专利名称：突变的δ5去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明与编码突变Δ5脂肪酸去饱和酶 (其中在细胞色素b5-样结构域的HPGG基序发生至少一个突变)的核酸片段的构建和这些去饱和酶在长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的制备中的使用有关。
背景技术：
包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiIes)和酵母在内的多种不同宿主正作为商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产的手段被研究。基因工程已经证明，一些宿主 (即使是亚油酸[LA ；18:2 ω-6]和α -亚麻酸[ALA ；18:3 ω-3]脂肪酸生产天然地受限的那些)的天然能力能够被基本上改造以实现多种长链ω-3/ω-6 PUFA的高水平生产。花生四烯酸[ARA ；20:4 ω-6]、二十碳五烯酸[EPA ；20:5 ω-3]和二十二碳六烯酸[DHA ；22:6 ω-3] 的生产可能都需要△ 5去饱和酶的表达，无论这是天然能力还是重组技术的结果。迄今鉴定的大多数Δ5去饱和酶具有将二高-Y-亚麻酸[DGLA ;20:3ω-6]转化为ARA的主要活性，和将二十碳四烯酸[ETA ；20:4ω-3]转化为EPA的次要活性。在公开文献和专利文献中均已公开了多种Δ5去饱和酶。基于去饱和酶的进化，P. Sperling等人(Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 68 :73-95(2003)对 Δ 5 去饱禾口醇的一般特性作了很好的描述。连同Δ6、Δ8和Δ4去饱和酶一起，已知Δ5去饱和酶是长链 PUFA “前端”去饱和酶(其中去饱和发生在业已存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间， 与甲基定向的去饱和相反)。这些去饱和酶的特征在于三个组氨酸框[H(X)3_4H(SEQ ID NO 1 和 2)、H(X)2_3HH(SEQ ID N0:3 和 4)和 H/Q (X) 2_3HH(SEQ ID NO :5 和 6)]，并且是细胞色素 b5融合超家族的成员，因为它们在N末端具有融合的细胞色素b5结构域，该的细胞色素b5 结构域，该结构域起到电子供体的作用。所述细胞色素b5结构域还包含保守的血红素结合基序(即，组氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸序列或者叫“HPGG”[SEQ ID NO 180]序列)， 尽管其余的细胞色素b5结构域序列有差异。这些基序序列是美国专利5，972，664的主题。一些研究已表明HPGG基序与酶活性有关。Sayanova，0.等人(Plant Physiol.， 121 :641(1999))进行了定点诱变以在琉璃苣的Δ 6去饱和酶中用丙氨酸残基取代HPGG 基序的组氨酸残基。在拟南芥中表达了突变酶；然而却未能检测到酶活性，表明去饱和酶的细胞色素b5结构域对于功能是重要的。在大鼠Δ6去饱和酶中进行了类似的研究，其中在HPGG基序中进行了丙氨酸对组氨酸的取代。突变蛋白质同样不具有活性(Guillou， H.，等人，J. Lipid Res. ,45 :32-40 (2004)) 最近，Hongsthong，Α·等人(Appl. Microbiol. Biotechnol. ,72 :1192-1201(2006))报告了在螺旋藻(Spirulina)的 Δ6 去饱和酶中，用丙氨酸残基对HPGG基序的组氨酸残基的取代。与之前的报道一样，突变使得突变酶不能在大肠杆菌中产生GLA，表明细胞色素b5结构域对于活性是重要的并且该基序的改变将导致
3酶活性的降低。尽管Δ 5去饱和酶相对普通并且已被很好地描述，但依然存在对在能制造 PUFA的生产宿主细胞中以高水平有效表达的酶的需求。因此，有待解决的问题是发现适合在商业上有用的宿主细胞中整合到PUFA生物合成途径的、具有高活性的新的Δ 5去饱和酶。通过意料之外的发现，即在多种Δ 5去饱和酶的细胞色素b5结构域的HPGG基序中的改变，导致了以DGLA向ARA的转化计最高38%的酶活性升高，申请人已解决了上述问题。发明概述本发明涉及编码具有△ 5去饱和酶活性的多肽的新的遗传构建体，以及它们在细菌、酵母、藻类、眼虫、原生藻菌(stramenopiIes)、卵菌和真菌中用于生产PUFA的使用。相应地，本文提供具有Δ5去饱和酶活性的突变多肽，所述多肽包含选自下列的氨基酸基序SEQ ID NO :183 (HiS-Gly-Gly-Gly 或HGGG)、SEQ ID NO 184 (His-His-Gly-Gly 或 HHGG)、SEQ ID NO :186 (His-Cys-Gly-Gly 或 HCGG)、SEQ ID NO :187 (His-Trp-Gly-Gly 或HWGG)和SEQ ID NO :185 (His-Pro-Gly-Ser或HPGS)。优选的突变Δ 5去饱和酶多肽， 是与突变体所源自的亲本多肽的二高-Y -亚麻酸向花生四烯酸的转化效率相比，表现出更高的二高-Y -亚麻酸向花生四烯酸的转化效率的那些。在第二实施方案中，本文提供了基本上编码本发明的多肽的分离的核酸分子。在第三实施方案中，本发明提供了表达本发明的多肽的微生物宿主细胞。在第四实施方案中，本发明提供了用于生产花生四烯酸的方法，所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二高-Y-亚麻酸的存在下生长，其中二高-Y -亚麻酸被转化为花生四烯酸。在第五实施方案中，本发明提供了用于生产二十碳五烯酸的方法，所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二十碳四烯酸的存在下生长，其中二十碳四烯酸被转化为二十碳五烯酸。附图
简述和序列表图IA和图IB示出了 ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应一起观看。图2提供了下列的质粒图谱(A)pDMW369 ；和(B)pZUF17。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。下面的序列遵循37C. F. R. § 1. 821-1. 825 (“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”("Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规贝丨J 5. 2和49. 5 (a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的规定。SEQ ID NO :7-19、58、97-100、139、140 和 179-195 为编码基因或蛋白质(或其部分)或质粒的0RF，如表1中所示。表1 核酸和蛋白质SEQ ID编号摘要
说明核酸蛋白质序列标识号序列标识号富含组I酸的(His-rich)基序H(X)3H--1富含组氨酸的(His-rich)基序:H(X)4H—2富含组氨酸的(His-rich)基序H(X)2HH—3富含组氨酸的(His-rich)基序H(X)3HH4富含组氨酸的(His-rich )基序(H/Q)(X)2HH—5富含组氨酸的(His-rich )基序(H/Q)(X)3HH—6小目艮虫 (Euglena gracilis ) Δ5去子色禾口酵7 ( 1350bp)8 ( 449AA )("EgD5")来源于小眼虫的合成Δ5去饱和酶，其经密9 ( 1350bp)10(449AA)码子优化以在解脂耶氏酵母(YarrowiaUpofyiica)申表达(“EgD5S” )Euglena anabaena Λ5 ^r"EaD5")11 ( 1362bp)12 ( 454AA )来源、于Euglena anabena的合成Δ5去々包和13 (1362bp)14(454AA)酶，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达("EaD5S，，)多甲藻属未定名种 (Peridinium sp.)15 (1392bp)16 (463AA)CCMP626 Δ5 去饱和酶("RD5")来源于多曱藻属未定名种(Peridinium sp.)17 ( 1392bp)18 (463AA)CCMP626的合成Δ5去饱和酶，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达("RD5S")质粒 pDMW36919 ( 8438bp )—突变Δ5 .去饱和酶EgD5S-HXGG (即，包含—58 ( 449AA )HGGG或HHGG基序)突变Δ5去饱和酶EgD5S-HPGS (即，包含—97 ( 449AA )HPGS基序)质粒 pZUFmEaD5S98 ( 8357bp )—
权利要求
1.具有Δ5去饱和酶活性的突变多肽，所述多肽包含选自下列的氨基酸基序SEQID NO 183 (HGGG)、SEQ ID NO 184 (HHGG)、SEQ ID NO 186 (HCGG)、SEQ ID NO 187 (HWGG)和 SEQ ID NO 185 (HPGS)。
2.权利要求1的突变多肽，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列SEQID NO 58(EgD5S-HGGG 和 EgD5S-HHGG)、SEQ ID NO :97 (EgD5S_HPGS)、SEQ ID NO : 139 (EaD5S_HCGG) 和 SEQ ID NO :179 (RD5S-HCGG 和 RD5S-HWGG)。
3.权利要求1的突变多肽，其中所述突变多肽具有比亲本多肽的二高-Y-亚麻酸向花生四烯酸的转化效率更高的二高-Y -亚麻酸向花生四烯酸的转化效率。
4.基本上编码权利要求1的多肽的分离的核酸分子。
5.权利要求4的分离的核酸，所述核酸选自SEQID NO :190、SEQ ID NO :191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO :194 禾口 SEQ ID NO :195。
6.表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞。
7.权利要求6的微生物宿主细胞，所述微生物宿主细胞选自细菌、酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。
8.权利要求7的微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞是含油酵母。
9.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述含油酵母选自耶氏酵母属、假丝酵母属、 红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。
10.生产花生四烯酸的方法，所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二高-Y -亚麻酸的存在下生长，其中所述二高-Y -亚麻酸被转化为花生四烯酸。
11.生产二十碳五烯酸的方法，所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二十碳四烯酸的存在下生长，其中所述二十碳四烯酸被转化为二十碳五烯酸。
12.权利要求6的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞生产多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸选自ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸。
全文摘要
本发明涉及突变Δ5去饱和酶，其具有使二高-γ亚麻酸[DGLA；20:3ω-6]转化为花生四烯酸[ARA；20:4ω-6]和/或使二十碳四烯酸[ETA；20:4ω-3]转化为二十碳五烯酸[EPA；20:5ω-3]的能力并且在细胞色素b5-样结构域的HPGG基序中有至少一个突变。公开了分离的核酸片段和包含编码Δ5去饱和酶的此类片段的重组构建体，以及用这些突变Δ5去饱和酶在含油酵母中制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFAs”]的方法。
文档编号C07H21/00GK102197047SQ200980136806
公开日2011年9月21日 申请日期2009年9月18日 优先权日2008年9月19日
发明者D·M·W·波拉克, Q·朱 申请人:纳幕尔杜邦公司