变态反应(包 括特应性变态反应)、糖尿病、关节炎病症(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、 骨关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎)、脊椎关节病、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无 力、系统性红斑狼疮(SLE)、皮肤红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎、 湿疹性皮炎)、银屑病、斯耶格伦(SjSgren)氏综合症、IBD(包括克罗恩(Crohn)氏病、溃疡 性结肠炎)、哮喘(包括内源性哮喘、变应性哮喘)、硬皮病和血管炎。在又一个实施方案 中，IL-21R相关病症选自下组多发性硬化、系统性红斑狼疮、银屑病、移植排斥、类风湿性 关节炎、和其它关节炎病症。在本发明方法的一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段对人IL-21R的结 合常数为至少KfM1sΛ在另一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段以约1. 75ηΜ或 更少的IC50抑制]丄-21介导的BAF3细胞增殖，其中所述BAF3细胞包含人]丄-21受体。在 另一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段以约14ηΜ或更少的ICm抑制IL-21介导的 TFl细胞增殖，其中所述Τ 1细胞包含人IL-21受体。在又一个实施方案中，结合蛋白或其 抗原结合片段以约1.9ηΜ或更少的IC5。抑制IL-21介导的原代人B细胞增殖，其中所述B 细胞包含人IL-21R。在又一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段以约1. SnM或更少 的IC5。抑制IL-21介导的原代人CD4+细胞增殖,其中所述CD4+细胞包含人IL-21R。在本 发明的进一步实施方案中，在本文中提供这些参数和其它药动学和药效学参数的其它范围 和数值。在一个实施方案中，本发明提供一种确定抗IL-21R抗体是否是治疗性抗IL-21R 抗体的方法，包括下述步骤使来自受试者的第--血液样品与IL-21配体接触；测定与 IL-21配体接触的第一血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平；在抗IL-21R抗 体存在下使来自受试者的第二血液样品与IL-21配体接触；测定在抗IL-21R抗体存在下 与IL-21配体接触的第二血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平；并比较上文 测定的至少一种IL-21响应性基因的表达水平,其中至少一种IL-21响应性基因表达水平 的变化指示该抗IL-21R抗体是治疗性抗体。在本发明的另一个实施方案中，受试者是哺乳 动物,例如猴或人。在另一个实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因选自下组TNF， IFKy , IL-6, IL-8, IL 1(), CDl9, STAT3, TBX21, CSFl, GZMB, PRFl, IL-2Ra ,和 IL-21R。在 又一个实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因是IL-2Ra。在一个实施方案中，本发明提供一种测定抗IL-21R抗体的药效活性的方法，包括 检测受试者的血液样品中至少一种IL-21响应性基因表达水平的调控。在一个进一步的实 施方案中，检测至少一种IL-21响应性基因表达水平的调控包括下述步骤对受试者施用 抗IL-21R抗体,其中所述受试者用所述抗IL-21R抗体处理；使来自用所述抗IL-21R抗体 处理的所述受试者的血液样品与IL-21配体接触；测定来自用所述抗IL-21R抗体处理的所 述受试者并与所述IL—21配体接触的所述血液样品中至少一种IL—21响应性基因的表达水平；并比较上文测定的至少一种IL 21响应性基因的表达水平与与IL 21配体接触的不同 血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平,其中所述不同血液样品来自未用所述 抗IL-21R抗体处理的受试者。在本发明的另一个实施方案中，受试者是哺乳动物，例如猴 或人。在另一个实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因选自下组TNF，IFN y , IL_6， 丨丄-8, I10, CDl9, STAT3, FBX21, CSFl, GZMB, PRFl，IL-2R α，和 IL-21.R。在又一个实施方案 中，所述至少一种IL-21响应性基因选自下组:CD19, GZMB, PRFl, IL_2Ra , IFN γ ,和IL-6。 在另一个进一步的实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因是IL-2Ra。在一个实施方案中，本发明提供在受试者中降低、抑制、或减弱急性期应答的方 法,包括以足以降低、抑制或减弱受试者中急性期应答的量对受试者施用特异性结合人 IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种 与选自F组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :14,16,18,20,22,24, 26, 28, 30, 32, 34, 36，38,40, 42, 44, 46，48, 50, 52, 54, 56，58, 60, 62,64, 66，68, 70, 72，74, 76，78,80, 82,84, 86, 88，90，92,94, 96,98,100，102,104，106,108，110,112，114,1.16，118, 120，122，124,126，128，130’ 132，134’ 136，138’ 140，142’ 144,146’ 148，150’ 152，154’ 156， 158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。在一个进一步的实施 方案中，结合蛋白或其抗原结合片段是局部施用的。本发明的一个实施方案是提高用于免疫受试者的疫苗配制剂的功效的方法,包括 对受试者施用治疗有效量的特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段,其中所 述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的 氨基酸序列:SEQ ID NO :14,16，18, 20, 22，24, 26, 28, 30，32, 34, 36, 38，40，42,44,46,48， 50, 52, 54, 56, 58，60,62, 64, 66, 68，70, 72, 74, 76, 78，80, 82, 84，86, 88，90, 92, 94，96, 98， 100，102’ 104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136， 138，140，142,144,146，148,150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213—229， 240，242，244，246，和248。在一些实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段是在免疫之前、 期间和/或之后施用的。本发明的另一个实施方案提供用于在体外检测样品中IL-21R的存在的方法,包 括(a)使样品与特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段接触；并(b)检测结 合蛋白或其抗原结合片段与样品之间复合物的形成，其中样品中复合物形成相对于对照或 参照样品或水平的显著差异指示该样品中存在HlR,且其中所述结合蛋白或其抗原结合 片段包含至少一种与选自下组的氨基酸至少约95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO 14,16, 18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66， 68，70，72，74，76, 78, 80，82，84，86，88，90，92,94, 96，98，100，102，104，106，108，110，112, 1.14，116,118，120,122,124,126,128,1.30,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150, 152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。在-一个 进一步的实施方案中，样品是血清、血浆、或组织。本发明的又一个实施方案提供用于在体内检测IL-21R的存在的方法，包括 (a)在容许结合蛋白或其抗原结合片段结合IL-21R的条件下对受试者施用特异性结合人 IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段；并(b)检测结合蛋白或其抗原结合片段与IL-21R 之间复合物的形成，其中受试者中复合物形成相对于对照或参照样品或复合物形成水平的显著差异指示存在IL-21R,且其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自 下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO 14，16,18，20，22，24, 26， 28，30，32, 34，36，38，40，42, 44，46，48，50，52, 54，56，58，60，62, 64，66，68，70，72, 74，76， 78,80，82，84，86，88，90, 92,94，96，98，100，102,104,106，108，110，112，114，116,118，120， 122,124，126,128，130,132，134,136，138,140，142,144，146,148,150,152,154,156,158, 160’ 162,165-168,171-193, 213-229, 240, 242, 244, 246,和 248。在一些实施方案中，结合蛋 白或其抗原结合片段用可检测物质直接或间接标记以便于结合的或未结合的抗体的检测。 在进一步的实施方案中，可检测物质是酶、辅基、荧光材料、发光材料、或放射性材料。在一些实施方案中,本发明提供的方法进一步包括对受试者施用另一种选自下组 的治疗剂细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、 细胞毒剂、和细胞抑制剂。在进一步的实施方案中，治疗剂选自F组=TNF拮抗剂、IL-12拮 抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-19拮抗剂、IL-20拮抗剂、IL-21拮 抗剂、IL-28拮抗剂、T细胞消减剂、B细胞消减剂、甲氨蝶呤、来氟米特、西罗莫司(雷帕霉 素)或其类似物、COx2抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAIDjP p38抑制剂。如在本发明的其它方 法中，在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。本发明的另一个实施方案提供用于测量、测定、和/或评估抗产品抗体(例如针对 抗IL-21R结合蛋白及其抗原结合片段的抗产品抗体)的生成水平的方法。本公开的别的方面会在说明中部分列出，而且根据说明会部分显而易见,或者通 过实践本发明可学会。本发明在权利要求中列出和具体指出，而且本公幵不应解释为限制 权利要求的范围。下面的详细说明包括本发明各种实施方案的例示性呈现,它们对于要求 保护的发明不是限制性的。附图构成本说明书的一部分,而且与说明一起只用来例示实施 方案,而非限制本发明。附图简述

图1 (a-c)描绘scFv对人IL-21R-BaF3细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv 混合，然后与100pg/ml人IL-21 —起温育。48小时后通过CELLTITER GLO (Promega Corporation, Madison, WI) 测量增殖。图2 (a-c)描绘scFv对人IL-2IR-TFl细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv混合， 然后与lOOpg/ml人IL-21 一起温育。48小时后通过CELLTITER-GLO 测量增殖。图3 (a-c)描绘scFv对鼠IL-21R-BaF3细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv混 合,然后与400pg/na鼠IL-21 —起温育。48小时后通过CELLTITER-GLO 测量增殖。图4 (a-c)描绘scFv与亲本抗体18A5 IgG竞争对鼠IL-21R的结合。将scFv与 生物素化的鼠IL-21R H/F混合,并将混合物添加至在ELISA板上固定化的抗体1.8A5。用 HRP-链霉亲合素检测mIL-21R捕捉,并以A450信号的降低指示mIL_21R结合的竞争。图5描绘21对重链/轻链对IL-21依赖性增殖的中和。将图中所示抗体添加至细 胞。随后添加IL-21，并在48小时后用CELLTITER GLO 测量增殖。对人IL-21R-BaF3细 胞用 100pg/inl 人丨丄-21 (图 5a-c)、对人 IL-21R-TFl 细胞用 100pg/inl 人丨丄-21 (图 5d-f)、 或对鼠IL-21R-BaF3细胞用400pg/ml鼠IL-21 (图5g_i)来进行测定。图6描绘21种抗IL-21R IgG对瞬时表达人IL_21R(图6a_c)、大鼠IL_21R(图 6d-f)、猕猴IL-21R(图6g—i)、和人伽马共同链(图6j-1)的CIIO细胞的结合。用IL-21R或对照伽马共同链瞬时转染CHO细胞,并在基于细胞的ELISA中用HRP偶联的抗人IgG测
量结合。图7(a_c)描绘特定抗 IL-21R 抗体(图 7a，AbS ；图 7b，AbQ、AbT、AbO ；图 7c， AbR、AbP、和AbU)的结合特异性，这是通过表面等离振子共振测量得出的。在抗人IgG上 捕捉抗 IL-21R 抗体，并在 BIACORE 仪器(GE Healthcare, Piscataway, Nj)中测量随后 对鼠IL-21R-H/F、人IL-13-H/F、人IL-2R^、或人可溶性IL-4R任--的结合。图7d显示人 ILIR β和人可溶性IL-4R分别被特异性抗IL-观β和抗IL-4R抗体所捕捉(对照)。图8 (a-d)描绘抗IL-21R抗体对人和鼠IL-21R的结合。在BIACOREtm芯片上固定 化的抗人IgG上捕捉所示人抗IL-21R抗体。让不同浓度的人IL-21R-His/FLAG(图8a b) 和鼠IL-2IR-His/FLAG(图8c-d)流过芯片，并监测结合和解离。图9描绘抗IL-21R抗体对人和猕猴IL-21R的结合。在BIAC0RE 芯片....Ll固定化 的抗人IgG上捕捉人抗IL-21R抗体AbS和AbT。让不同浓度的人和猕猴IL-21R-His/FLAG 流过芯片，并监测结合和解离。图9a显示猕猴IL-21R-His/FLAG结合至AbS0图9b显示 人IL-21R-His/FLAG结合至AbS。图9c显示猕猴IL-21R-His/FLAG结合至AbT。图9d显 示人 IL-21R-His/FLAG 结合至 AbT。图10描绘IL-21R抗体的表位评估。在图IOa所示实验中(还可见Y轴左边的图 解)，通过BIACORE 芯片上固定化的抗IL-21.R抗体AbS来捕捉鼠IL-21R-H/F (Hi s-Flag融 合蛋白)。使别的抗IL-21R抗体(AbS、AbT、D5 (D5-20，一种中和性抗鼠IL-21R抗体)、和 7C2(—种非中和性抗鼠IL-21R对照抗体))流过芯片，并监测它们对捕捉到的IL-21R-H/F 的结合。在图IOb所示实验中，通过BIACORE 芯片上固定化的抗IL-21R抗体AbS来捕捉 人IL-21.R-H/F。使别的抗IL-21.R抗体(AbS, AbT、和9D2( —种非中和性抗人IL-21.R对照 抗体))流过芯片，并监测它们对捕捉到的IL-21R-H/F的结合。图11描绘所示抗体对人IL-21R-BaF3细胞和鼠IL_21R-BaF3细胞增殖的中和。 将抗体添加至细胞。随后添加IL-21,并在48小时后用CELLTITERGLO 测量增殖。对人 IL-21R-BaF3 细胞用 l()0pg/ml 人]丄-21 (图 Ila)、对鼠 IL-21.R-BaF3 细胞用 200pg/ral 鼠 IL-21 (图lib)、及对人IL-2IR-TFl细胞用lOOpg/ml人IL-21 (图lie)来进行测定。图12描绘对人原代B细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与抗CD40抗体和人IL-21 一起将所示抗体添加至原代人B细胞。3天后测量3I卜胸苷掺入。图1 描绘AbQ、AbR、 AbS、AbT、AbU、]丄-1.3三重突变体、和18A5亲本抗体之间的比较；图12b描绘AbT、AbV、AbW、 AbU、和人IgGl对照(hlgl)之间的比较。图13描绘对人原代CD4+T细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与人IL-21 —起将 所示抗体添加至活化的原代人CD4+T细胞,并在3天后测量3Ih胸苷掺入。图14描绘对鼠原代CD8+T细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与人IL-21 —起将 所示抗体添加至活化的原代鼠CD8+T细胞,并在3天后测量3H-胸苷掺入。图15描绘由抗IL-21R抗体诱导的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测量。通 过碘化丙啶掺入来测量经所示抗IL-21R抗体包被的CFSE标记的BJAB细胞的PBMC依赖性 杀伤。包括抗 CD20 抗体利妥昔单抗(RITUXAN , Genentech, Inc. , South San Francisco, CA)作为阳性对照,而且包括抗IL-13抗体作为阴性对照。图化描绘抗IL-21R抗体的补体Clq结合。在ELISA板上固定化所示抗IL-21R抗体，并在与人血清一起温育后，用鸡抗人Clq和HKP偶联的抗鸡IgY抗体测量Clq结合。 包括抗CD20抗体利妥昔单抗(RITUXAN )作为阳性对照，并包括抗IL-13抗体作为阴性 对照。图17(a-c)描绘八匕0的氨基酸序歹丨」，包括￥11和￥1域丄01 (111，112,113儿1丄2，和[3)、 和恒定区。图18(a-c)描绘AbR的氨基酸序列，包括VH和VL域、CDR(Hl,H2,H3,Ll,L2,和L3)、 和恒定区。图19 (a-c)描绘 AbW 的氨基酸序列，包括 V1^n Vl域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2,和 L3)、 和恒定区。图20 (a-c)描绘 AbS 的氨基酸序列,包括 Vh 和 Vl 域、CDR (HI, H2, H3, Ll, L2,和 L3)、 和恒定区。图 21 (a-c)描绘 AbT 的氨基酸序列，包括 V11 和 Vl 域、CDR (Hl，H2,113, Ll，L2，和 L3)、
和恒定区。图22 (a-c)描绘 AbO 的氨基酸序列，包括 V11 和 Vl 域、CDR(HI, H2, H3, Ll, L2,和 L3)、 和恒定区。图23 (a-c)描绘 AbP 的氨基酸序列，包括 V1^D Vl域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2,和 L3)、 和恒定区。图24 (a-c)描绘 AbU 的氨基酸序列,包括 Vh 和 Vl 域、CDR (HI, H2, H3, Ll, L2,和 L3)、 和恒定区。图25 (a-c)描绘 AbV 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2,113, Ll，L2，和 L3)、 和恒定区。图26(a_g)描绘与产生图5、11、12、13、和14(上文描述的)所示结果的研究类似 实施的别的研究产生的结果。图27a描绘IL-21细胞因子与抗体AbT竞争对鼠IL-21R的结合。将媒介或渐增 量的IL 21与生物素化的鼠IL 21R HiS/FL.AG混合,并将混合物添加至在ELISA板上固定 化的AbT。用HRP-链霉亲合素检测mIL-21R捕捉,并以A450信号的降低指示mIL_21R结合 的竞争。图27b描绘AbS与IL-21竞争对鼠IL-21R的结合。将AbS和mIL-21混合，应用 至ELISA板中固定化的mIL-21R-Fe，并监测AbS (实心菱形)、同种型对照抗体(空心三角 形)、或mIL-21(方形)的结合。图观描绘在抗IL-21R抗体AbS、AbU, AbV、或AbW或者同种型对照抗体hlgGl-TM 存在F进入大鼠CD3T细胞的IL-21依赖性3H-胸苷掺入。图四描绘在10 %含有家兔IL-21的条件化培养基缺失(图29a)或存在(图29b) 下AbS对由固定化抗小鼠IgG抗体呈递的两种家兔IL-21.R同等型-Fe任一的结合。图30描绘用抗IL-21R抗体处理的动物中的NP特异性--抗应答。图30a描绘NP 特异性IgG应答，而图30b描绘NP特异性IgM应答。图30c-f描绘图30a所示实验的重复 中的NP特异性IgG亚类应答，为各动物显示了 ELISA数据总IgG (图30c)，IgGl (图30d)， IgG2a (图30e),和IgG2c (图30f)。图30g描绘两个月时期里的KP特异性IgG应答。图 30h描绘两个月研究期结束时在骨髓中找到的NP特异性IgG抗体分泌细胞(ASC)。图31描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Faslpir小鼠中的抗双链DNA(抗dsDNA)抗体。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(l()mg/kg, i.p.,每周三次)12周龄 雄性MRL-Faslpr小鼠；对鼠IL-21没有反应性的抗人IL-13人IgGl A234 A235 A237三重 突变体抗体(IL-13 TM)用作同种型对照。通过ELISA对两周一次收集的血清测试抗dsDNA 的存在。图31a显示处理后的抗dsDNA抗体滴度。图31b显示采血前的抗dsDNA抗体滴 度。图31c显示服药2周后的抗dsDNA抗体滴度。图31d显示服药4周后的抗dsDNA抗体 滴度。图31e显示服药6周后的抗dsDNA抗体滴度。图31f显示服药8周后的抗dsDNA抗 体滴度。图31g显示服药10周后的抗dsDNA抗体滴度。在图31a和31c-g中，星号指示与 盐水和IL-13对照二者相比的显著差异(ρ < 0. 01)。在图31b中，星号指示与其它三组相 比的显著差异(P < 0. 01)。图31b g中的虚线表示检测水平。图32描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Faslpt'小鼠的肾中的IgG沉积物。用 盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg, i. p.，每周三次)12周龄雄性 MRL-Faslpir小鼠；对鼠IL-21没有反应性的抗人IL-13人IgGl A234 A235 A237三重突变体 抗体用作同种型对照。处理10周后,处死小鼠并通过免疫细胞化学来鉴定肾中的IgG沉积 物(图32b;肾小球以虚线圆圈标示；IgG沉积物的例子以箭头标示)。对染色强度在1-5 的尺度—丨二打分(图32a)。图33描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Faslpir小鼠的肾中的IgM和补体C3沉积 物。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(l()mg/kg, i.p.,每周三次)12周龄 雄性MRL-Fasltw小鼠。处理10周后，处死小鼠并通过免疫细胞化学来鉴定肾中的IgM(图 33a)和补体C3 (图33b)。对染色强度在1-5的尺度上打分。图34描绘用抗IL-21R抗体处理(10mg/kg，i. p.，每周三次)的MRL-Faslpir小鼠的 脑中的IgG、Ig:M:和补体C3沉积物。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(IOmg/ kg, i. p.,每周三次)12周龄雄性MRL-Faslpr小鼠。处理10周后,处死小鼠并通过免疫细胞 化学来鉴定脑中的IgG(图34a)、IgM(图34b)、和补体C3(图34c)沉积物。对染色强度在 1-5的尺度上打分。图35描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Faslpir小鼠的肾中的淋巴细胞浸润物。用 盐水(对照)或所示三重突变体抗体任--处理(10mg/kg, i. p.,每周三次)12周龄雄性 MRL-Fas11"小鼠。处理10周后，处死小鼠并对苏木精/曙红(H/E)染色的肾切片检查皮 质-间质(肾小球的支持结构)(图35a)、皮质-血管周围区域(图35b)、和肾盂周围区域 (输尿管起点附近)(图35c)这三个区带中的淋巴细胞浸润。对淋巴细胞数在1-5尺度上 打分。图36描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Faslpir小鼠的肺中的淋巴细胞浸润物。用 盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg，i. p.，每周三次)12周龄雄性 MRLHsllff小鼠。处理10周后,处死小鼠并对H/E染色的肺切片检查淋巴细胞浸润。对淋 巴细胞数在1-5尺度上打分。图37a_b描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Faslpir小鼠中的小鼠抗人抗体(MAHA) 应答。用所示三重突变体抗体处理(10mg/kg，i. p.,每周三次)12周龄雄性MRL-Faslpi小 鼠。通过ELISA对两周一次收集的血清测试能够结合用于处理小鼠的人抗体的鼠抗体的存 在(图37a)或能够结合其它抗IL-21人抗体的鼠抗体的存在(图37b)。图37a中的星号 指示与抗IL-13处理组相比的显著差异(ρ < 0. 05)。
图38描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Faslpir小鼠中抗dsDNA抗体的发生。图38a 描绘用AbS处理的小鼠的抗dsDNA抗体滴度，而图3 描绘用AbT处理的小鼠的抗dsDNA 抗体滴度。图38c-d呈现用AbS和AbT处理的MRL-Faslpr小鼠中的肾病理和肾炎症灶。图39描绘用抗IL-21R抗体处理的小鼠或大鼠中进入背部气袋的细胞浸润。图 39a-e :在BALB/C小鼠的背部皮肤下注射3ml空气以创建气袋后3天，给袋补气。2天后， i. P.注射盐水(对照)或所示三重突变体抗体任--。抗体注射后24小时将IOOng鼠IL-21 注射入气袋。6小时后，用:3ml PBS清洗袋，并测定总细胞计数(图39a)、单核细胞(图 39b)、淋巴细胞(图39c)、和嗜中性粒细胞(图39d)。图39e描绘图39a-d所示实验的重复 中的总细胞计数。图39f-j描绘用小鼠IL-21和抗IL-21R抗体处理后大鼠中进入气袋的 总细胞浸润。图39f描绘在AbS或对照抗体存在或缺失下施用20 μ g mIL-21 (6小时)或 lug mIL-21(20小时)任一后的细胞浸润。图39g_h描绘重复实验中进入大鼠气袋的细 胞浸润，其中在1、3、或10 μ g/kg AbS或对照抗体存在下施用20 μ g mIL-21达6小时。在 图891所示实验中，将大鼠用单一的或组合的20 μ g mIL-21和lmg/kg抗体(AbS或同种型 对照任-_一 ),以及20 μ g mIL-21和lOmg/kg抗体的组合处理6小时。在图39j中，测试与1 或 10mg/kg AbS 组合的 10、20、或 40 μ gmIL-21。图40描绘单次静脉内或皮下施用后CD-I小鼠中AbS的浓度-时间曲线。低于定 量极限的浓度在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个数据点N = 4-8。图41描绘单次腹膜内施用后DBA和MRL-Faslpr小鼠中AbS的浓度-时间曲线。低 于定量极限的浓度在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个数据点N = 4-8。图4 和b描绘以10、5、和2. 5mg/kg剂量、每周三次、持续10周多次i. p.施用后 MRI^Faslpr小鼠中的观察和预测AbS浓度。低于定量极限的浓度在计算均值和SD时作为零 处理。每个时间点N =7-8。图43a和b描绘如所示施用后猕猴中AbS的浓度-时间曲线。低于定量极限的浓 度(< 30ng/ml)在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个组N = 3。图43a中的SAN指 研究动物编号。图44描绘给小鼠单次施用后AbS和AbT的浓度-时间曲线。图4 显示CD-I小 鼠中10mg/kg i. v.施用后的曲线。图44b显示MRL-Faslpir小鼠中10mg/kg i. p.施用后的 曲线。图44c显示DBA小鼠中8mg/kg i. p.施用后的曲线。低于定量极限的浓度在计算均 值和标准偏差时作为零处理。每个数据点N = 4-8。图45描绘以20mg/kg、每周三次、持续10周多剂i. p.施用后MRL_FaSlpi‘小鼠中的 观察和预测AbT浓度。低于定量极限的浓度在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个时 间点N = 6-8。图46a和b描绘如所示施用后AbT和AbS在猕猴中的浓度-时间曲线。低于定量 极限的浓度(< 30ng/ml)在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个组N = 3。图47 描绘抗 IL-21R 抗体 AbS、AbTjtI 125I_D5 (8mg/kg，i. p.)在雄性 DBA 小鼠中 的浓度-时间曲线。通过抗人IgG ELISA来定量人抗体AbS和AbT，并通过监测放射性标记 物来定量125I标记的鼠抗体D5。图48a描绘单剂 10mg/kg i. v.后 AbS、AbT、和同种型对照在 Sprague-Dawley(S-D) 大鼠中的均值血清浓度(Y轴；ng/ml)。图4 描绘S-D大鼠中单剂10mg/kg i. v.后的抗IL-21R抗体AbS-AbW。< L0Q(45ng/mL)的各数据点在计算均值和SD时作为零处理。如果 均值低于LOQ(例如当所有动物具有< LOQ的值时)，那么不显示数据点。图49描绘单剂i. v.、i. p.、或s. c.后S-D大鼠中的AbS均值血清浓度(Y轴；ng/ ml) ο图50描绘单剂2. 5mg/kg静脉内后125I-AbS在IL-2IR敲除和野生型C57BL/6 (对 照)小鼠中的生物分布。图50a显示对照C57BL/6小鼠中的组织中的125I-AbS浓度。图50b 显示IL-21R敲除小鼠中的125I-AbS浓度。图50c显示对照C57BL/6和IL-21R敲除小鼠中 的125I-AbS血清浓度。图50d显示对照C57BL/6和IL-21R敲除小鼠中的125I-AbS累积尿计 数。低于LOQ的浓度在计算均值和SD时作为零处理。每个血清或组织时间点N = 9-10 ； 每个尿时间点N = 5-10。图51描绘单剂2. 5mg/kg i. ρ后125I-AbS在MRL-Faslpir小鼠中的生物分布。图51a 显示MRL-Faslpir小鼠中的125I-AbS组织浓度。图5Ib显示MRL-Faslpir小鼠中的125I-AbS尿图52描绘单剂2. 5和10mg/kg i. p.后MRL-Faslpr小鼠中的125I-AbS血清浓度。 低于LOQ的浓度在计算均值和SD时作为零处理。每个时间点N = 4-8。图53a描绘人全血样品中渐增浓度的AbS (X轴)时对IL-21诱导的 IL~2Ra (IIIA)、PRFU 丨丄-6、和CD19表达的百分比抑制(Y轴),自倍数变化计算得出；图 53b描绘人全血样品中响应渐增的AbS浓度(X轴；Ab浓度(nM))时对IL-21诱导的IL-6 相对表达水平的抑制(RQ ；Y轴)。图財描绘在用于测定的定制TLDACTaqman 低密度阵列)上包括的基因；标示了 内源对照。图55展现不同浓度的IL-21时2、4、6、或24小时时间点(X轴)任一时六种检查 的基因 _9、GZMB、IFNy (IFNG)、IL-2R α (IL2RA)、IL-6、和 PRF1)的基因表达的相对定量 (RQ ；Y 轴)。图56a展现与IL-21和不同浓度的AbS或IgGlTM对照任一一起温育(X轴)后六 种检查的基因(CD 19, GZMB, IFNy、IL_2Ra、IL-6、和PRF1)的基因表达的相对定量(RQ ；Y 轴)。图S^3-C描绘用不同浓度的AbS或对照IgGl TM任一处理(X轴)后对相同基因的 IL-21响应的百分比抑制(Y轴)。图57描绘用重组人丨丄-21离体剌激后雄性猕猴的全血中IL4R α基因表达的相 对定量(RQ)值的分布。图57a展现RQ值(X轴)的柱状图分析(Y轴)，而图57b展现经 log2换算的RQ值(X轴)的柱状图分析(Y轴)，它们是使用统计软件包获得的。实线表 示高斯(Gaussian)分布。虚线表示登入体内研究的截留RQ,其是使用如下公式定义的 IogiRQag }=经log换算的RQ值的均值-经log换算的RQ值的Si)。图57c比较各动物 和用IL-21和AbT (三角形)或者IL-21和对照IgG(正方形)剌激的全血等分试样的中值 (实线)RQ值(Y轴)，与仅用IL-21刺激(圆形)比较。图58描绘给雄性猕猴单次lOmg/kg i. v.施用抗IL-21R抗体AbS ( “A”)或 AbT ( “B”)后的血清浓度(Y轴)，AbS收集至第148天而AbT收集至第36天(X轴)。血 清浓度低于下限L0Q(30ng/mL)的数据点未显示。图59显示给雄性猕猴单次10mg/kg i. v.施用抗IL—21R抗体AbS后抗体血清浓度(第二 Y轴)、药效学(PD)活性(“RQ” ；第一 Y轴)、和抗产品抗体应答(以“A”表示) (包括中和性抗产品抗体应答(以“AN”表示))的相关性,如在剂量施用前和后各时间(X 轴；时间(天))测量的。图59a-c分别描绘动物1-3。图60显示相关性，与图59中关于AbT(单次lOmg/kg i. v.施用)的相似。图 60a c分别描绘动物4-6的结果。图61描绘单次i. v.施用后AbS-AbW在猕猴中的浓度-时间曲线。低于定量极 限的浓度(< 30ng/ml)在计算时作为零处理。对于AbS(实心圆圈，研究1 ；空心菱形，研 究2)、AbT (空心圆圈)、AbV(实心菱形)、和AbU (空心三角)，η = 3 ； 10mg/lig剂量。对于 AbW(孔心方框),η = 2 ； lmg/kg剂量。图62描绘给经破伤风类毒素攻击的雄性和雌性猕猴三次每周一次i. v.施用(箭 号)2 (图 62a)或 10mg/kg(图 62b)后 AbS 的各浓度(ng/ml)。图63描绘i. v.施用后AbS PK参数的异计缩放(alIometrie scaling)。体重 (W)；最大跨度潜力(以年计；MLP)。图63a呈现针对体重(X轴)绘图的CLMLP(Y轴)；图 63b呈现针对体重(X轴)绘图的分布体积(Y轴)。实线表示使用来自小鼠、大鼠、和猕猴 的数据基于线性回归拟合的曲线。虚线表示95%置信区间。图64呈现i. v.施用后AbT PK参数的异计缩放。脑重(“BW”)。图6 呈现针 对体重(X轴)绘图的CL*BW (Y轴)；图64b呈现针对体重(X轴)绘图的分布体积(Y轴)。图65(a-b)描绘NZBWF1/J小鼠中AbS对蛋白尿发生(图65a)和抗dsDNAIgG血清 抗体滴度(图65b)的影响。给雌性26周龄NZBWF1/.J小鼠施用400 μ g盐水、抗艾美尔球虫 (E. tenella)抗体、mCTLA-4Ig、hIgGTm抗体或AbS抗体任一，每周三次,持续10周。在研究 开始时及此后10周每两周测量尿蛋白质水平和抗dsDNA IgG血清抗体滴度。用CTLA4-Ig 处理的动物在第4-10周显示出抗dsDNA滴度显著降低(星号；ρ < . 05)。图66描绘类风湿性关节炎的半治疗性CIA小鼠模型中抗IL-21R中和对疾病结局 的影响。对雌性DBA/1小鼠用牛II型胶原免疫接种和强化；当研究中10%的动物展现出 爪肿胀时,给小鼠服用(每周三次,持续30天)8rag/kg鼠IgG2a同种型对照抗体、抗小鼠 IL-21R抗体D5 (鼠IgG2a抗体)、mTNFRII_Fc (阳性对照，鼠IgG2a同种型)(图66a)；或抗 IL-13TM抗体(人IgGl同种型对照抗体)、AbT、或AbS任一(图66b)。各动物在研究第30 天的得分描绘于图66c。图67描绘在AbS存在下猕猴中针对破伤风类毒素的遗忘性(amnestic)破伤风特 异性IgM和IgG血清抗体应答的形成。给9只雄性和9只雌性猕猴免疫接种破伤风类毒素 并休息43天。43天后，将雄性和雌性猴随机分派入三组，并用盐水(媒介),2mg/kg AbS、 或10mg/kg AbS任一处理，每周一次,持续三周。第一剂媒介或AbS任一后24小时(箭 号)，第二次给猴免疫接种破伤风类毒素。贯穿研究过程对猴例行采血，并检查破伤风特异 性IgM(图67a)和IgG(图67b)血清抗体滴度。发明详述本发明的结合蛋白最初衍生自亲本抗体18A5，但是在重链和/或轻链互补决定区 3(CDR3)部分氨基酸序列方面不同于18A5。另外,本发明的结合蛋白显示结合和中和人和 鼠IL-21R 二者方面与等同形式(例如scFv或IgG)的18A5相比改良的效力。先前没有报 告单一结合蛋白对来自这两个物种(人和小鼠)的IL-21R的高效力中和。具有比它们的亲本抗体更大的中和效力的本发明结合蛋白可转化为与先前记载的药剂相比更高的功效。 另外，已经改变了 Vtl和\框架区的氨基酸序列以匹配由人基因组序列编码的序列，由此降 低用本发明结合蛋白处理的患者中人抗人抗体应答的潜力。定义为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。别的定义遍及详述和说明书中的其 它地方列出。术语“结合蛋白”如本文中使用的包括如下的任何天然发生的、重组的、合成的、 或遗传工程的蛋白质或其组合，其结合抗原、靶蛋白质、或肽,或其片段。本发明的结合蛋 白可包括抗体,或衍生自至少一种抗体片段。结合蛋白可包括天然发生的蛋白质和/或合 成工程的蛋白质。本发明的结合蛋白可结合抗原或其片段以形成复合物,并引发生物学应 答(例如激动或拮抗特定生物学活性)。结合蛋白可包括分离的抗体片段。由抗体重和 轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻和重链可变区经肽接头相连接的重组单链多肽分 子(“scFv蛋白质”)、和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。结合蛋白片段 还可包括功能性抗体片段,诸如例如Fab、Fab\F(ab' )2、Fe、Fd、Fd'、Fv、和单抗体可变域 (dAb)。结合蛋白抗原是双链或单链，而且可包含单个结合域或多个结合域。结合蛋白还可包括结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽融合或以其它 方式连接至免疫球蛋白铰链或绞链作用区多肽,后者继而融合或以其它方式连接至包含来 自免疫球蛋白重链的一个或多个天然或工程化恒定区的区域,所述恒定区不同于ChI,例如 IgG和IgA的Ch2和Ch3区或者IgE的CH3和CH4区(更完整的说明参见例如Ledbetter等， 美国专利公开文本2005/0136049)。结合域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括如下的区 域,其包括融合或以其它方式连接至绞链区多肽的天然或工程化免疫球蛋白重链Ch2恒定 区多肽(或CH3,在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)和融合或以其它方式连接至 CH2恒定区多肽(或CH3，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)的天然或工程化免疫 球蛋白重链CH3恒定区多肽(或CH4，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)。通常，此 类结合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一项选自下组的免疫学活性抗体依赖性细胞介 导的细胞毒性、补体结合、和/或对靶物(例如靶抗原)的结合。本发明的结合蛋白可衍生 自任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。术语“抗体”如本文中使用的指对指定蛋白质或肽或其片段有反应性的免疫球蛋 白。此类抗体包括但不限于人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、 多克隆抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、合 成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变型抗体、嫁接偶联抗体(即偶联或融合至其它蛋白质、放 射性标记物、细胞毒素的抗体)、和体外生成的抗体。抗体可来自任何类的抗体，包括但不限 于IgG、IgA、IgM、Igl)、和IgE,及来自任何亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗体。 抗体可具有选自例如IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如卡 帕(κ )或拉姆达(λ )的轻链。本发明的抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、 人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。抗体的恒定区可进行改变,例如突变，以修 饰抗体的特性(例如以提高或降低下述一项或多项Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残 基的数目、效应器细胞功能、或补体功能)。通常,抗体特异性结合预定抗原,例如与病症有 关的抗原，病症例如炎性的、免疫性的、自身免疫性的、神经变性性的、代谢的、和/或恶性的病症。术语“单域结合蛋白”如本文中使用的包括结合抗原、蛋白质、或多肽的任何单域 结合支架。单域结合蛋白可包括如下的任何天然的、重组的、合成的、或遗传工程的蛋白质 支架或其组合，其结合抗原或其片段以形成复合物，并引发生物学应答(例如激动或拮抗 特定生物学活性)。单域结合蛋白可衍生自天然发生的蛋白质或抗体，或者它们可以合成 工程化或通过重组技术来生成。单域结合蛋白可以是任何现有技术的单域结合蛋白或任 何未来的单域结合蛋白，而且可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、 鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。在本发明的一些实施方案中，单域结合蛋白支架可衍生自在鱼 中找到的免疫球蛋白的可变区,诸如例如衍生自在鲨鱼血清中找到的称作新型抗原受体 (NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。生成衍生自NAR可变区(“IgNAR”)的单域结合支架的 方法记载于国际申请公开号 No. WO 03/014161 及 Streltsov(2005)Protein Sci. 14(11) 2901-09。在其它实施方案中，单域结合蛋白是现有技术中描述为不含轻链的重链抗体的天 然发生的单域结合蛋白。此类单域结合蛋白披露于例如国际申请公开号WO 94/004678。出 于清楚原因，衍生自天然不含轻链的重链抗体的可变域结合蛋白在本文中称作VHH或“纳 米抗体”(nanobody)以将它与常规四链免疫球蛋白的Vh区分开。此类VIIH分子可衍生自在 骆驼科(Camelidae)物种中产生的抗体,例如在骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼、和原驼中。骆 驼科以外的其它科也可用于生成天然不含轻链的重链结合蛋白。VHH分子比传统的IgG分 子小大约10倍。它们是单一多肽，而且非常稳定，对极端pH和温度条件有抗性。此外，它们 对蛋白酶的作用有抗性,常规抗体则不然。此外,体外表达VHII能生成高产量的、正确折叠 的功能性VHH。另外,在caraelids中生成的结合蛋白能识别经抗体文库或经免疫camel ids 以外的哺乳动物在体外生成的抗体识别的表位以外的表位(参见例如国际申请公开号WO 97/049805和WO 94/004678，通过述及将二者收入本文)。术语“抗原结合域”和“抗原结合片段”指结合蛋白的一部分，其包负责含结合蛋白 和抗原之间特异性结合的氨基酸。抗原中受到结合蛋白特异性识别和结合的部分称作“表 位”。抗原结合域可包含抗体的轻链可变区和重链可变区(V11)；然而,它不必包含二者。 例如，Fd片段具有两个Vh区，而且常常保留完整抗原结合域的抗原结合功能。结合蛋白的 抗原结合片段的例子包括但不限于(I)Fab片段,即具有VpVH、Cjn ChI域的单价片段；(2) F(ab' )2片段，即具有通过铰链区处的二硫桥相连接的两个Fab片段的二价片段；(3)Fd 片段,其具有两个Vh和一个ChI域；(4) Fv片段,其具有抗体单臂的\和Vh域；(5) dAb片段 (参见例如Ward等(1989) Nature 341 :544-46)，其具有Vh域；(6)分离的CDR;和(7)单链 可变片段(scFv)。虽然Fv片段的两个域(即\和Vh)由分开的基因编码，但是它们能接合 在一起,这使用重组方法,通过合成的接头,使得它们能够作为单一蛋白质链生成,其中\ 和Vh区配对以形成单价分子(称作scFv)(参见例如Bird等(1988) Science 242 :423-26 ； Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-83)。这些结合域片段可使用本领域 技术人员知道的常规技术来获得,而且可以以与完整结合蛋白诸如例如抗体相同的方式对 片段评估功能。术语“中和”指结合蛋白或其抗原结合片段(例如抗体)降低或阻断信号传导途径 或抗原，例如IL-21/IL-21R信号传导途径或IL-21R抗原的活性。如本文中使用的，“抗产品抗体”指响应外源蛋白质(例如抗IL-21R抗体)而形成的抗体。如本文中使用的,“中和 性抗产品抗体”指阻断外源导入蛋白质(例如抗IL-21R抗体)的体内活性的抗产品抗体。 在本发明的一些实施方案中，中和性抗产品抗体降低IL-21R抗体的体内活性，例如IL-21R 抗体的体内药效(PD)活性(诸如抗IL-21R抗体调控IL-21响应性细胞因子或基因表达的 能力)。术语“有效量”指足以调节IL-21R活性以改善或减轻临床症状的严重程度或实现 期望的生物学结果，例如降低T细胞和/或B细胞活性、遏制自身免疫、遏制移植排斥的剂
量或量。术语“人结合蛋白”包括具有基本上与本领域已知的人种系免疫球蛋白序列(包 括例如 Kabat 等(5th ed. 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91 3242记载的) 对应的可变和恒定区的结合蛋白。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列 编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变引入的突 变)，例如在CDR中，特别是在CDR3在。人抗体中可以有至少一个、两个、三个、四个、五个、 或更多个位置被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换。短语“抑制”、“拮抗”、“阻断”、或“中和” IL-21R活性及其类似短语指IL-21R的至 少一种活性由于结合抗IL-21R抗体而降低、抑制、或以其它方式减弱,其中降低是相对于 IL-21R在该抗体缺失下的活性。IL-21R活性可使用本领域已知的任何技术来测量。抑制或 拮抗不必指示完全消除IL-21R生物学活性。活性的降低可以是约10%，20%，30%，40%， 50%, 60%，70%，80%，90%, 95%，或更多。术语“白介素-11受体，，或“ IL-21R”等等指结合IL-21配体的I类细胞因子 家族受体，也称作MU-I (参见例如美国专利申请No. 09/569，384和美国申请公开文本 No. 2004/0265960 ；2006/0159655 ；2006/0024268 ；和 2008/0241098) ,NILR 或 zalphall (参 见例如国际申请公开号WO 01/085792 ；Parrish Novak等(2000)出处同上；Ozaki等 (2000)出处同上)。IL-21.R与]丄-2和IL-15受体分享的β链、和IL-4 α同源(Ozaki等 (2000)出处同上)。在配体结合时，IL-21R能够与共同伽马细胞因子受体链(Yc)相互作 用并诱导STATl和STAT3 (Asao等(2001)出处同上)或STATO (Ozaki等(2000)出处同____丨二) 磷酸化。IL-21R显示广泛的淋巴样组织分布。术语“白介素-21受体”或“IL-21R”等等还 指能够与11,21 (优选哺乳动物起源的IL-21,例如鼠或人IL-21)相互作用且具有至少一项 下述特征的多肽(优选哺乳动物起源的，例如鼠或人IL-21R)或(在上下文需要时)编码此 类多肽的多核苷酸(1)天然发生的哺乳动物IL-21R多肽的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO :2(人-对应于 GENBANK (U. S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD)登录号 NP—068570)或 SEQ ID NO :4 (鼠-对应于 GENBANK 登录号 NP—068687)所列 氨基酸序列或其片段；(2)与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所列氨基酸序列或其片段基本 ....丨二同源例如至少85%，90 %，95 %，98%，或99 %同源的氨基酸序列；(3)由天然发生的哺 乳动物IL-21R核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO :1 (人-对应于GENBANK 登录号 NMJ)21798)或SEQ ID NO 3 (鼠—对应于GENBANK 登录号NM—021887)或其片段)编码 的氨基酸序列；(4)由与SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :3所列核苷酸序列或其片段基本上同 源例如至少肪％，90 %，95 %，98 %，或99 %同源的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(5)由与天然发生的IL-21R核苷酸序列或其片段例如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3或其片段简并 的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(6)在严格条件(例如高严格条件)下与前述核苷酸 序列之一杂交的核苷酸序列。另外，涵盖在所公幵的方法中有用的其它非人和非哺乳动物 IL-21R。术语“白介素-21 ”或“ IL-21 ”指与IL-2、IL-4和IL-15显示序列同源性 (Parrish-Novak等(2000)出处同上)且结合IL-21R的细胞因子。此类细胞因子分享共同 的折叠，折叠成该家族特征性的“四螺旋束”结构。IL-21主要在活化的CD4+T细胞中表达，而 且据报告对NK、B和T细胞有效果(Parrish Novak等(2000)出处同上；Kasaian等(2002) 出处同上)。在I[厂21结合至IL-21R时，IL-21R的活化引起例如STAT5或STAT3信号传导 (Ozaki等(2000)出处同上)。术语“白介素-21”或“IL-21”还指能够与IL-21R(优选哺 乳动物起源的，例如鼠或人IL-21R)相互作用且具有至少一项F述特征的多肽(优选哺乳 动物起源的，例如鼠或人IL-21)或(在上下文需要时)编码此类多肽的多核苷酸(1)天 然发生的哺乳动物IL-21的氨基酸序列或其片段,例如SEQ ID NO :212 (人)所列氨基酸序 列或其片段；(2)与SEQ ID NO :212所列氨基酸序列或其片段基本上同源例如至少85%, 90 %，95 %，98 %，或99 %同源的氨基酸序列；( 由天然发生的哺乳动物IL-21核苷酸序列 或其片段(例如SEQ ID N0:211(人)或其片段)编码的氨基酸序列；(4)由与SEQ ID NO 211所列核苷酸序列或其片段基本上同源例如至少8590%,95%,98%, ^ 99%同源的 核苷酸序列编码的氨基酸序列；(5)由与天然发生的IL-21核苷酸序列或其片段简并的核 苷酸序列编码的氨基酸序列；或(6)在严格条件(例如高严格条件)下与前述核苷酸序列 之一杂交的核苷酸序列。术语“ IL-21R活性”等等(例如“ IL-21R的活性，，、“ IL-21/1L-21R活性”)指因 IL-21R结合而发起或中断的至少一种细胞过程。IL-21R活性包括但不限于(1)与配体 (例如IL-21多肽)相互作用(例如结合)；(2)联合或活化信号转导(也称作“信号传导”， 指响应特定刺激发生的细胞内级联)和信号转导分子(例如伽马链(Y c)和JAK1)，和/或 刺激STAT蛋白质(例如STAT5和/或STAT3)的磷酸化和/或活化；(3)调控免疫细胞(例 如T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、调节性T细胞(Treg)和巨核细胞)的增殖、分化、效 应器细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、和/或存活；及(4)调控IL-21响应性基因 或细胞因子的表达,例如调控IL-21对例如TNF，IFN y , IL-6，IL-8，IL-10’ CD19, STAT3, ICAM-1, TBX21, CSFl, GZMB, PRFl, IL-2Ra，IL-21R,等的表达水平的影响。如本文中使用的,“体外生成的抗体”指如下的抗体,其中整个或部分可变区(例如 至少一个CDR)是在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片、或能对候选序列 测试它们结合抗原的能力的任何其它方法)中生成的。术语“分离的”指基本上不含其天然环境的分子。例如,分离的蛋白质基本上不含 细胞材料或来自衍生它的细胞或组织来源的其它蛋白质。该术语还指如下的制备物，其中 分离的蛋白质对于药物组合物是足够纯的，或者至少70-80% (w/w)纯的、至少80-90% (w/ w)纯的、至少 90-95% (w/w)纯的、或至少 95%，96%，97%,98%，99%,或 100% (w/w)纯 的。短语“百分比相同，，或“百分比同注”指至少两种不同序列之间的相似性。此百 分比同一性可通过标准算法来确定，例如Altshul等((1990)1. Mol. BioL 215 :403-10)记载的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST) ；Needleman 等((1970) J. Mol. Biol. 48 :444-53)的算法；或 Meyers 等((1988) Comput. App 1. Biosci. 4 11-17)的算法。一组参数可以是Blosum 62评分矩阵及缺口罚分12、缺口延伸罚分4、 和移码缺口罚分5。两种氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性还可以使用Meyers和 Mi Iler ((1989) CABIOS 4 :11-17)的算法来确定,该算法已经掺入ALIGN程序(2. O版)，使 用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、和缺口罚分4。百分比同一注通常通过比较相似 长度的序列来计算。术语“全集(repertoire) ”指完全或部分地自编码至少一种免疫球蛋白的至少一 种序列衍生的至少一种核苷酸序列。可以通过在体内重排重链的V、D、和J区段及轻链的V 和J区段来生成序列。或者,可以自响应例如体外剌激而发生重排的细胞生成序列。或者， 可以通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变、或其它方法来获得部分或整个/所有序列(参见例 如美国专利No. 5，565，332)。全集可以只包括一种序列，或者可以包括多种序列，包括遗传 上多样的集合中的多种序列。术语“特异性结合”等等指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异 性结合以高的亲和力和低至中的能力来表征，与通常具有低的亲和力和中至高的能力的非 特异性结合区分开。通常，当结合常数Ka高于约IO6M V1时，认为结合是特异性的。如果 必要,通过改变结合条件，能降低非特异性结合且基本上不影响特异性结合。熟练技术人员 能使用常规技术来改进适宜的结合条件，诸如结合蛋白的浓度、溶液的离子强度、温度、容 许结合进行的时间、封闭剂(例如血清清蛋白或乳酪蛋白)的浓度、等。本文中列出了例示 性的条件,但是本领域普通技术人员知道的其它条件落在本发明的范围内。如本文中使用的,术语“严格”、“严格性”、等等描述用于杂交和清洗的条件。本发 明的分离的多核苷酸可用作杂交探针和引物来鉴定和分离具有如下序列的核酸，该序列与 编码所公开的多核苷酸的序列相同或相似。因此，以此方式分离得到的多核苷酸可用于生 成针对IL-21R的结合蛋白或鉴定表达此类结合蛋白的细胞。用于鉴定和分离核酸的杂交 方法包括聚合酶链式反应(PCR)、Southern杂交、原位杂交和Northern杂交,而且是本领域 技术人员公知的。可以在具有不同严格性的条件F实施杂交反应。杂交反应的严格性包括任意两个 核酸分子会彼此杂交的难度和它们会保持杂交的条件。优选的是,在低严格性条件、更优选 严格条件、和最优选高严格条件下,每个杂交的多核苷酸杂交至其对应多核苷酸。严格条件 是本领域技术人员知道的，而且可见于例如Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989)6. 3. 1-6.3.6。含水的和不含水的方法均在此文献中有记 载,而且均可使用。严格杂交条件的一个例子是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45°C 杂交,接着在0.2X SSC/0. 1%SDS中于50°C清洗至少一次。严格杂交条件还可用在例如 0. 2X SSC/0. 1% SDS中于55°C、60°C、或65°C清洗来实现。高严格条件包括例如在0. 5M磷 酸钠n% SDS中于65°C杂交，接着在0. 2X SSC/1% SDS中于65°C清洗至少一次。严格条 件的其它例子显示于下文表1 高严格条件指至少像例如条件A-F那样严格的条件；严格条 件指至少像例如条件G L那样严格的条件；而低严格条件指至少像例如条件M-R那样严格 的条件。表1:杂交条件
权利要求
1.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受 试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合 片段，由此治疗或预防所述病症,其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含至少--种与选自 下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO :14，16，18，20，22，24，26， 28, 30, 32，34, 36, 38, 40, 42，44, 46, 48, 50, 52，54, 56, 58,60, 62，64, 66, 68，70, 72，74, 76, 78, 80,82, 84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104，106,108,110,112,114,116，118，120, 122’ 124，126’ 128，130’ 132，134’ 136，138’ 140，142’ 144，146’ 148，150，152，154，156，158， 160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。
2.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段,其中所述结合蛋白或抗原结合片段是抗
3.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段,其中所述结合蛋白或抗原结合片段是ScFv0
4.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段是VH。
5.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段是丨。
6.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段,其中所述结合蛋白或抗原结合片段是CDR。
7.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试 者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片 段，由此治疗或预防所述病症,其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种由与选自 下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列=SEQ ID NO 13,15, 17，19，21，23, 25，27，29, 31，33，35，37，39, 41，43，45，47，49, 51，53，55，57，59, 61，63，65， 67，69, 71, 73，75，77，79, 81, 83，85，87，89, 91, 93，95，97, 99,101，103，105，107，109，111， 113,115，117,119，121,123，125,127，129,131，133,135，137,139，141,143，145,147，149, 151，153’155’157’159’161,239,241,243,245,和 247。
8.权利要求1的方法，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种选自下组的氨 基酸序列:SEQ ID NO :14,16,18，20，22，24, 26，沘，30，32, 34，36，38，40，42，44,46，48，50， 52，54, 56, 58,60, 62,64, 66，68，70, 72, 74, 76, 78, 80，82，84,86, 88,90, 92,94, 96，98，100, 102，104，106，108，110，112，114,116，118，120’ 122，124’ 126，128’ 130，132’ 134,136’ 138， 140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165—168，171—193，213—229，240，
9. 一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受 试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合 片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选 自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO :6，8，10，12,14，16，18， 20, 22, 24，26, 28, 30, 32, 34，36, 38, 40,42, 44，46, 48, 50，52, 54，56, 58, 60，62, 64，66, 68, 70，72，74，76，78，80，82,84,86，88，90，92，94，96，98,100，102，104，106，108，110’ 112’ 114, 116，118，120，122，124,126，128，130，132，134，136，138，140，142,144,146,148，150，152， 154，156，158，160，162-195，213-229，240，242，244，246，和 248，且其中，如果该结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自下组的序列至少约95% 相同的氨基酸序列SEQ ID NO 6,8,10,12，163，164，169，170，194，和195,那么该结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基 酸序列:SEQ ID NO :14,16，18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52, 54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102， 104，106，108，110,112，114,116，118,120，122,124，126,128，130,132，134,136，138,140， 142,144,146,148,150,152,154,156,158,160,162,165-168,171-193,213-229,240,242， 244，246，和 248。
10.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受 试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片 段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种由与选 自下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列SEQ ID NO 5,7, 9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59， 61,63, 65，67，69，71，73，75，77, 79, 81，83，85，87，89，91,93, 95，97，99，101,103，105,107， 109, 111, 113,115,117,119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145, 147，149，151，153，155，157，159，161, 239, 241, 243, 245,和 247，且其中，如果该结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的序列至少约95% 相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列SEQ ID N0:5，7,9，和11，那么该结合蛋白或抗原 结合片段必须还包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸序列 编码的氨基酸序列=SEQ ID NO :13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43, 45，47, 49，51，53, 55，57, 59，61，63, 65，67，69，71，73, 75，77，79，81，83, 85，87，89，91，93， 95，97,99,101,103，105，107，109，111，113,115，117，119，121,123,125,127,129，131，133， 135,137,139,141,143,145,147,149,151,153，155,157,159,161,239,241,243,245,和 247。
11.权利要求9的方法，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种选自下组的 氨基酸序列:SEQ ID NO 6,8,10，12’ 14,16，18，20,22,24, 26，28,30,32, 34，36, 38,40,42， 44, 46，48, 50, 52，54, 56，58, 60, 62，64, 66, 68, 70, 72，74, 76, 78, 80, 82，84,86, 88, 90, 92， 94,96,98,100’ 102，104,106，108，110，112’ 114，116，118，120，122，124’ 126’ 128，130，132， 134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162-195，213-229，240， 242，244，246，和 248，其中，如果该结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自下组的序列至少约95% 相同的氨基酸序列=SEQ ID NO 6,8,10，12,163,164,169,170,194,和195,那么该结合蛋 白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基 酸序列:SEQ ID NO :14,16，18，20，22, 24，26，28，30, 32，；34，36，38,40，42，44，46,48，50，52， 54，56, 58,60,62,64,66，68，70, 72, 74, 76, 78, 80,82，84，86,88,90,92,94,96,98，100,102, 104’ 106，108’ 110，112’ 114，116’ 118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140， 142，144,146，148,150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242， 244，246，和 248。
12.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法,包括对受试者施用特异性结 合IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含轻链 和重链，且其中该重链包含至少一种选自F组的氨基酸序列=SEQ ID NO =14,16,18,20,68,·70,72，88,90,92,94，213，218，219，240，和 242。
13.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法,包括对受试者施用特异性结 合IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含轻链 和重链，且其中该轻链包含至少一种选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO =22,24,26,28,30, 32, 34, 36，38, 40，42, 44, 46，48, 50, 52, 54, 56，58, 60, 62, 64, 66，74, 76, 78, 80, 82，84, 86, 96,98,100，102，104，106，108，214-217，220-229，244，246，和 248。
14.权利要求12的方法，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含\域和Vh域，且其中 该Vh域包含至少一种选自下组的序列=SEQ ID NO 14,16，18，和20。
15.权利要求13的方法,其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含Nl域和Vh域,且其中 该 Vl 域包含至少一种选自下组的序列:SEQ ID NO :22，24, 26，28，30，32, 34，36，38，40,42， 44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，215，217，221，223，225，227，和 229。
16.权利要求12或13的方法，其中所述重链包含选自下组的氨基酸序列SEQID NO 88,90,92,94，213，218，219，240，和242,且所述轻链包含选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO =96,98,100，102，104，106，108，214，216，220，222，224，226，228，244,246，和 248。
17.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低 受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合受选自下组的结合蛋白识别的人 IL-21R表位的结合蛋白或其抗原结合片段=AbA-AbW, H 3-H6, Li-L6，L8-L21,和L23-L25, 其中所述结合蛋白或抗原结合片段竞争性抑制选自下组的结合蛋白对人IL-21R的结合 AbA-Abff, H3-H6, L1-L6，L8-L21，和L23-L25，由此治疗或预防所述病症。
18.权利要求17的方法，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含重链、轻链、或 Fv片段，其包含选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO 14,16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36，38，40，42，44, 46，48，50，52，54, 56，58，60，62，64, 66，68，70, 72，74, 76，78，80, 82， 84,86,88,90,92,94,96,98,100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124， 126，128，130，132,134，136,138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162， 165-168,17卜193, 213-229, 240, 242, 244, 246,和 248。
19.权利要求17的方法,其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含重链、轻链、或Fv片 段，其包含选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO :13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35， 87,89,91,93,95,97,99,101,103,105,107，109,111,113,115,117,119，121,123,125,127, 129，131，133，135，137，139，141,143,145，147,149，151，153，155，157，159，161,239,241, 243，245，和 247。
20.权利要求17的方法，其中所述结合蛋白特异性结合受AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、 AbU, AbVdfl /或AbW识别的IL-21R表位,且其中所述结合蛋白竞争性抑制AbO, AbP、AbQ、 AbR、AbS、AbT、AbU, AbV、和 /'或 Abff 对人 IL-21R 的结合。
21.权利要求1,9,12，13，和17任一项的方法，其中所述IL-21R相关病症选自下组自 身免疫性病症、炎性状况、变态反应、移植排斥、和血液高增殖性病症。
22.权利要求21的方法,其中所述IL-21R相关病症选自下组多发性硬化、系统性红 斑狼疮、银屑病、移植排斥、类风湿性关节炎、和其它关节炎病症。
23.权利要求1，9，12，13，和17任一项的方法，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段对人IL-21R的结合常数为至少约IO5MW
24.权利要求1,9,12,13,和17任一项的方法,其中所述结合蛋白或其抗原结合片段以 约1. 75nM或更少的IC5ci抑制IL-21介导的BAF3细胞增殖，且其中所述BAF3细胞包含人 IL-21受体。
25.权利要求1，9，12,13，和1.7任一项的方法,其中所述结合蛋白或其抗原结合片段以 约14. OnM或更少的IC5。抑制IL-21介导的Τ 1细胞增殖,且其中所述Τ 1细胞包含人IL-21 受体。
26.权利要求1，9，12，13，和17任一项的方法,其中所述结合蛋白或其抗原结合片段 以约1. 9nM或更少的IC5ci抑制IL-21介导的原代人B细胞增殖,且其中所述B细胞包含人 IL-21R。
27.权利要求1，9，12，13，和17任一项的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋 白或抗原结合片段以约1. SnM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的原代人CD4+细胞增殖，且其 中所述CIM+细胞包含人IL-21R。
28.一种确定抗IL-21R抗体是否是治疗性抗IL-21R抗体的方法,包括下述步骤(a)使来自受试者的第一血液样品与IL-21配体接触；(b)测定与IL—21配体接触的第一血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水(c)在抗IL-21R抗体存在下使来自该受试者的第二血液样品与IL-21配体接触；(d)测定在该抗IL-21R抗体存在下与IL-21配体接触的第二血液样品中至少一种 IL-21响应性基因的表达水平；并(e)比较步骤(b)和⑷中测定的至少一种IL-21响应性基因的表达水平，其中至少--种IL-21响应性基因表达水平的变化指示该抗IL-21R抗体是治疗性抗体。
29.权利要求28的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因选自F组TNF，IFNγ , IL-6，IL-8，IL-10，CD19, STAT3, TBX21，CSF1, GZMB, PRFl, IL-2Ra，和 IL-21R。
30.权利要求29的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因是ILIRa。
31.一种测定抗IL-21R抗体的药效活性的方法,包括检测受试者的血液样品中至少一 种IL-21响应性基因表达水平的调控。
32.权利要求31的方法，其中检测至少一种IL-21响应性基因表达水平的调控包括下 述步骤(a)对受试者施用抗IL-21R抗体,其中所述受试者用所述抗IL-21R抗体处理；(b)使来自用所述抗IL-21R抗体处理的所述受试者的血液样品与IL-21配体接触；(c)测定来自用所述抗IL-21R抗体处理的所述受试者，并与所述IL-21配体接触的所 述血液样品中至少一种IL 21响应性基因的表达水平；并(d)比较步骤(c)中测定的至少一种IL-21响应性基因的表达水平与与IL-21配体接 触的另一种血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平，其中所述另一种血液样品 来自未用所述抗IL-21R抗体处理的受试者。
33.权利要求32的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因选自下组:TNF,IFNy , IL-6, IL-8, IL-10, CD19, STAT3, TBX21, CSFl，GZMB，PRFl，IL_2Ra ’禾口 IL-21R。
34.权利要求33的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因选自F组⑶19，GZMB,
35.权利要求34的方法,其中所述至少一种IL-21响应性基因是IL-2Ra。
全文摘要
本发明提供特异性结合人白介素-21受体(IL-21R)的结合蛋白及其抗原结合片段，包括人抗体，及使用它们的方法。该结合蛋白能起例如IL-21R活性拮抗剂的作用，由此调控一般而言的免疫应答，及具体而言的由IL-21R介导的免疫应答。所公开的组合物和方法可以例如在诊断、治疗、和/或预防IL-21R相关病症例如炎性病症、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥、和其它免疫系统病症中使用。
文档编号C07K14/715GK102149403SQ200980128941
公开日2011年8月10日 申请日期2009年5月26日 优先权日2008年5月23日
发明者卡丽莎·K·阿德金斯, 埃米·A·韦弗, 尤利亚·武格梅斯特, 希思·M·瓜伊, 德博拉·A·扬, 莱尔德·布卢姆, 萨达纳·贾因, 达文德·吉尔, 马亚·阿莱, 马戈·奥图尔 申请人:惠氏有限责任公司