抗-notch2抗体和使用方法

专利名称：抗-notch2抗体和使用方法
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及抗-Notch抗体，包括抗-Notch2负调节区(NRR)抗体，及其应用。还提供了抗-NotchlNRR抗体和使用方法。背景Notch受体家族是一类进化上保守的跨膜受体，其传递影响广至海胆和人的生物的发育的信号。Notch受体和它们的配体，δ和krrate(在哺乳动物中已知为Jagged) 是跨膜蛋白，其具有包含表皮生长因子(EGF)样重复序列的大的细胞外结构域。Notch同源物(paralogue)的数目在不同的物种之间不同。例如，在哺乳动物中存在四种Notch受体(Notchl-Notch4)，在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中存在两种(LIN-12 和 GLP-1)，并且在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中存在一种(Notch)。Notch 受体在运输到细胞表面的过程中，通过弗林蛋白酶样蛋白酶在跨膜结构域的N端侧的位点Sl进行蛋白水解处理，产生细胞外Notch(ECN)亚基和Notch跨膜亚基(NTM)。这两个亚基保持非共价缔合并且构成成熟的异二聚体细胞表面受体。Notch受体和Notch信号传导途径的综述例如见于 Aster 等，Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3 :587_613，2008，和 Bolos 等，内分泌学综述(Endocrine Reviews) 28 :339_363，2007。Notch2ECN亚基包含36个N-端EGF-样重复序列，后接三个在Sl位点之前的串联重复的Lin 12/Notch重复序列(LNI )组件。每个LNR组件包含三个二硫键和一组预期与钙离子配位的保守的酸性和极性残基。在EGF重复序列区域中，存在关于激活配体的结合位点。Notch2NTM包含细胞外区域(其携有S2裂解位点)，跨膜区段(其携有S3裂解位点)，和包含RAM23结构域，6个锚蛋白重复序列，反式激活结构域和羧基端PEST序列的较大细胞内部分。ECN和NTM亚基的稳定的缔合取决于异二聚体结构域(HD)，所述异二聚体结构域包含ECN的羧基端末端(术语HD-N)和NTM的细胞外氨基端末端(术语HD-C)。在配体诱导的激活前，Notch通过负调节区(NRR)以休眠构象维持，所述负调节区(NRR)包含三个LNRs和HD结构域。Notch2NRR的晶体结构在Gordon等，(2007)自然结构分子生物学 (Nature Structural&Molecular Biology) 14 :295_300，2007 中进行报道。Notch配体与ECN亚基的结合起始两个通过调节的膜内蛋白水解发生的连续的蛋白水解裂解。在位点S2由金属蛋白酶(ADAM17)进行的第一次裂解使Notch跨膜亚基对接近于质膜的内小叶(inner leaflet)的位点S3的第二次裂解敏感。位点S3的裂解，由包含早老蛋白和呆蛋白并促进Y-分泌酶活性的多蛋白复合物催化，释放Notch跨膜亚基的细胞内部分，使其移动到细胞核并激活靶基因的转录(关于Notch的蛋白水解裂解的综述， 见例如 Sisodia 等，神经科学的自然综述(Nat. Rev. Neurosci.) 3 :281-290, 2002.)。
已经在人中鉴定了 5种Jagged和δ -样类Notch配体(Jaggedl (也称为 Serratel)，Jagged2 (也称为 Serrate2)，δ -样 1 (也称为 DLL1)，δ -样 3 (也称为 DLL3)， 和δ-样4(也称为DLL4))。每种配体是一种单向(single-pass)跨膜蛋白，其具有对于结合Notch是必需的保守N-端δ，Serrate, LAG-2 (DSL)基序。在DSL基序C端的一系列 EGF样组件在跨膜区段之前。不象Notch受体，配体在C端具有70-215个氨基酸的短细胞质尾。此外，已经报道了其它类型的配体(例如，DNER，NB3，和F3/接触蛋白)。关于Notch配体和配体介导的Notch激活的综述例如见D，Souza等，癌基因(Oncogene) 27 :5148-5167, 2008)Notch途径在两翼昆虫(flies)和脊椎动物中的包括影响神经发生的那些的广泛发育和生理过程中发挥功能。一般地，Notch信号传导涉及侧抑制、谱系确定以及在细胞的组之间建立边界(见，例如Bray，分子细胞生物学(Molecular Cell Biology) 7 :678-679, 2006)。已经显示多种人疾病，包括癌症和神经变性疾病，由编码Notch受体或其配体的基因中的突变导致(见，例如，Nam等，Curr. Opin. Chem. Biol. 6 =501-509, 2002) 当在人急性淋巴母细胞白血病(acute lymphoblastic leukemias) (T-ALL)的子集中鉴定产生人 Notchl的截短的，组成性活性的变体的复发的t (7 ；9) (q34 ；q34. 3)染色体易位时，首次识别在不可抑制的Notch信号传导和恶性肿瘤之间的关联(见，例如，Aster等，Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3 :587-613,2008)。在小鼠模型中，已经显示Notchl信号传导对于T细胞发育是必需的并且Notchl-介导的信号在损害B细胞发育的情况下促进T细胞发育(见， 例如，Wilson 等，J. Exp. Med. 194 1003-1012，2001)。Notch2还涉及某些癌症。特别地，Notch2在B-细胞慢性淋巴细胞性白血病 (chronic lymphocytic leukemia) (B-CLL)中过量表达，这又导致了 CD23，即一种 B-CLL 细胞标记的过量表达。(见Hubmann等，血液(Blood) 99 :3742-3747, 2002.)。两种Notchl和 Notch2在多发性骨髓瘤(multiple myeloma)细胞(癌性血浆B细胞)中高度表达，并且用配体的刺激强烈增加肿瘤细胞生长(见Jundt等，血液(Blood) 103 :3511-3515，2004.)。 Notch2和下游效应物在黑素瘤中过量表达(见Hoek等，癌症研究(Cancer Res). 64 5270-5沘2，2004 ;Seykora 等，Am J Dermatopathol 25 :6_11，2003)，和 Notch2 基因座重复地在黑素瘤细胞系中扩增(Jonsson等，癌基因(Oncogene), 26 =4738-4748, 2007) 此外， 许多研究将异常的Notch2信号传导与乳腺癌和其它实体瘤相关联(由Leong和Karsay， 血液(Blood) 107 =2223-2233, 2006综述)。Notch2对于边缘区B细胞发育也是需要的(见 Pillai 等，Annu. Rev. Immunol. 23 :161-196,2005.)。考虑到Notch信号传导涉及多种多样的人类疾病，因此显然继续存在对于调节 Notch信号传导和具有有利于发育的临床品质的作为治疗剂的药剂的需要。本文描述的本发明满足这一需要，并且提供其它的益处。本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，全部内容结合在本文作为参考。发明简述本发明提供抗-Notch抗体和使用所述抗体的方法。在一个方面中，提供结合Notch2NRR的单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体抑制Notch2活性。在另一个实施方案中，抗体不显著结合除了 Notch2之外的Notch家族成员。在另一个实施方案中，抗体结合小鼠Notch2NRR和人Notch2NRR。在另一个实施方案中，抗体以彡IOnM的Kd结合Notch2NRR。在另一个实施方案中，提供结合Notch2NRR的单克隆抗体，其中所述抗体包含(a) HVR-Hl，其包含符合SEQ ID NO 3的共有序列的氨基酸序列；(b)HVR_H2，其包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列；(c)HVR_H3，其包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列； (d) HVR-Ll，其包含符合SEQ ID NO 10的共有序列的氨基酸序列；(e)HVR_L2，其包含符合SEQ ID NO 14的共有序列的氨基酸序列；和(f) HVR-L3，其包含符合SEQ ID NO 19的共有序列的氨基酸序列。在一个这样的实施方案中，抗体包含含有选自SEQ ID NOs :1_2的氨基酸序列的 HVR-Hl ；含有选自SEQ ID NOs :6_9的氨基酸序列的HVR-Ll ；含有选自SEQ ID NOs :11-13 的氨基酸序列的HVR-L2 ；和含有选自SEQ IDNOs :15-18的氨基酸序列的HVR-L3。在一个这样的实施方案中，HVR-Hl含有SEQ ID NO 1的氨基酸序列，HVR-Ll含有SEQ ID NO 6的氨基酸序列，HVR-L2含有SEQ ID NO 11的氨基酸序列，并且HVR-L3含有SEQ IDNO 15的氨基酸序列。在另一个这样的实施方案中，HVR-Hl含有SEQ IDNO 2的氨基酸序列，HVR-Ll 含有SEQ ID NO :7的氨基酸序列，HVR-L2含有SEQ ID NO :11的氨基酸序列，并且HVR-L3 含有SEQ ID NO 16的氨基酸序列。在另一个这样的实施方案中，HVR-Hl含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列，HVR-Ll含有SEQ ID NO 8的氨基酸序列，HVR-L2含有SEQID NO 12的氨基酸序列，HVR-L3含有SEQ ID NO 17的氨基酸序列。在另一个所述实施方案中，HVR-Hl含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列，HVR-Ll含有SEQ ID NO 9的氨基酸序列，HVR-L2含有SEQ ID NO 13的氨基酸序列，HVR-L3含有SEQ ID NO 18的氨基酸序列。在上述实施方案中之一，抗体还包含选自人VH接纳体2构架和人VLk亚组I共有构架的至少一个构架。在另一个方面中，提供结合Notch2NRR的单克隆抗体，其中所述抗体包含与选自 SEQ ID NO 20-21的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变结构域和与选自SEQ ID NO :22-25的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变结构域。在一个实施方案中，抗体包含与SEQ IDNO 20的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变结构域和与SEQID NO :22的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变结构域。在一个这样的实施方案中，所述重链可变结构域含有SEQ ID NO :20的氨基酸序列，并且轻链可变结构域含有SEQ ID NO :22的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体含有与SEQ ID NO 21的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变结构域，以及与选自SEQ ID NOs 23-25的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变结构域。在一个这样的实施方案中，重链可变结构域含有SEQ ID NO :21的氨基酸序列，并且轻链可变结构域含有选自SEQ ID NOs 23-25的氨基酸序列。在另一个方面中，提供这样的分离的抗体，所述抗体结合与选自抗体D、抗体D-1、 抗体D-2或抗体D-3的抗体相同的表位。在另一个方面中，提供这样的分离的抗体，所述抗体结合Notch2的LNR-A结构域和HD-C结构域。在另一个方面中，抗_Notch2NRR 抗体是选自 Fab，Fab，-SH, Fv, scFv，或(Fab，)2 片段的抗体片段。在另一个方面中，抗_Notch2NRR抗体是人源化的、嵌合的或人抗体。上述实施方案的任一个可以是单独的或组合的。
在另一个方面中，提供抑制Notch2活性的方法，所述方法包括使表达Notch2的细胞暴露于上述实施方案中任一项的抗体。在另一个方面中，提供治疗与Notch2增加的表达或活性相关的疾病的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的上述实施方案中任一项的抗体。在另一个方面中，提供治疗B-细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的上述实施方案中任一项的抗体。在另一个方面中，提供治疗黑素瘤的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的上述实施方案中任一项的抗体。在另一个方面中，提供治疗与Notchl增加的表达或活性相关的疾病的方法，所述方法包括向需要其的受试者共同施用有效量的抗-NotchlNRR抗体和选自地塞米松 (dexamethasone)和他莫昔芬(tamoxifen)的治疗剂，其中所述治疗剂减少由所述抗体导致的改变的肠细胞分化。在一个这样的实施方案中，所述疾病是T细胞恶性肿瘤。附图简述

图1显示被称为抗体D，抗体D-1，抗体D-2，和抗体D-3的抗_Notch2NRR单克隆抗体的H1，H2，和H3重链高变区(HVR)序列，如在实施例B(I)中所述。氨基酸位置按照Kabat 编号系统进行编号，如下所述。图2显示被称为抗体D，抗体D-1，抗体D-2，和抗体D-3的抗_Notch2NRR单克隆抗体的Li，L2，和L3轻链HVR序列，如在实施例B (1)中所述。氨基酸位置按照Kabat编号系统进行编号，如下所述。图3显示抗体D、抗体D-1、抗体D-2和抗体D_3的重链可变区序列的比对。在盒中附上HVRs，如在实施例B(I)中所述。图4显示抗体D、抗体D-1、抗体D-2和抗体D_3的轻链可变区序列的比对。在盒中附上HVRs。图5A和5B显示用于实施本发明的示例性接纳体人可变重链(VH)共有构架序列。 序列标识符如下-人VH 亚组 I 共有构架 “A” 减去 Kabat CDRs (SEQ ID NOs :32，33，34，35)。-人VH亚组I共有构架“B，，，“C，”和“D”减去延伸的高变区(SEQIDNOs =36,37, 34,35 ；SEQ ID NOs :36，37，38，35 ；和 SEQ ID NOs :36，37，39，35)。-人VH 亚组 II 共有构架 “A” 减去 Kabat CDRs (SEQ ID NOs :40,41,42,35).-人VH亚组II共有构架“B，”“C，”和“D”减去延伸的高变区(SEQ IDNOs :43， 44,42,35 ；SEQ ID NOs :43，44，45，35 ；和 SEQ ID NOs :43，44，46，和 35)。-人VH 亚组 III 共有构架 “A” 减去 Kabat CDRs (SEQ ID NOs :47，48，49，35)。-人VH亚组III共有构架“B，”“C，”和“D”减去延伸的高变区(SEQ IDNOs 50， 51,49,35 ；SEQ ID NOs :50，51，52，35 ；和 SEQ ID NOs :50，51，53，35)。-人VH 接纳体构架 “A” 减去 Kabat CDRs (SEQ ID NOs :54，48，55，35)。-人VH接纳体构架“B”和“C”减去延伸的高变区(SEQID NOs =50,51,55,35 ；和 SEQ ID NOs :50,51,56,35)。-人VH 接纳体 2 构架 “A” 减去 Kabat CDRs (SEQ ID NOs :54，48，57，35)。-人VH接纳体2构架“B，”“C，”和“D”减去延伸的高变区(SEQ IDNOs =50,51, 57,35 ；SEQ ID NOs :50，51，58，35 ；和 SEQ ID NOs :50，51，59，35)。图6显示用于实施本发明的示例性接纳体人可变轻链(VL)共有构架序列。序列
7标识符如下-AVLk 亚组 I 共有构架(κν1) :SEQ ID NOs :60,61,62,63-AVLk 亚组 II 共有构架(κ v2) :SEQ ID NOs :64,65,66,63-AVLk 亚组 III 共有构架(κ v3) :SEQ ID NOs :67,68,69,63-AVLk 亚组 IV 共有构架(κ v4) =SEQ ID NOs :70,71,72,63图7显示huMAb4D5_8轻链和重链的构架序列。以上标/粗体表示的数字指示根据Kabat的氨基酸位置。图8显示具有指定的修饰的huMAb4D5_8轻链和重链的构架序列。以上标/粗体表示的数字指示根据Kabat的氨基酸位置。图9A和9B显示特异性结合它们的关联受体的抗-NRRl和抗-NRR2抗体，如在实施例B(I)中所述。(A)ELISA测定法，其测量抗-NRRl (左图)和抗-NRR2(右图)与来自四种人(h)和鼠(m)Notch受体的每种的纯化的NRR蛋白片段的结合。将在y轴上以A56tl描述的结合针对抗-NRRl或抗-NRR2的滴定进行作图。(B) FACS测定法，其测量抗-NRRl (组图1-6)或抗_NRR2(组图7-12)与未转染的Kl-CHO细胞(组图1，4，7和10)，稳定转染了 N-myc-Notchl 的 Kl-CHO 细胞(组图 2，5，8 禾口 11)或稳定转染了 N-myc_Notch2 的 Kl-CHO 细胞(组图3，6，9和12)的结合。N-myc-Notch转基因在可诱导的tet启动子的控制下表达；底部的行，在缺乏用多西环素(doxycycline)诱导的情况下的对照表达(_Dox)；顶部的行，在添加多西环素后诱导的表达(+Dox)；注意，Kl-CHO系内源表达Notch2，其在存在和不存在多西环素的情况下由抗-NRR2检测(例如，比较组图7和10)。图10A-C显示抗-NRRl和抗-NRR2特异性抑制来自它们的靶向受体的信号传导， 所述靶向的受体包括携带激活的突变的受体，如在实施例B(2)和B(3)中所述。㈧共同培养测定法，其测量Notchl信号传导的抗-NRRl抑制。将稳定转染Jagl的NIH-3T3细胞用于诱导稳定转染了 Notchl的NIH-3T3细胞中的Notch信号传导(除了 “-Jagl”，其使用未转染的NIH-3T3细胞取代表达Jagl的细胞)。使用Notch报道基因(CSL-依赖性启动子驱动的萤火虫萤光素酶的表达)测量Notch信号传导并且相对于根据DAPT条件标准化的对照基因表达(组成型启动子驱动的Renilla萤光素酶的表达)(定义为1的值)来表达所述Notch信号传导。+Jagl，标准的共培养测定法；DMS0，单独的DAPT赋形剂；在DMSO中的 5 μ M DAPT ； α -gD, 2000ng/ml的同种型对照抗体；α -NRRl，在指定浓度的抗-NRRl抗体；最后的四次测定法包括80ng/ml的α -NRRl或α -gD加纯化的Notchl或Notch2NRR蛋白片段，如所指定(+NRRl或+NRI^)。(B)共同培养测定法，其测量Notch2信号传导的抗-NRR2 抑制。将稳定转染了 Jagl的NIH-3T3细胞用于诱导在表达高水平的Notch2的U87MG细胞中的Notch信号传导。如在(A)中所述进行测定法。(C)共同培养测定法，其测量来自野生型或突变体Notchl受体的Notchl信号传导的抗-NRRl抑制。如在(A)中所述进行该测定法，除了通过瞬时转染表达指定的Notchl受体的质粒产生表达受体的细胞。WT，野生型Notchl ； APEST，缺乏PEST结构域的Notchl ；L1594P，携带指定的组成型激活的点突变的 Notchl ；E25,625ng/ml 同种型对照抗体；α -NRRl，625ng/ml 抗-NRRl 抗体；DMS0，单独的 GSI赋形剂；在DMSO中的5 μ M DAPT ；CmpE,在DMSO中的1 μ M化合物Ε。图IlA-D显示抗-NRRl和抗-NRR2作为受体特异性抑制剂在体内发挥功能，如在实施例B(4)中所述。将Balb/c小鼠以5mg/kg的α -gD同种型对照、α -NRRl或α -NRR2每四天四次地注射，并且在第四次给药后一天，即在第13天将细胞从胸腺或脾中收集。(A) 胸腺重量测量。相对于总的体重(以g表示)表示胸腺重量(以mg表示)。值表示关于每组三只小鼠的平均值加标准偏差。⑶胸腺细胞计数。(C)⑶4和⑶8FACS，以鉴定⑶47⑶8+ 双阳性T细胞。数字表示在双阴性、单阳性和双阳性群体中的胸腺细胞的百分比。相对于抗_gD对照(77. 5%)，抗-NRRl显著减少了细胞在⑶47⑶8+群体中的百分比(5. 89%)，而抗-NRR2(80% )没有明显的作用。(D)⑶21和⑶23FACS，来鉴定边缘区B细胞。数字表示在MZB门控(gate)中的细胞的平均百分比士标准偏差(来自三只动物)，其以框表示；还注释P值；对来自每组的三只动物之一的代表点图进行作图。相对于抗_gD对照(6. 61%), 抗-NRR2几乎消除了 MZB细胞(0. 97% )，而抗-NRRl (6% )不具有显著作用。在图12A-D中，抗-NRRlFab/NRRl共晶体的2.2k结构显示抗-NRRl同时接触 LNR-A, LNR-B和HD-C结构域，如在实施例B (5)中所述。(A)表总结了 α -NRRl或α -NRR2 与Notchl-NRR或Notch2NRR嵌合蛋白片段的结合。指定的NRR蛋白片段(深蓝，Notchl 序列；浅蓝，Notch2序列)作为融合于碱性磷酸酶的分泌的蛋白表达从而使抗体结合能够在基于板的测定法中快速测量。在使用碱性磷酸酶活性对NRR表达和分泌进行标准化后， 将包含指定的NRR嵌合蛋白的培养基加入已经用α-NRRl，ci-NRR2或同种型对照抗体(用于评估背景结合，未显示)包被的96孔板中。通过测量与所述板保持结合的碱性磷酸酶活性来评估抗体结合。Y，强结合；N，没有观察到结合;W，观察到的较弱结合。(B)人Notch NRRl的结构。将NRRl显示为C-α草图(cartoon)。将在LNR基序中的三个钙离子显示为球体。S2裂解位点的位置用箭头标记。(C)基于结构上保守的原子的NRRl在NRR2(来自 Pdb编码2004的链A)上的叠加。将NRRl (阴影)和NRR2 (白色)显示为C- α踪迹。(D) 在NRRl (左)和α-NRRlFab (右，在重链和轻链之间的边界，显示为黑色虚线)之间的界面的清楚视图。显示溶剂可及的表面区域被复合物形成包埋(buried)的程度。标记被包埋至少50%的残基，其中将在Notchl和Notch2中相同的NRR残基以黑色字体标记(还见图 18)。图13A-C显示抗-NRRl导致内皮细胞高度芽生(hypersprouting)，如在实施例 B(6)中所述。(A)体外内皮细胞芽生测定法。HUVECs被包被在Cytodex珠上并且与皮肤成纤维细胞共同培养。将培养物进行模拟处理(对照)或用1 μ M的DBZ，5 μ g/ml的α -NRRl 或5yg/ml的a-D114进行处理。棒=IOOym. (B)从在(A)中的培养物进行的芽长度测量。(C)关于内皮细胞芽生和血管发生进行的新生小鼠视网膜测定。将新生小鼠在Pl和 P3用指定的抗体进行注射，并且在P5制备视网膜从而观察增殖的同工凝集素或Ki67标记的灌注。组图I和II，棒=1mm。组图III-VI表示组图I和II的部分的增大，棒=0. 2mm。图14A-E显示Notchl信号传导的选择性抗体封闭破坏肿瘤血管发生并且抑制肿瘤生长，如在实施例B(7)中所述。在用指定的抗体α-豚草(阴性对照)，α-VEGF或 α -NRRl处理后，关于三种肿瘤异种移植模型显示肿瘤体积(平均值+/-SEM)对比时间的图表。关于α-豚草对比α-NRRl比较显示P值。(A)Calu6模型。(B)HM7模型。(C)关于α -NRRl剂量滴定的ΗΜ7模型。(D)来自显示在(A)中的Calu6模型的代表性肿瘤切片的内皮细胞染色。在顶部显示在异种移植模型中所用的抗体。将DAPI和a-CD31分别用于对DNA和内皮细胞染色。板的底排显示合并的图像。棒=50μπι. (E)⑶31染色的量化显示在⑶中。使用图像J来量化图像中的⑶31和DAPI染色，类似于在⑶中显示的那些，将相对CD31染色(被标准化为DAPI染色的CD31染色)关于三种抗体处理的每种，相对于 α-豚草对照(将其设定为1的值)进行作图；数据表示在8个图像域内的平均值+/_标
准偏差。图15A-C显示Notchl的选择性抗体封闭足以改变小肠中的细胞命运(fate)，如在实施例B(8)中所述。㈧总的体重变化(平均值+/_标准偏差)对比时间。将小鼠如图11 所述，用抗_gD同种型对照、LT β R-Fc、抗-NRRl或抗-NRR2进行处理。箭头标记给药天数。 (B)小肠的免疫组化分析。将小鼠用指定浓度的抗_gD同种型对照、DBZ或抗-NRRl在第 0、2和6天进行处理，并且在第7天制备小肠用于免疫组化分析。在指定的每排，显示关于苏木精和曙红(H&E)，关于黏蛋白并且标记分泌杯形细胞的爱茜蓝，标记帕内特细胞的溶菌酶，关于增殖的Ki-67和作为Notch下游靶标的Hesl的染色。见图19和20分别关于在第 7天的大肠和在第2天的小肠的分析。棒=40 μ m. (C)关于小肠细胞分化比较Notchl-对比Notch2_的特异性抑制。在用指定的α -gD, α -NRRl或α -NRR2的最后一次给药后1天， 关于爱茜蓝和Ki-67制备在(A)中所述的研究的小肠。棒=50 μ m。图16显示抗-NRRl是由多种配体诱导的Notchl信号传导的潜在抑制剂，如在实施例B(2)中所述。如在图IOA中所述进行Notchl信号传导的共同培养测定，除了表达指定的Jagl，Jag2或Dlll的配体表达细胞之外。图17显示低产率的NotchlNRR/Notch2NRR嵌合蛋白构建体，如在实施例B (5)中所述。表补充图12A，列举了产生较少或无分泌的碱性磷酸酶活性的NRR嵌合蛋白，提示嵌合体错折叠或是不稳定的。对于产生较弱但是可检测的碱性磷酸酶活性的那些片段，总结 α -NRRl或α -NRR2的结合。一_，无表达和不可测试的结合；N，无表达或结合；W，较弱的表达或结合。图18显示与抗-NRRl接触的NRRl残基的保守性，如在实施例B(I)和B (5)中所述。人 NotchlNRR 结构域(SEQ ID NO J6)，小鼠 NotchlNRR 结构域(SEQ ID Ν0:27)，人 Notch2NRR结构域(SEQ ID NO 28)和小鼠Notch2NRR结构域(SEQ ID NO 29)的氨基酸序列比对，其中在右侧显示亚结构域边界。将人NotchlNRR列举为参照序列，并且将与在人 Notchl中的那些相同的其它NRR序列中的残基以粗体字体显示。概括了至少25%包埋在抗-NRRl-Fab/Notchl-NRR结构(图12)中的残基，其中实线对比虚线反映了残基包埋的增加的程度。在至少25%包埋在人Notchl序列中的21个氨基酸中，在小鼠Notchl序列中的所有21个是相同的，但是仅6个在人和小鼠Notch2序列中是相同的(加上T取代在人 NotchlS1712的S的第7个保守性差异)；在Notch2序列中的这些相同和“包埋”的残基中， 没有在> 75%包埋类别中的。这种序列比较与(a)和人与小鼠Notchl的强烈抗-NRRl结合(约相同的亲和性)以及(b)缺乏抗-NRRl与人和小鼠Notch2的结合一致。而且，包埋的残基都位于LNR-A，LNR-B和HD-C中，与在图IlA和17中显示的结构域交换实验一致。图19显示Notchl的选择性抗体封闭足以改变在大肠中的细胞命运，如在实施例 B(S)中所述。来自在图15B中所述实验的在第7天取的大肠样品的组织病理学分析。图20显示在封闭Notchl后2天的小肠细胞命运变化发展，如在实施例B (8)中所述。来自在图15B所述实验的在第2天取的小肠样品的组织病理学分析，其显示在第7天取的样品。图21显示抗-NRRl并没有体外封闭Notch2_诱导的信号传导，如在实施例B (2)中所述。在U87MG细胞中的共培养测定法，如在图IOB中所述。尽管抗-NRRl在体外(图10A) 和在体内(图11A-C)有效抑制Notchl信号传导，但其没有影响Notch2信号传导，甚至当以高于IC5tlIOO倍以上的浓度(lOOOng/ml)使用时也是如此。该结果同抗-NRRl与Notchl 的特异性结合(图9和12)以及Notch2的抗-NRRl抑制在体内的缺乏相一致(图11D)。图22显示抗-NRRl和抗-NRR2对小肠细胞分化的可能的协同作用，如在实施例B8 中所述。图23显示地塞米松至少部分地拯救由抗-NRRl导致的小肠表型，如在实施例B (9) 中所述。图24A和B显示Notchl或Notch2的选择性封闭使与pan-Notch抑制相关的杯形细胞化生最小化或避免这样的杯形细胞化生，而封闭Notchl和Notch2导致严重的杯形细胞化生。(A)如在实施例B8中所述，将小鼠用5mg/kg的抗-NRR1，抗-NRR2，或两者，或阴性对照抗体抗_gD在用箭头标记的当天进行给药；显示总的体重变化(平均值+/_标准偏差)对比时间。(B)对在(A)中处理的小鼠的小肠的免疫组化分析，使用关于黏蛋白的爱茜蓝来标记分泌性杯形细胞。图25A和25B显示抗-NRR2 (称为“抗-N2”)在体外抑制人黑素瘤细胞系SK23和 LOX-IMVI的生长，如在实施例B (10)中所述。图沈显示抗_NRR2(被称为“抗-Notch2”)对五种扩散的大B-细胞淋巴瘤(DLBCL) 细胞系(在右侧列举)的作用。如在实施例B(Il)中所述，细胞系之一，“DB，”的生长强烈地通过用抗-NRR2处理而被抑制。图27显示抗-NRR2 (被称为“抗_Notch2” )随时间对DB DLBCL细胞系的生长的作用，如在实施例B(Il)中所述。本发明实施方案详述本发明提供结合Notch的分离的抗体和使用所述抗体的方法，例如用于诊断或治疗与Notch的表达或活性相关的疾病。I. 一般技术本文所述或参考的技术和方法通常是充分了解的，并且由本领域技术人员使用常规方法一般应用，如例如，在下述参考文献中所述广泛使用的方法Sambrook等.，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning =ALaboratory Manual)，第 3 版(2001)冷泉港实验室出版社，冷泉港，N. Y.在分子生物学中目前使用的方法(⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLE⑶LAR BIOLOGY) (F. Μ. Ausubel，等.编辑，(2003))；酶学方法(Methods IN ENZYM0L0GY)系列 (学术出版社公司)=PCR 2 实用方法(PCR 2 :A PRACTICAL APPROACH) (Μ. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 编辑(1995))，Harlow 和 Lane,编辑(1988)抗体，实验室手册，和动物细胞培养(ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE) (R. I. Freshney，编辑(1987))；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis) (Μ. J. Gait, 编辑，1984)；分子生物学方法(Methods in Molecular Biology) ,Humana出版社；细胞生物学实验室笔记(Cell Biology :A Laboratory Notebook) (J. E. Cellis，编辑，1998)学术出版社；动物细胞培养(Animal Cell Culture) (R. I. Freshney)，编辑，1987)；细胞和组织培养介绍(Introduction to Cell and Tissue Culture) (J. P. Mather禾口P. E. Roberts, 1998) Plenum出版社；细胞和组织培养实验室方法(Cell and Tissue Culture laboratoryProcedures) (A. Doyle, J. B. Griffiths，和 D. G. Newell，编辑，1993-8) J. Wiley 和 Sons ；实验室免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology) (D. Μ· Weir 禾口 C. C. Blackwel 1， 编辑)；哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells) (J. M. Miller 和 Μ. P. Calos,编辑，1987) ；PCR 聚合酶链式反应(PCR :The Polymerase Chain Reaction), (Mullis 等.，编辑，1994)；免疫学目前使用的方法(Current Protocols in Immunology) (J. Ε. Coligan等.，编辑，1991)；分子生物学中的简便方法(Short Protocols in Molecular Biology) (Wiley 禾口 Sons, 1999)；免疫生物学(Immunobiology) (C.A. Janeway 和 P.Travers，1997)；抗体(Antibodies) (P. Finch, 1997)；抗体实用方法 (Antibodies :A Practical Approacti) (D. Catty.，编辑，IRL 出版社，1988-1989)；单克隆抗体实用方法(Monoclonal Antibodies :A Practical Approach (P. Shepherd禾口 C. Dean, 编辑，牛津大学出版社，2000)；使用抗体实验室手册(Using Antibodies =A Laboratory Manual) (Ε. Harlow 和 D. Lane (冷泉港实验室出版社，1999)；抗体(The Antibodies) (Μ. Zanetti和J. D. Capra，编辑，Harwood学术出版社，1995)；和癌症肿瘤学的原理和实践 (Cancer !Principles and Practice ofOncology) (V. Τ· DeVita等·，编辑，J. B. Lippincott 公司，1993)。II.定义出于解释本说明书的目的，应用下面的定义，并且只要适合，以单数使用的术语也包括复数形式，并且反之亦然。当在下面提出的任何定义与作为参考结合在本文中的任何文献冲突时，以下面的定义为准。术语“抗体”在本文以最广义使用，具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。“分离的抗体”指已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从其回收的抗体。抗体的天然环境的污染性成分指将会干扰其研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、 和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将抗体纯化至(1)通过例如Lowry法的测定，超过95重量％的抗体，并且在一些实施方案中，纯化至超过超过99重量％的抗体，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪(spinning cup sequenator)获得至少 15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或C3)通过使用例如考马斯蓝或银染色在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。“天然抗体”通常是约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白，所述糖蛋白由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。将每条轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(Vh)，其后是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域并且在其另一端具有恒定结构域；将轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域比对，而将轻链可变结构域与重链可变结构域进行比对。认为特定氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。术语“抗-NotchlNRR抗体”或“结合NotchlNRR的抗体”指能够以足够的亲和性
12结合NotchlNRR从而使抗体可以用作靶向Notchl的诊断剂和/或治疗剂的抗体。优选地， 抗-NotchlNRR抗体与不相关的非Notch蛋白结合的程度少于如通过例如放射性免疫测定法(RIA)测量的抗体与NotchlNRR结合的约10%。在某些实施方案中，结合NotchlNRR的抗体具有彡1 μ M，< IOOnM, ( IOnM, ( InM,或彡0. InM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗-NotchlNRR抗体结合这样的Notch的表位，其在来自不同物种，例如啮齿动物(小鼠，大鼠)和灵长类动物的Notch中是保守的。术语“抗-Notch2NRR抗体”或“结合Notch2NRR的抗体”指能够以足够的亲和性结合Notch2NRR从而使抗体可以用作靶向Notch2的诊断剂和/或治疗剂的抗体。优选地， 抗-Notch2NRR抗体与不相关的非Notch蛋白结合的程度少于如通过例如放射性免疫测定法(RIA)测量的抗体与Notch2NRR结合的约10%。在某些实施方案中，结合Notch2NRR的抗体具有彡1 μ M，< IOOnM, ( IOnM, ( InM,或彡0. InM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗-Notch2NRR抗体结合这样的Notch的表位，其在来自不同物种，例如啮齿动物(小鼠，大鼠)和灵长类动物的Notch中是保守的。抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以称为“VH”。轻链的可变结构域可以称为“VL”。这些结构域通常是抗体最可变的部分并且包含抗原结合位点。术语“可变的”指可变结构域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均勻分布于抗体的整个可变结构域。它集中于轻链和重链可变结构域中称作高变区(HVRs)的三个区段。可变结构域中更加高度保守的部分被称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，它们大多采取折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成折叠结构一部分的三个HVRs连接。每条链中的HVRs通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVRs —起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，国家健康研究所 (National Institute of Health) ,Bethesda,MD. (1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。基于它们恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分为两种清楚区分的类型之一，称为kappa(K)和lambdaU)。取决于它们重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分为不同的种类。存在五种主要的免疫球蛋白类别IgA，IgD, IgE, IgGjP IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1JP IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，Y，和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并且通常描述在例如Abbas等细胞和分子免疫学(CeHular and Mol. Immunology)第 4 版(W. B. Saunders, Co.，2000)中。抗体可以是更大的融合分子的部分，通过抗体与一种或多种其它蛋白或肽的共价或非共价缔合形成。术语“全长抗体，，，“完整的抗体”和“完整抗体”在本文交替地用于指以其基本完整形式存在的抗体，而非下文定义的抗体片段。术语特别指包含Fc区的重链的抗体。用于本文目的的“裸抗体”是未缀合于细胞毒性结构部分或放射性标记的抗体。“抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab，Fab' ,F(ab' )2，和Fv片段；双抗体；直链抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，所述 “Fab”片段每个具有单抗原结合位点，以及残余的“Fe”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F (ab’)2片段，所述片段具有两个抗原组合位点，并且仍旧能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(SCFV)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个HVRs相互作用从而限定在VH-VL 二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个HVRs将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVRs的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，然而亲和性低于完整结合位点。Fab片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域并且还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CHl结构域的羧基端加入几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’ -SH是本文关于 Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶联。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单多肽链存在。一般地，所述scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，所述接头使scFv形成对于抗原结合需要的结构。关于scFv的综述参见例如PluckthUn于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (单克隆抗体药理学)，卷 113, Rosenburg 禾口 Moore 编辑，(Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315 中。术语“双抗体(diabodies) ”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在相同的多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短所以不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体更充分地描述于例如 EP 404, 097 ；WO 1993/01161 ；Hudson 等，Nat. Med. 9 :129-134(2003)； 和 Hollinger 等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 90 :6444-6448(1993) 中。三链抗体(triabodies)和四链抗体(tetrabodies)还在 Hudson 等，Nat. Med. 9 129-134(2003)中进行描述。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变(例如天然存在突变)夕卜。 因此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。在某些实施方案中，所述单克隆抗体典型地包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶标结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择方法可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合)中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶标结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶标的亲和性、将靶标结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优点在于它们典型地未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein，自然(Nature) 256 :495-97 (1975)； Hongo 等，杂交瘤(Hybridoma)，14 (3) =253-260 (1995) ； Har low 等，抗体实验室手册 (Antibodies :A Laboratory Manual)，(冷泉港实验室出版社，第 2 版.1988) ；Hammer ling 等，于单克隆抗体和 T-细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas), 563-681,Elsevier,N. Y.，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No. 4，816，567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等，自然(Nature) 352 :624-628(1991) ；Marks等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol. )222 :581-597(1992) ；Sidhu 等，分子生物学杂志(JMol. Biol. )338(2) 299-310(2004) ；Lee 等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 340 (5) :1073-1093(2004)； Fellouse，美国国家科学院学报(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 101 (34) :12467-12472(2004)； 及 Lee 等，免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods) 284 (1-2) 119-132 Q004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如 WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；W01991/10741 ； Jakobovits 等，美国国家科学院学报(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 90 :2551(1993)； Jakobovits 等，自然(Nature) 362 :255-258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. 7 33 (1993)；美国专利号 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ； 5，661，016 ；Marks 等，生物 / 技术(Bio/technology) 10 :779-783 (1992) ；Lonberg 等，自然(Nature) 368 :856-859(1994) ；Morrison,自然(Nature) 368 :812-813 (1994) ；Fishwild 等，自然生物技术(Nature Biotechnol.) 14 :845-851 (1996) ；Neuberger,自然生物技术 (Nature Biotechnol.) 14 :826(1996)；及 Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995))。单克隆抗体在本文中具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(见，例如美国专利号.4，816，567和 Morrison 等，美国国家科学院学报(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) USA 81 :6851-6855 (1984))。
嵌合抗体包括PRIMATIZED 抗体，其中抗体的抗原结合区来自通过例如用目的抗原免疫猕猴产生的抗体。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的HVR残基用具有期望特异性、亲和性和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的HVR残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的 FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节例如参见Jones等，自然(Nature) 321 :522-525(1986) ；Riechmann等，自然 (Nature) 332 :323-329 (1988)；及 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992)。还可参见例如 Vaswani 禾口 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma&Immunol. 1 :105-115(1998) ；Harris, Biochem.Soc. Transactions 23 :1035-1038(1995) ；Hurle 禾口 Gross, Curr. Op. Biotech. 5 428-433 (1994)；及美国专利号 6，982，321 和 7，087，409。“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，分子生物学杂志(j. Mol. Biol.) 227 :381 (1991)； Marks等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol. )222 :581 (1991))。关于制备人单克隆抗体的还可获得的方法是在Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R. Liss, p. 77(1985) ；Boerner 等，免疫学杂志(J. Immunol.) 147(1) 86-95(1991)中所述的方法。还见 van Dijk 禾口 van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol.，5 368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用于已经被修饰从而响应于抗原激发产生所述抗体，但是其内源基因座已经失能的转基因动物进行制备，所述转基因动物例如被免疫的异种小鼠。(见，例如，美国专利号6，075，181和6，150，584，关于XEN0M0USETM技术).还见， 例如 Li 等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 103 :3557-3562(2006)关于通过人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变结构域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR:三个在VH中(HI、 H2、H3)，三个在VL中(Li、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精细特异性中发挥独特作用。参见例如Xu等免疫性(Immunity) 13 :37-45^000) Johnson 和 Wu 于分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology) 248 :1-25 (Lo，编辑，Human 出版社，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼科动物抗体(camelid antibody)在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如 Hamers-Casterman 等，自然(Nature) 363 :446-448(1993) ；Sheriff 等，自然结构生物学(Nature Struct. Biol.) 3 :733-736 (1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补性决定区(OTR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，免疫目的蛋白序列Gequences of Proteins of Immunological Interest)，第 5 版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD. (1991))。Chothia 改为f皆结构环的位置(Chothia 和 Lesk 分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 196 :901-917 (1987))。AbM HVR 代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些 HVR中每一个的残基。
权利要求
1.一种单克隆抗体，其结合Notch2NRR并抑制Notch2活性。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体不显著结合于除了Notch2之外的Notch家族成员。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合小鼠Notch2NRR和人Notch2NRR。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体以彡IOnM的Kd结合Notch2NRR。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)HVR-Hl，其包含符合SEQID NO 3的共有序列的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQID NO 4的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQID NO 5的氨基酸序列；(d)HVR-Ll，其包含符合SEQ ID NO 10的共有序列的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含符合SEQID NO 14的共有序列的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含符合SEQID NO 19的共有序列的氨基酸序列。
6.权利要求5的抗体，其中所述抗体包含含有选自SEQID NOs :1-2的氨基酸序列的 HVR-Hl ；含有选自SEQ ID NOs :6_9的氨基酸序列的HVR-Ll ；含有选自SEQ ID NOs :11-13 的氨基酸序列的HVR-L2 ；和含有选自SEQ ID NOs :15-18的氨基酸序列的HVR-L3。
7.权利要求6的抗体，其中所述HVR-Hl含有SEQID NO=I的氨基酸序列，所述HVR-Ll 含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列，所述HVR-L2含有SEQ ID NO 11的氨基酸序列，并且所述 HVR-L3含有SEQ ID NO 15的氨基酸序列。
8.权利要求6的抗体，其中所述HVR-Hl含有SEQID NO 2的氨基酸序列，所述HVR-Ll 含有SEQ ID N0:7的氨基酸序列，所述HVR-L2含有SEQ ID NO 11的氨基酸序列，并且所述 HVR-L3含有SEQ ID NO 16的氨基酸序列。
9.权利要求6的抗体，其中所述HVR-Hl含有SEQID NO 2的氨基酸序列，所述HVR-Ll 含有SEQ ID NO :8的氨基酸序列，所述HVR-L2含有SEQ ID NO 12的氨基酸序列，并且所述 HVR-L3含有SEQ ID NO 17的氨基酸序列。
10.权利要求6的抗体，其中所述HVR-Hl含有SEQID NO 2的氨基酸序列，所述HVR-Ll 含有SEQ ID N0:9的氨基酸序列，所述HVR-L2含有SEQ ID NO 13的氨基酸序列，并且所述 HVR-L3含有SEQ ID NO 18的氨基酸序列。
11.权利要求5的抗体，其还包含选自人VH接纳体2构架和人VLκ亚组I共有构架的至少一个构架。
12.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含与选自SEQID NO :20-21的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变结构域和与选自SEQID NO :22-25的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变结构域。
13.权利要求12的抗体，其中所述抗体包含与SEQID NO :20的氨基酸序列具有至少 90%序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO :22的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变结构域。
14.权利要求13的抗体，其中所述重链可变结构域含有SEQID NO :20的氨基酸序列， 并且所述轻链可变结构域含有SEQ ID NO :22的氨基酸序列。
15.权利要求12的抗体，其中所述抗体含有与SEQID NO :21的氨基酸序列具有至少 90%序列同一性的重链可变结构域，以及与选自SEQ IDNOs :23-25的氨基酸序列具有至少、90 %序列同一性的轻链可变结构域。
16.权利要求15的抗体，其中所述重链可变结构域含有SEQID NO :21的氨基酸序列， 并且所述轻链可变结构域含有选自SEQ ID NOs :23-25的氨基酸序列。
17.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合与选自抗体D、抗体D-1、抗体D-2或抗体D-3 的抗体相同的表位。
18.权利要求17的抗体，其中所述抗体结合Notch2的LNR-A结构域和HD-C结构域。
19.在前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是选自Fab，Fab’_SH，Fv，scFv，或 (Fab，)2片段的抗体片段。
20.在前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化的抗体或嵌合的抗体。
21.抑制Notch2活性的方法，所述方法包括将表达Notch2的细胞暴露于权利要求 1-18中任一项的抗体。
22.治疗与Notch2增加的表达或活性相关的疾病的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的权利要求1-18中任一项的抗体。
23.治疗B-细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的权利要求1-18中任一项的抗体。
24.治疗黑素瘤的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的权利要求1-18 中任一项的抗体。
25.权利要求1-18中任一项的抗体用于制备治疗与Notch2增加的表达或活性相关的疾病的药物的应用。
26.权利要求1-18中任一项的抗体用于制备治疗B-细胞恶性肿瘤的药物的应用。
27.权利要求1-18中任一项的抗体用于制备治疗黑素瘤的药物的应用。
28.权利要求1-18中任一项的抗体，其用作药物。
29.权利要求1-18中任一项的抗体，其用于治疗与Notch2增加的表达或活性相关的疾病。
30.权利要求1-18中任一项的抗体，其用于治疗B细胞恶性肿瘤。
31.权利要求1-18中任一项的抗体，其用于治疗黑素瘤。
全文摘要
本发明提供抗-Notch抗体，并且具体地，结合Notch2NRR的抗体，以及使用所述抗体的方法。
文档编号C07K16/28GK102170909SQ200980139202
公开日2011年8月31日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年10月1日
发明者克里斯蒂安·W·西贝尔, 吴岩 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司