专利名称：抗人epo受体抗体的制作方法
抗人EPO受体抗体
背景技术：
人红细胞生成素(EPO)是涉及祖红细胞的增殖和分化的166-aa糖蛋白。这些细 胞反应由人EPO受体(ΕΡ0受体，EP0-R)——508_aa糖蛋白——介导。EPO-R是508个氨基 酸长度的蛋白质(Swiss Prot P19235)，其含有单个跨膜结构域且已被分类为I型细胞因子 受体的生长激素亚家族成员。EPO-R在例如Winkelmann，J. C.等人，Blood 76(1990)24-30 和 Jones，S. S.等人，Blood 76(1990)31-35)中有描述。抗EPO-R 抗体记载于例如 D，Andrea, A. D.，Blood 82(1993)46-52 ；Elliott, S.， Blood 107(2006) 1892-1895 ；Kirkeby，A.，J. Nerosci. 164(2007)50-58 ；Miura, 0.，Arch. Biochem. 306(1993)200-208 ；和 EP1146056、EP 1327681、EP 0773962、EP 0776370、US 2002/0031806、US2003/0215444、US 2004/0058393、US 2004/0071694、US 2004/0175379、 US 2005/0227289、 US 2005/0244409、 US 2006/0018902、 US 6，998， 124、 US 7,053,184、 US 7，081，523、WO 1995/005469、WO 1996/003438,W02000/061637, WO 2004/035603A2, WO 2005/100403A2。然而，由于已知的抗EPO-R抗体的特异性的缺乏，调查EPOR在组织样品中 的表达和定位的研究导致分歧和常常地人为的结果(参见Jelkmarm，W.等人，Crit. Rev. Onc/Hematol. 67 (2008) 39-61 ；Elliott, S.等人，Blood 107(2006) 1892-1895 Jelkmann, W.和 Laugsch, Μ.，J. Clin. Oncol. 25(2007) 1627-1628 ；Kirkeby，Α.等人，J. Neurosci. Methods 164 (2007) 50-58 ；Laugsch, Μ.等人，Int. J. Cancer 122(2008) 1005-1011) 发明_既述本发明包括结合EPO-R的抗体，所述抗体允许对EPO-R的特异性分析，尤其是在人 组织(例如组织或活检组织)中。本发明包括结合人EPO受体的抗体，其特征在于特异性结合人EPO受体片段 LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQ ID NO 1), CSSALASKPSPEGASAASFEY(SEQ ID NO :2)或 GGLSDGPYSNPYENSLIPAAEP(SEQ ID NO :3)。所述抗体优选为单克隆或多克隆抗体。优选地，根据本发明的抗体的特征在于，包含SEQ ID NO :4或12的⑶R3区作为重 链可变结构域⑶R3区。优选地，所述抗体的特征在于，重链可变结构域包含SEQ ID NO 4的⑶R3区、SEQ ID NO 5 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区、或 SEQ ID NO 12 的 CDR3 区、SEQ ID NO 13 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 14 的 CDRl 区。优选地，所述抗体的特征在于，重链可变结构域包含SEQ ID NO 4的⑶R3区、SEQ ID NO 5的⑶R2区和SEQ ID NO 6的⑶Rl区，以及轻链可变结构域包含SEQ ID NO 7的 CDR3 区、SEQ ID NO 8 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 9 的 CDRl 区。优选地，所述抗体的特征在于，重链可变结构域包含SEQ ID N0:12的⑶R3区、SEQ ID NO 13的CDR2区和SEQ ID NO 14的CDRl区，以及轻链可变结构域包含SEQ ID NO 15 的 CDR3 区、SEQ ID NO 16 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 17 的 CDRl 区。优选地，所述抗体的特征在于，重链可变结构域包含SEQ ID NO 10或18。
优选地，所述抗体的特征在于，重链可变结构域包含SEQ ID NO :10，轻链可变结构 域包含 SEQ ID NO :11ο优选地，所述抗体的特征在于，重链可变结构域包含SEQ ID Ν0:18，轻链可变结构 域包含 SEQ ID NO :19ο根据本发明的抗体在ELISA、蛋白质印迹(Western Blot)、免疫细胞化学检测试验 和免疫组织化学检测试验中特异性结合EPO受体。根据本发明的抗体特异性结合内源或重组地表达EPO受体的UT7细胞中的EPO受 体。优选地，根据本发明的抗体的特征在于，以至少10-8M-1至10-12M-1的结合亲和 力结合EP0-R。进一步优选，抗体为小鼠源、兔源或人源的。本发明还包括根据本发明的抗体用于分析带有/表达EPO受体的细胞的用途。优选地，根据本发明的抗体用于分析人组织样品中的EPO受体。优选地，此类分析 通过蛋白质印迹、免疫细胞化学或免疫组织化学来进行。 可以定性地(例如检测细胞是否包含EPO受体)或定量地(例如检测EPO受体的 表达)地进行此类分析。发明详述术语“抗体”包括单克隆和多克隆抗体及各种抗体结构形式，包括但不限于全抗体 和抗体片段。“抗体片段”包含全长抗体的部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗 体片段的实例包括由抗体片段形成的双抗体(diabody)、单链抗体分子、和多特异性抗体。 scFv 抗体例如记载于 Houston，J. S.，Methodsin Enzymol. 203(1991)46-96 中。此外，抗体 片段包括如下单链多肽，该多肽具有结合EPO-R的Vh结构域的特征，即，能够与\结构域一 起装配成功能性抗原结合位点，或具有结合EPO-R的\结构域的特征，即，能够与Vh结构域 一起装配成功能性抗原结合位点，由此提供具有特异性结合人EPO-R的性质的抗体。如本文使用的，术语“特异性结合人EPO受体片段 LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQ ID NO 1), CSSALASKPSPEGASAASFEY(SEQ ID NO :2)或 GGLSDGPYSNPYENSLIPAAEP (SEQ ID NO 3) ” 意指在 ELISA 中，在 0. 1 μ g/ml 的抗体浓度，以 10或更高的S/N比，结合此类片段。如本文使用的，术语“结合EPO-R的抗体”意指，在使用以100，000-500, 000个受体 /细胞的量重组表达EPO-R的细胞(EP0-R表达细胞)、通过显微术分析进行测量的细胞结 合测定试验中，该抗体与人EPO-R结合。如果抗体在0. 1 μ g/ml的抗体浓度时引起400 (或 更高)的S/N(信/噪)比，则存在结合。如本文使用的，术语“ΕΡ0与EPO受体的结合”意指，在使用EPO-R表达细胞通过 显微术分析进行测量的细胞结合测定试验中，EPO与人EPO-R结合。如果EPO在0. 1 μ g/ml 的EPO浓度时引起400或更高的S/N(信/噪)比，则存在结合。如本文使用的，术语“不存在根据本发明的抗体与细胞化合物的非特异性结合”意 指，在使用不表达EPO-R的细胞通过显微术分析进行测定的细胞结合测定试验中，根据本 发明的抗体不结合细胞化合物。如果所述化合物在0. 1 μ g/ml的抗体浓度时引起不大于10的S/N(信/噪)比，那么无结合存在。如果在使用EPO-R表达细胞通过显微术分析进行测定的细胞结合测定试验中，抗 体在0. 1 μ g/ml的抗体浓度时引起400的S/N(信号/噪音)比，并且在使用处于不表达 EPO-R的状态(1，000个受体/细胞或更少，例如100个受体或更少)的所述细胞、通过显微 术分析来测量的所述细胞结合测定试验中，抗体在0. 1 μ g/ml的抗体浓度时引起不大于10 的S/N(信号/噪音)比，则存在该抗体与EPO-R的特异性结合。显微术分析的免疫荧光信号可以通过用形态计量法测量阳性和阴性(对照、噪音 信号)荧光样品之间的重叠区域而定量。有用的工具是来自MetaMorph成像软件的“测量 共定位化，，(Measuring Colocalization，，)算法(www. moleculardevices. com)。根据本发明的抗体不抑制EPO与EPO受体的结合。根据本发明的抗体能够特异性 确定人细胞和组织样品中的EPO受体。根据本发明的抗体与Epo-R的结合不活化(磷酸 化)EPO-R。术语“表位”是指，能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学 活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，且通常表位具有特定的三维结构特征、以及特定 的电荷特征。构象表位与非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下与前者而非后者的 结合消失。本发明还包括根据本发明的抗体用于检测人细胞、组织或活检组织中的EPO-R的 用途。在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的抗体的诊断组合物，其可以用于检 测人细胞、组织或活检组织中的EP0-R。序列描述
SEQIDNO:1合成肽
SEQIDNO2合成肽
SEQIDNO3合成肽
SEQIDNO4重链CDR3克隆21. 3. 1
SEQIDNO5重链CDR2克隆21. 3. 1
SEQIDNO6重链CDRl克隆21. 3. 1
SEQIDNO7轻链CDR3克隆21. 3. 1
SEQIDNO8轻链CDR2克隆21. 3. 1
SEQIDNO9轻链CDRl克隆21. 3. 1
SEQIDNO10重链克隆21. 3. 1
SEQIDNO11轻链克隆21. 3. 1
SEQIDNO12 重链 CDR3 克隆 19. 1. 2
SEQIDNO13 重链 CDR2 克隆 19. 1. 2
SEQIDNO14 重链 CDRl 克隆 19. 1. 2
SEQIDNO15 轻链 CDR3 克隆 19. 1. 2
SEQIDNO16 轻链 CDR2 克隆 19. 1. 2
SEQIDNO17 轻链 CDRl 克隆 19. 1. 2
SEQIDNO18重链克隆19. 1. 2
SEQ ID NO 19 轻链克隆 19. 1. 2附图简述
图1 通过ELISA测定的、Mabs和Pabs与生物素化EPOR肽的特异性结合。以 0. 1 μ g/ml, PAK < EPOR(347-371) > K-IgG (IS) ChOlbSW 与固定在 Maxisorp 微量滴定板 上的生物素化肽347-371 (对应于成熟EP0R)的结合。Mab Cl. 21. 3. 1未显示，因为在所用 条件下此 Mab 不适合于 ELISA0 Mabs Cl. 19. 1. 2、Cl. 19. 3. 7 和 PAK < EPOR (382-402) > K-IgG(IS)ChOlbSff与固定在Maxisorp微量滴定板上的生物素化肽382-402 (对应于成熟 EP0R)的结合。PAK < EPOR(454-475) > K-IgG(IS) ChOlbSff 与固定在 Maxisorp 微量滴定 板上的生物素化肽454-475 (对应于成熟EP0R)的结合。图2 来自HELAwt、HELA-EP0R和UT-7细胞的裂解物的WB分析(以显示特异性)。 (a)Mab Cl. 21. 3. 1 (表位 aa347_371)和 PAK < EPOR(347-371) > K-IgG (IS) ChOlbSW 的特异 性结合。(b)Mab Cl. 19. 3. 7 和 Mab Cl. 19. 1. 2 (表位 aa382_402)和 PAK < EPOR(382-402) > K-IgG(IS)ChOlbSff 的特异性结合。(c)PAK < EPOR(454-475) > K-IgG(IS)ChOlbSW(表 位aa 454-475)的特异性结合。图3 HELAwt和HELA-EP0R的免疫细胞化学分析。重组人EPOR-GFP (绿)和 抗体免疫反应性(红)的双重免疫荧光。由红色和绿色信号的共定位指示特异性标 记。HELAwt 不表达 EP0R，用作阴性对照。(a)用 Mab Cl. 21. 3. 1 (aa 347-371)，(b)Mab Cl. 19. 1. 2(aa382-402)，(c)MabCl. 19. 3· 7 (aa382_402)染色。图4 =HELAwt和HELA-EP0R的免疫组织化学分析以及与商品化抗体 C-20 (SantaCruz)的比较。(a)来自Santa-Cruz的多克隆抗体C-20 ； (b)多克隆亲和纯化 的抗体 PAK < EPOR(347-371) > K-IgG(IS)ChOlbSl图5 比较性蛋白质印迹分析。上样2. 5X IO4细胞/泳道。抗体浓度为㈧ PAK < EPOR (347-371)(10ng/ml) ； (B)C-20 (0. 4 μ g/ml) ； (C)ABIN98954(O. 4 μ g/ml) ； (D) M-20 (0. 4 μ g/ml) ； (E) ab 10653 (0. 4 μ g/ml)和(F) BAF307 (0. 4 μ g/ml)。泳道从左到右 Hela 亲本(1)、未处理的(2)、OptiMem (3)、非编码 siRNA (4)、EPO-R siRNA (5)、EPO-R siRNA (6)。图6 :MAB307的蛋白质印迹分析。上样2. 5X IO4细胞的总蛋白/泳道，一级抗体以 0.4 μ g/ml的浓度使用。在变性㈧和非变性⑶条件下进行了分析。泳道从左到右Hela 亲本(1)、未处理的(2)、0ptiMem(3)、非编码 siRNAQ)、EPO-R siRNA(5) ,EPO-R siRNA(6) 实施例1抗人EPOR胞内结构域的单克隆和多克隆抗体的产生Mab Cl. 21. 3. 1 和 PAK < EPOR(347-371) > K-IgG(IS) ChOlbSff 对应于成熟人促 红细胞生成素受体残基347-371的25氨基酸合成肽(LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV)用作 免疫原(对应于EPOR前体的aa371-395)。Mab Cl. 19. 3. 7, Mab Cl. 19. 1. 2 禾口 PAK < EPOR(382-402) > K-IgG(IS) ChOlbSff 对应于成熟人促红细胞生成素受体残基382-402的21氨基酸合成肽 (CSSALASKPSPEGASAASFEY)用作免疫原(对应于 EPOR 前体的 aa406_426)。PAK < EPOR(454-475) > K-IgG(IS)ChOlbSW 对应于成熟人促红细胞生成素受体 残基454-475的22氨基酸合成肽(GGLSDGPYSNPYENSLIPAAEP)用作免疫原(对应于EPOR前体的 aa478-499)。为了免疫，将肽通过C端半胱氨酸与KLH偶联。每4周用该蛋白质免疫兔和Balb/ c小鼠3-5次。此外，融合前第4天Balb/c小鼠接受静脉内加强，收集脾细胞，与AgS骨髓 瘤细胞融合。特异性抗体的筛选通过在蛋白质包被的ELISA微量滴定板上测试而进行(图 1)。基于在细胞裂解物的蛋白质印迹上检测到对应于EPOR的一条特异性条带，选择兔的 Mab克隆和多克隆血清。实施例2产生过表达EPOR的HELA细胞为了产生表达重组EPOR的稳定转染的HELA细胞，用来自GP2-293细胞(Clontech Laboratories, Inc)的上清液转导细胞，所述GP2-293细胞瞬时转染了编码EPOR或EPOR/ EGFP(作为与细胞内C端的融合蛋白，Invitrogen)和pVSV_G(编码弹状病毒水疱性口炎 病毒的G糖蛋白的表达载体)的逆转录表达载体。转导后两天，培养基用含有O.aiig/ml zeocine的新鲜补充的RPMI替代。对于瞬时转染实验，在12孔板中于盖玻片上将8X10E4HELA细胞放置在使用 Fugene 转染试剂(Roche Molecular Biochemicals 目录号 1815075)的 Iml 培养基中。详 细地，将3μ1 Fugene 6加至不含FCS的97 μ IRPMI 1640，在RT温育5分钟。然后，加入 1 μ g DNA混合，在RT温育15分钟。最终，在盖玻片上将50 μ 1 DNA/FuGene 6溶液加至含 有该细胞的Iml细胞培养基中。实施例3产生过表达EPOR的UT7细胞UT-7细胞系是人因子依赖性红白血病细胞系(人骨髓急性髓性白血病细胞系 DSMZ =ACC 137)，需要EPO用于长期生长。在补充有L-谷氨酰胺QmM)、非必需氨基酸 (IX)、丙酮酸钠(1福)、10%胎牛血清和1(^/1111 GM-CSF的RPMI培养基中维持UT7细胞。转 导的细胞(UT7/EP0R)维持在加入0. %ig/ml zeocine、与未转导的细胞相同的培养基(25U/ ml GM-CSF代替10U/ml)中。每次刺激之前，在补充有L-谷氨酰胺QmM)、非必需氨基酸 (IX)、丙酮酸钠(ImM)和0. 胎牛血清的RPMI培养基中温育过夜，使细胞饥饿。用来自GP2-293 细胞(Clontech Laboratories, Inc)的上清液转导 UT-7 细胞，所 述GP2-293细胞瞬时转染了编码EPO-R和pVSV_G (编码弹状病毒水疱性口炎病毒的G糖蛋 白的表达载体)的逆转录表达载体。转导后两天，培养基用含有0.%ig/ml zeocine和25U/ ml GM-CSF的新鲜补充的RPMI替代。选择后，获得在其表面上稳定表达EPOR的UT-7细胞 的细胞系。实施例4免疫沉淀于4 °C、在冰冷的裂解缓冲液[Tris 20mM(pH7. 4)、NaCl 137mM、甘油 10 %、 Nonidet P-401 %、蛋白酶抑制剂 1 X (Pierce，#78410)、磷酸酶抑制剂 1 X (Pierce#78420)] 中将UT7细胞裂解30分钟，然后于4°C以13000rpm离心10分钟(Eppendorf离心机)。于 4°C将该预澄清的裂解物上清液用抗体MAB307 (小鼠单克隆抗-人EPO-R细胞外结构域抗 体，R&D系统)和蛋白G琼脂糖小珠温育过夜。在裂解缓冲液中将小珠洗涤三次，于70°C在 还原条件下、在Nupage样品缓冲液(Invitrogen)中加热10分钟。
实施例5SDS-PAGE和蛋白质印迹法SDS-PAGE和蛋白质印迹法根据标准操作和hvitrogen的Nupage凝胶系统进行。 在Nupage Novex 4-12% Bis-1Tris凝胶的每道中上样对应于不同细胞数目的提取物。然后 将蛋白质转移到PVDF膜上，于4°C与相应抗体温育过夜。洗涤后，用缀合物抗小鼠或抗兔 IgG-POD 温育膜，用 ECL 试剂(Lumi-Light PLUS 蛋白质印迹底物，Roche Diagnostics GmbH)显影结果示于图2中。实施例6BIAC0RE 分析于25 "C、在 HBS-EP 缓冲液(pH 7. 4) (IOmM HEPESU50mM NaCl,3. 4mM EDTA, 0. 005%聚山梨酸酯20(w/v)中通过BIAC0RE 3000进行测量。加入1. Omg/ml CMD以减少 非特异性结合。结果示于表1中。表1 通过BIAC0RE分析测定结合亲和性/亲和力。亲和力通过与固定的生物素 化肽的结合而测定。所有抗体(除了 21. 3. 1)对其相应的EPOR肽显示纳摩尔/亚纳摩尔 亲和力。表 1
权利要求
1.结合人EPO受体的抗体，其特征在于，特异性结合EPO受体片段 LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQ ID NO 1)、CSSALASKPSPEGASAASFEY (SEQ ID NO 2)或 GGLSDGPYSNPYENSLIPAAEP(SEQ ID NO :3)。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于，包含SEQID NO 4或12的CDR3区为重链可 变结构域⑶R3区。
3.根据权利要求2的抗体，其特征在于，重链可变结构域包含SEQID NO 4的⑶R3区、 SEQ ID NO :5 的 CDR2 区和 SEQ IDNO :6 的 CDRl 区，或 SEQ ID NO 12 的 CDR3 区、SEQ ID NO: 13 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 14 的 CDRl 区。
4.根据权利要求3的抗体，其特征在于，重链可变结构域包含SEQID NO 4的⑶R3区、 SEQ ID NO 5的CDR2区和SEQ IDNO 6的CDRl区，且轻链可变结构域包含SEQ ID NO 7的 CDR3 区、SEQ ID NO 8 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 9 的 CDRl 区。
5.根据权利要求4的抗体，其特征在于，重链可变结构域包含SEQID N0:12的⑶R3 区、SEQ ID NO :13的CDR2区和SEQID NO 14的CDRl区，且轻链可变结构域包含SEQ ID NO 15 的 CDR3 区、SEQ ID NO 16 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 17 的 CDRl 区。
6.根据权利要求1的抗体，其特征在于，重链可变结构域包含SEQID NO 10或18。
7.根据权利要求1的抗体，其特征在于，重链可变结构域包含SEQID N0:10且轻链可 变结构域包含SEQ ID NO: 11。
8.根据权利要求1的抗体，其特征在于，重链可变结构域包含SEQID N0:18且轻链可 变结构域包含SEQ ID NO :19ο
9.用于制备包含根据权利要求1至8中任一项的抗体的诊断试剂盒的方法。
10.根据权利要求1至8中任一项的抗体用于分析人组织样品中的EPO受体的用途。
11.根据权利要求10的用途，其特征在于所述样品是人组织的裂解物。
12.根据权利要求10或11的用途，其特征在于所述分析通过免疫化学或免疫组织化学 分析来进行。
13.根据权利要求10或11的用途，其特征在于所述分析通过蛋白质印迹来进行。
全文摘要
本发明提供结合人EPO受体的抗体，其特征在于特异性结合EPO受体片段LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQ ID NO1)、CSSALASKPSPEGASAASFEY (SEQ ID NO2)或GGLSDGPYSNPYENSLIPAAEP(SEQ ID NO3)，该抗体可用于分析人组织中的EPO受体。
文档编号C07K16/28GK102131829SQ200980133040
公开日2011年7月20日 申请日期2009年8月26日 优先权日2008年8月28日
发明者M·库比斯, M·雅尔斯, N·托莱斯-纳格尔, O·穆恩迪格尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司