具有细胞穿透性、序列特异性和核酸水解性的抗体、其制备方法及包含所述抗体的药物组合物的制作方法

专利名称：具有细胞穿透性、序列特异性和核酸水解性的抗体、其制备方法及包含所述抗体的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有细胞穿透能力和碱基序列特异性的核酸水解性抗体，其作为克服传统SiRNA技术存在问题的新一代基因沉默技术。更特别的是，本发明涉及一种核酸水解性抗体，其通过改变无底物特异性的具有细胞穿透性、核酸水解性抗体的特定位点制备，而不改变抗体的核酸水解能力并赋予其序列特异性，当其自身渗透到细胞内或在细胞内异位表达时，其与单链或双链目标核酸特异性结合并水解核酸，从而使目标基因的表达下降。本发明同样涉及一种该抗体的制备方法及包含该抗体的药物组合物。
背景技术：
在分子生物学的中心法则中，主要有三类生物聚合物起重要作用DNA、RNA和蛋白质。需要某些蛋白质和核糖体的帮助才能将DNA转录为RNA。这些蛋白质在特异位点与DNA结合以开始转录。转录得到的RNA在核糖体内翻译成蛋白质。检查蛋白质产物具有哪些功能的典型方法包括从生物系统中去除该蛋白质。生物体具有和不具有目标蛋白质所表现的不同解释了该蛋白质在生物系统中起的作用。然而，很难控制目标蛋白质在生物体内随意地表达水平。最近，已经建立了各种能够特异性识别并水解目标RNA (包括 mRNA)特定区域的控制蛋白质表达的以核酸为基础的方法，其包括反义寡聚核苷酸、RNA干扰(RNAi)、核酶、DNA 酶等(Scherer 等，NatureBiotechnology, 21:1457-1465，2003 ； Tafech 等，Current Medical Chemistry, 13:863-881，2006)。尤其是，发现于 1998年的 RNA干扰，现在随时可获得，且与现有技术相比更容易实现RNA敲除(Fire A等，Nature， 391:806-811, 1998 ;Scherer 等，Nature Biotechnology, 21:1457-1465，2003)。所谓的siRNA(小分子干扰RNA)，21-23碱基长度的双链(ds)RNA，是RNA干扰的核心。这些有特定序列的小分子RNA，不管其产生于内部还是来自于外部转移，能结合并水解特异性mRNA 以下调目标蛋白质在细胞内的表达(称为基因敲除)。虽然其原理的建立还不到10年，但 siRNA技术是目前在降低植物/动物细胞中蛋白质表达水平方面应用最广泛的。然而，RNA 干扰的实际应用存在几个问题。一个典型的例子是脱靶效应，在当即使21碱基长度的RNA， 不能与目标配对时发生。此外，如果siRNA与目标只有1或2个碱基对不同时，则siRNA诱导的基因敲除显著降低或不引起干扰。此外，RNA干扰可能在一靶基因的特定区域有效运作，但在多数例子中在其他区域不工作。此外，包括不需要的免疫反应，不恰当的细胞运送， 核酸酶敏感性等作为siRNAs实际应用中的抑制因子(Scherer LJ等，Nat Biotechnol, 21:1457-1465，2003 ;Tafech A 等，CurrMedChem, 13:863-881，2006)。1957年首次发现于系统性红斑狼疮(SLE)病人的血清中有核酸(DNA/RNA)结合抗体，其是一种自身抗体，在自身免疫性疾病的患者或小鼠中被检测到(Robbins W等， Proc. Soc. Exp. Biol. Med.，96(3) 575-9，1957)。许多抗核酸自身抗体实际上发现于系统性红斑狼疮或多发性硬化症患者中。通常，它们与缺乏序列特异性的核酸结合(Jang YJ 等·，Cell. Mol. Life Sci. , 60 (2) 309-20，2003 ；Marion TN 等，Methods 11:3-11，1997)。据报道，SLE患者和SLE小鼠模型的血清具有高浓度的抗核酸抗体，并且主要在自身免疫性疾病的患者中进行自身抗体的研究(Dubrivskaya V等，Biochemistry (Mosc)，68(10) 1081-8，2003)。在1992年，首次发现了一种能够水解核酸的核酸结合抗体(Shuster A等， Science, 256 (5057) 665-7，1992)。从那时起，生物化学研究集中于此(Nevinsky G等， J. Immunol. Methods, 269 (1-2) 235-49，2002)。因此，核酸水解抗体的研究在生物化学方面处于领先，但是却仍然处于抗体工程方面的初级阶段，如在各种应用中抗体稳定性、 亲和力和特异性仍需改善(Cerutti M 等，J. Biol. Chem. , 276(16) 12769-73，2001 ； Kim YR 等，J. Biol. Chem. , 281 (22) 15287-95，2006)。多份报告中公开了抗体与核酸的结合及非抗体蛋白与核酸的结合。首先，锌指结构，非抗体蛋白，是自然发生的DNA结合基序的代表，如亮氨酸拉链和螺旋_转角-螺旋(Jamieson A 等，Nat. Rev. Drug Discov. , 2(5) 361-8, 2003)。锌指结构，由大约 20-30个氨基酸残基组成的小蛋白结构域，使锌离子(Zn2+)与4个不同方向的2个半胱氨酸和2个组氨酸残基的常见组合物配位结合。作为DNA实际结合的原因，锌指结构的α-螺旋与DNA的大沟结合且与3个碱基相互作用。DNA三级结构的不同取决于锌指结构的氨基酸序列。因此，当α-螺旋改变但不发生构象变化时，锌指结构可识别不同于之前的新碱基序列。自1999年，成功改变了 16 GNN三级结构的特定指结构(Segal D等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (6) 2758-63，1999)，开展了广泛研究以建立改变底物特异性的方法 (Caroll D等，Nat. Protoc. 1 (3) 1329-41，2006)。因为，它们只有结合核酸的能力，然而，改性后的锌指结构还需要用于与核酸水解酶结合的其他改变(Mani M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun·，334(4)1191-7，2005)。第二种方法是一种经验方法，其充分利用人乳头状瘤病毒(HPV) E2蛋白(E2C)的 DNA 结合域与靴 DNA 结合(M. Laura 等，J. Bio. Chem. , 276(16) 12769-73，2001)。 将DNA-E2C复合物注入小鼠，通过体细胞高频突变产生抗DNA抗体。在这方面，小鼠将DNA 识别为抗原。为此，首先，DNA-蛋白(E2C)复合物通过内部腹腔注射进入小鼠以引起免疫反应。当DNA-E2C复合物在一定时间内被重复注射以增强免疫应答时，通过体细胞高频突变产生了注入的DNA-E2C复合物DNA的特异性抗体。扩增后，从小鼠中分离所产生的抗体。 从这些能够与DNA特异性结合的分离物中，通过使其与目的DNA作用选择对DNA亲和性最高的抗体。—个合理设计提供了描述抗体与核酸结合的第三种方法。在这种方法中，使用人类Y-B-晶状体的折叠，通过根据结构和序列分析选择的溶剂暴露氨基酸残基的不规则分布，产生一通用的结合位点(Hilmar Ε.等，J. Mol. Biol. , 372:172-85，2007)。 作为一般规则，抗体被结构性地分为阅读框和灵活的、序列可变的CDRs (互补性决定区)。 CDRs的灵活性允许抗体与抗原形成诱导契合。高特异性和亲和性的另一个机理是——锁钥模 型。在这方面，因为蛋白质已经形成一互补结构以维持与底物的高亲和性，所以其能维持重要的抗体稳定性并在结合时构象不发生改变，因此能与底物更紧密地结合(Jackson R. 等，Protein Sci.，8:603-13，1999)。因此，蛋白质工程和文库筛选的近期研究趋势从互补性决定区转移到阅读框。 实际上，首先，采用合理设计将功能性锌结合位点引入到哺乳动物血清视黄醇结合蛋白3-筒(3^^1~仪1)的表面(] 111161·!!·等，Biochemistry, 33: 14126-35，1994)。其次， 源自里氏木霉CBH (纤维二糖水解酶)Cel7A的纤维素结合域的β -折叠通过突变被赋予结合活性(Lehtio J.等，Proteins: Struct. Funct. Genet. , 41:316—22，2000)。另一项研究是关于一由两个反向平行的α-螺旋和一个β-转角组成的锚蛋白重复蛋白(Binz H.等，J. Mol. Biol., 332:489-503，2003)。已知通过靶向特定基因以降低mRNA水平，从而下调编码的蛋白质表达的基因沉默是基因功能分析的极为重要工具和包括癌症和病毒感染的人类疾病的有力的治疗策略。传统的基因沉默技术通常是基于核酸与单链核酸互补以抑制mRNA的翻译的能力 (Scherer LJ 等，Nat Biotechnol, 21:1457-65，2003 ；Tafech A 等，Cur r Med Chem, 13:863-81，2006)。其中包括代表性的siRNA(小分子干扰RNA)。然而，siRNA具有缺少细胞穿透性的缺点，由于RNA酶的敏感性造成的低稳定性，可能产生脱靶，导致免疫原性。如上所述，传统的基因沉默技术如应用SiRNA能引起特定基因在表达水平的下降，但是需要能够水解核酸的其它的改性，以这种方式，其与核酸酶水解酶共轭。目前销售的药物和当前研究下的药物开发是以小分子，蛋白质和单克隆抗体为基础的。大多数被设计为能与可被控制活性而引起药效的蛋白质结合。尤其是，几乎所有的单克隆抗体和蛋白都靶向膜蛋白或胞外蛋白。尽管许多不同的基因与多种疾病相关，但迄今为止药物开发一直关注于靶向蛋白，产生数量非常有限的药物。如果开发的药物可在RNA 或DNA水平控制疾病，而不是蛋白质水平，其能够靶向胞内RNA或DNA，可覆盖更广泛的疾病。此外，能够渗透进入细胞并识别特定碱基序列的核酸酶水解抗体极有可能发展为下一代基因沉默和抗病毒因子。因此，需要无外部蛋白运输系统时自身能够渗透进入细胞的抗体，且能与特定序列的单链/双链靶核酸特异性结合并使其水解。发明内容技术问题
本发明进行了关于基因沉默的密集和深入的研究，以克服现有技术所遇到的问题为目标，结果发现了一种无底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体可通过改变特异位点而被赋予单链或双链目标的特异性且不改变其核酸水解性，当改性的抗体自身渗透进入细胞或在细胞内表达时，可与单链或双链核酸目标特异性结合并使其水解，因此使特定基因的表达下调。解决方案
因此，本发明的一个目的在于提供一种能够渗透进入细胞，与特定碱基序列的单链或双链核酸靶标特异性结合并使其水解的核酸水解性抗体。本发明的另一个目的在于提供一制备该核酸水解性抗体的方法。本发明的再一个目的在于提供一包括该核酸水解性抗体的药物组合物。


图1示意地示出了根据本发明的核酸水解性抗体(A)和特定碱基序列的单链或双链目标核酸的水解(B)。图2是一过程示意图，其中，具有本发明序列特异性的核酸水解性抗体通过细胞渗透移位进入细胞质或通过转染细胞质内表达后，特异性识别并水解由外源物质(例如，病毒)携带的外源性靶基因或内源性靶mRNA，从而抑制病毒增殖或蛋白表达图3示出了 3D8 VL的三级结构(A)及(3-(4广45位残基)，(’-(50 54位残基)和 f-β-链(9(Γ94位残基)的氨基酸序列和碱基序列，其构成野生型3D8 VL的推定的DNA/ RNA识别位点和用于突变的NNB密码子(B)。图4示出了基于3D8 VL 4Μ模板的核酸水解性抗体文库的构建㈧，通过电穿孔与酵母显示载体(pCTCON)共转化后该文库在酵母细胞表面的表达(B)，以及该文库表达水平的流式细胞仪分析(C)。图5示出了分离优先与来自酵母表面3D8 VL文库的两个单链DNA目标底物G18 (A) 和Herf18 (B)结合的3D8 VL变体的代表性筛选程序。图6示出了 3D8 VL野生型和通过18个碱基的目的单链DNA，G18 (4MG1-4MG6)禾口 Her218 (4MH1-4MH5)选择的3D8 VL 4M变体的氨基酸序列比对，重点在于c_ (4广45位残基)，C’ - (50 54位残基)和f-β -链(90 94位残基)的15个随机位置。图7示出了纯化的11个变体的SDS-PAGE分析数据(A)，及代表性变体(4MG3、 4MG5、4MH2)与3D8 VL野生型和4M相比的体积排阻HPLC (B)和远紫外⑶(圆形二色性) 光谱(C)。图8示出了用于分析11个变体的DNA水解活性(A)和4MG3、4MG5和4MH2的RNA 水解活性(B)的琼脂糖凝胶电泳结果。图9 示出了作为 16nM 2μ M FRET 底物(A18, T18，C18，(G4T)3G3、Her218、N18)的浓度函数的3D8 VL野生型和3D8 VL 4M及其变体(4MG3、4MG5、4MH2)的酶动力学绘制图。图10示出了用于细胞内表达3D8 VL野生型和其变体(4MG3、4MG5)的质粒示意图，(A, pcDNA3. 1)，GFP (B, pEGFP-Nl)，GFP (C，G18 在 pG18_EGFP 中位于 EGFP 的 N-末端上游)，和EGFP (D，Her218在pHer218_EGFP中位于EGFP的N-末端上游)。图11示出了选定的3D8 VL变体的靶标基因沉默活性，其在HeLa细胞中与携带 EGFP的靶序列异位共表达。HeLa细胞是未转染的或由编码质粒的EGFP(完整EGFP，G18-EGFP 或Herf18-EGFP )单独转染或与编码3D8 VLs(野生型，G18-选择性4MG3和4MG5，及Her218-选择性4MH2)的质粒一起转染，如上所述，然后通过流式细胞仪(A)，共聚焦荧光显微镜(B)， 免疫印迹(C，D)和RT-PCR (E，F)监测EGFP表达。图12示出了 Her2基因表达上的Her218碱基序列特异性，核酸水解性4MH2在HeLa 细胞中的效果，其通过RT-PCR (A)进行mRNA水平分析，并通过免疫印迹(B)进行蛋白质表达水平分析。图13示出了说明3D8 VL变体渗透进入活细胞并主要定位于细胞质中的数据。(A) 野生型3D8 ￥1^和其变体(41^3、41^5、41^2)细胞内化进入人宫颈癌细胞(HeLa细胞)和人乳腺癌细胞(SK-BR3)的流式细胞仪数据。化)彻1^细胞中308 VLs内化和亚细胞定位的共聚焦荧光显微镜。(C)分析可溶肝素或对野生型3D8 VL和其变体(4MG3、4MG5、4MH2)的细胞摄取特异性内吞作用抑制剂的预处理效果的流式细胞仪数据。图14示出了细胞穿透性3D8 VL变体在HeLa细胞中表达外源靶标基因中的靶标基因沉默活性。HeLa细胞是未转染的或由编码EGFP或G18-EGFP的质粒转染的，为未处理的或由野生型3D8 VL及G18-选择性4MG3和4MG5处理的，且通过流式细胞仪(A)，RT-PCR(B)和免疫印迹(C)分析。Her2-阴性HeLa细胞是未转染的或由编码全长Her2基因的质粒转染，为未处理的或由3D8 VL野生型及Her218-选择性4MG2处理的。Her2表达通过RT-PCR (D)和免疫印迹(E)分析。图15示出了通过MTT法(A)和流式细胞仪(B)分析用Her218特异性4MH2变体处理的Her2-过表达人类乳腺癌细胞(SK-BR-3，MDA-MB-231)或Her2-阴性人类宫颈癌细胞 (HeLa细胞)的存活率。图16示出了细胞穿透性Her218_选择性4MH2敲除Her2_过表达SK-BR-3细胞中的内源性Her2表达。Her2表达通过流式细胞仪在细胞表面监测(A)，通过RT-PCR在mRNA 水平监测(B)，并通过免疫印迹在蛋白质水平监测(C)。实施本发明的最佳模式
根据其中一个方面，本发明涉及一种核酸水解性抗体，其具有细 胞穿透性，且能特异性结合并水解特定碱基序列的单链或双链的靶核酸。根据其中另一个方面，本发明涉及一种制备细胞穿透性、序列特异性和核酸水解性抗体的方法，其包括
1)构建缺失底物特异性的细胞穿透性核酸水解性抗体模板的基因文库；
2)通过表面显示载体在细胞表面表达步骤1)构建的基因文库，以产生蛋白质文库；且
3)从步骤2)表达的蛋白质文库选择能与特定碱基序列的核酸目标特异性结合的变体。根据其中另一个方面，本发明涉及一包括核酸水解性抗体的药物组合物。以下，将对本发明进行详细叙述。通过改变具有细胞穿透性但无底物特异性的核酸水解性抗体的特定区域作为抗体工程构建的结果，根据本发明的核酸水解性抗体被进一步赋予序列特异性。当其渗透进入细胞质或在胞内表达时，本发明的核酸水解性抗体能够特异性结合并水解特定碱基序列的单链或双链核酸目标以使特定基因的表达下调。本发明设计的核酸水解性抗体具有SEQ ID NOS 14 24的氨基酸序列，优选为SEQ ID N0S:16、18和21。本发明核酸水解性抗体的碱基序列代表为SEQ ID N0S:25 35，优选为 SEQ ID NOS :27、29 和 32。本发明的核酸水解性抗体可以是全部片段或是一个功能性片段。整个抗体可是一个单体或两个或多个完整抗体相互结合成的多聚体，且包括整个IgG。本文中使用的关于抗体的术语“功能片段”意指具有重链可变区域和轻链可变区域的抗体片段，抗体片段可如整个抗体一样，识别大致相同的抗原表位。抗体功能片段的例子包括重链可变区域的单结构域、轻链可变区域的单结构域、单链可变片段(scFv)、(ScFv)2, Fab、Fab'、F(ab’)2、双链抗体和二硫键稳定可变片段(dsFv)，但不局限于此，优选为轻链可变区域的单链区域。参照图1，本发明的核酸水解性抗体示意图说明其样式(A)及特定碱基序列的单链或双链靶标核酸的水解(B)。参照图2，显示了一过程示意图，其中，具有本发明序列特异性的核酸水解性抗体通过细胞渗透移位进入细胞质或通过转染细胞质内表达后，可特异性识别并水解由外源物质(例如，病毒)携带的外源靶基因或内源性靶mRNA，从而抑制病毒增殖或蛋白表达。接下来，转向制备本发明的核酸水解性抗体的方法，如下以循序渐进的方式对其进行描述。
步骤1)是使用缺乏序列特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体作为模板合成一基因文库。因为该抗体能渗透进入细胞并水解核酸，但缺乏序列特异性，优选为3D8 VL 4M或其变体。3D8 VL的结构分析允许由c-，c’-和f-β-链组成的推定的核酸结合位点。这个推定的结合位点由简并NNB密码子(N=A/T/C/G，B=C/G/T)随机组合，在酵母细胞表面构建所有残基的突变库。步骤2)是在细胞表面构建文库。扩增的3D8 VL基因通过电穿孔与显示载体共转化以在酵母细胞表面构建3D8 VL文库。本发明中使用的显示载体的例子包括噬菌体显示载体、细菌显示载体、核糖体显示载体、RNA显示载体和酵母细胞显示载体，但不局限于此。 在本发明中，用酵母显示载体构建文库。文库可在酵母细胞表面很好地表达。 在步骤3)中，3D8 VL 4M抗体文库被靶标核酸序列筛选以选择可特异性结合的3D8 VL变体。在这方面，用5’-生物素化的靶标核酸分析抗体的特异亲和性。靶标核酸可是内源性或外源性的。优选地，内源性核酸可为编码在癌细胞中过度特定反应的蛋白质。优选的外源性核酸为病毒基因组核酸或编码病毒蛋白的核酸。更详细地，抗体库由5’-生物素化的靶标DNA (G18，，Herf18)筛选，在此期间通过磁性细胞分选和流式细胞仪分析其相比较于非靶标核酸与各自靶标(G18,，Herf18)的亲和力。在分析的基础上，选择与靶标(G18,， Her218)特异性强的变体。结果，六个变体，4MG1、4MG2、4MG3、4MG4、4MG5和4MG6被选择用于单链0嫩靶标(618)，然而据观察，5个变体，41^1、41^2、41^3、41^4和4MH5与单链DNA靶标 (Herf18)有较强亲和力。总共这11个变体分别具有SEQ ID NOS :14 24的氨基酸序列，优选为SEQ ID NOS 16 (4MG3)，18 (4MG5)和21 (4MH2)。相应地，11个变体的碱基序列分别代表为 SEQ ID N0S:25 35。因此，优选为 SEQ ID NOS 27 (4MG3), 29 (4MG5)禾口 32 (4MH2)。选择的变体被纯化，纯度大于90%，以具有二级结构的可溶解的单体存在。而且，相比较于非靶标，3D8 VL变体对于各自的靶标底物显现出10-100倍大的KD，4MH2对于Her218及4MG3 和4MG5对于G18，因为对于靶标底物其亲和力大幅增加，但对于非靶标其保持不变。此外， 与3D8 VL野生型和3D8 VL 4M相比，变异的抗体表现为底物降解率具有更高的Vmax值，更快的识别、特异性结合并水解靶标核酸序列。因此，根据本发明的变体可适应于具有序列特异性并保留了水解DNA和RNA的能力。无G18或Herf18靶标序列的EGFP (增强型绿色荧光蛋白)的表达水平既不受本发明变体的影响，也不受3D8 VL野生型的影响。同时，细胞与携带本发明3D8 VL变体的载体和携带N-末端有G18或Herf18靶标序列的载体一起共转染比与3D8 VL野生型共转染表达的EGFP信号低得多。强烈建议在细胞内表达的变体水解携带靶标序列的mRNA，如G18-EGFP mRNA和Her218-EGFP mRNA，从而降低GFP的表达水平。当在胞内表达时，突变为可识别靶标碱基序列的核酸水解性抗体能水解包含靶标碱基序列的mRNA，从而下调由mRNA编码的蛋白质的表达。本发明的变体已被证明当其在胞内移位表达时，具有序列特异性和核酸水解活性。此外，本发明的变体被发现可渗透进入人类宫颈癌细胞(HeLa)和人类乳腺癌细胞(SK-BR3)，某种程度类上似于3D8 VL野生型。变体内化进入细胞继续行进到氯丙嗪预处理细胞抑制网格蛋白依赖型内吞作用和细胞松弛素D预处理细胞抑制大胞饮作用 (macropinocytosis)相似的程度。相反地，变体的细胞穿透能力因为带正电荷的变体和带负电荷的细胞表面蛋白多糖(硫酸乙酰肝素)的电相互作用的干扰在具有肝素预处理的细胞上显著降低，或因为抑制小窝/脂筏内吞作用在甲基-β-环糊精(MiiCD)预处理的细胞上显著降低，证明变体是通过小窝/脂筏内吞途径进入细胞，并与细胞表面丰富的蛋白多糖发生电相互作用。此外，根据本发明的变体显示了对于人类乳腺癌细胞(SK-BR3，MDA_MB_231)或人类宫颈癌细胞(HeLa)的低细胞毒性。尤其是，Her2_过表达SK-BR-3 或MDA-MB-231细胞的存活率由于带有Her2序列特异性的核酸水解性4MH2的强细胞毒性而显著降低。该结果归因于4MH2下调Her2表达，与以前的认为随着Her2表达的下降Her2_过表达细胞存活率降低的报告相一致。此时，观察到细胞死亡显示出凋亡模式(阳性膜联蛋白V)。如上所述，根据本发明的核酸水解性抗体通过改变无底物特异性的细胞穿透性、 核酸水解性抗体的特定位点制备，赋予其序列特异性且不改变其核酸水解能力。当该设计的核酸水解性抗体自身渗透进入细胞或在胞内表达时，其与单链或双链核酸靶标特异性结合并将其水解，从而下调特定基因的表达。因此，根据本发明的核酸水解性抗体可是如 siRNA传统基因沉默技术的另一选择或替代技术。尤其是，本发明的核酸水解性抗体能下调靶标蛋白的表达或通过特异性结合并水解RNA或DNA下调靶标基因组在RNA或DNA水平的增殖，但不在蛋白质水平上，所以可用于癌症或病毒疾病的治疗。因此，本发明的核酸水解性抗体可开发为新的带有进入市场预期的抗癌药物或抗病毒药物。根据其另一方面，本发明涉及一药物组合物，其包括单独的作为一种活性成分的本发明核酸水解性抗体或包括该抗体与至少一种传统抗癌或抗病毒成分的组合。用于实际给药中，除了活性成分之外，该药物组合为可能包括至少一种药物学上可接受的赋形剂。药物学上可接受的赋形剂的例子包括生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等。可选地，其他典型的添加剂，如抗氧化剂、 缓冲剂、抑菌剂等可加入本发明的药物组合物。可使用稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑油将该组合物配制成如水溶液、悬浮液、乳化液等注射液、丸剂、胶囊、颗粒或片齐U。此外，该组合物可根据本领域已知的方法或雷明顿药物科学(最新的)(Mack出版公司， Easton PA)上公开的方法配制成合适的剂型。本发明的组合物可为口服地或非口服地(静脉、皮下、内腹部或局部)给药。其剂量根据病人的体重、年龄、性别、健康状况和饮食，给药时间，给药途径，排泄率，疾病严重程度等变化。核酸水解性抗体的日给药量约为0.0广10mg/kg，优选为日剂量为广5mg/kg，一天一次或多次给药。为了抑制致病蛋白的表达或病毒基因的增殖，本发明的组合物可单独使用或与手术、荷尔蒙治疗、化学治疗或生物反应调节剂相结合。
具体实施例方式将通过以下用于说明的实施例对本发明进行更好的理解，但其并不旨在限制本发明。实施例1 3D8 VL 4M抗体的设计
1. 3D8 VL 4M抗体在酵母细胞表面的表达
将3D8 VL抗体设计为序列特异性，核酸水解性抗体的第一步是在酵母细胞表面显示该抗体。该抗体为3D8 VL 4M，其与野生型(WT)相比，具有更好的DNA/RNA水解活性。3D8VL 4M具有4个突变体一Q52R、Y55H、W56R和H100A。为了能够在酵母细胞表面表达3D8 VL 4M抗体，将3D8 VL 4M基因从大肠杆菌表达载体pET23M 3D8 VL 4M亚克隆进入酵母细胞表面显示载体PCTC0N。为了扩增3D8 VL4M基因，设计了具有Nhel/BamHI识别位点的引物对。通过碱基测序分析确定PCTCON中的3D8 VL 4M基因的准确插入，接着将重组载体转化到酿酒酵母EBY100。转化的菌落在选择性SD-CAA培养基(20g/L葡萄糖，6. 7g/L无氨基酸的酵母氮基，5. 4g/L Na2HPO4,8. 6g/L NaH2PO4 -H2O, 5g/L酪蛋氨基酸)中在30°C下振荡培养 20小时。通过在选择性SG-CAA培养基(20g/L葡萄糖，6. 7g/L无氨基酸的酵母氮基，5. 4g/ L Na2HPO4,8. 6g/L NaH2PO4 · H2O, 5g/L酪蛋氨基酸)中30°C下振荡培养20小时完成蛋白质的表达。使用FACS测定目标蛋白质的细胞表面表达。通过检测C端myc标签能够识别酵母细胞表面的3D8 VL 4M表达。使用抗-myc9E10抗体(Sigma，USA)作为初级抗体和FITC 标记的羊抗鼠IgG (Sigma, USA)作为第二抗体对该表达进行定性和定量分析，该第二抗体用于识别初级抗体的恒定区。为了确定细胞表面表达和3D8 VL文库的目标底物结合水平， 大约有2xl06酵母细胞用生物素标记的核酸在50 μ LTris缓冲液(25mM Tris, 137mM NaCl, 2. 7mM KCl，0. 1% BSA)被处理，然后用抗myc抗体处理，并用Tris缓冲液洗涤，用FITC标记的羊抗鼠IgG标记。在BD FACS Calibur (Becton Dickinson, USA)上进行定量分析，其示出了在酵母细胞表面有高表达水平的3D8 VL 4M。模式序列的选择
选择一模式序列用于将3D8 VL 4M抗体修饰进入一有序列特异性的变体中。在1中使用的生物素化核酸用作模式序列。相应的序列为人类表皮生长因子_2 (Her2/ErbB2)，其已知在乳腺癌细胞中过表达并且因此与癌细胞的生长和转移有关。在整个Her2序列中，只有18个残基，对应的位置为2391-2408，确定为5’-AAT TCC AGT GGC CAT CAA-3’，这些被用于抗体工程，并且被称为Her218。另一个模式序列，称为G18，确定为5’-GGG GGG GGG GGG GGG GGG-3’，其也被用于模式目标底物中。3D8 VL野生型和3D8 VL 4M的氨基酸序列分别为SEQ ID NOS :1和2。它们各自相应的碱基序列分别用SEQ ID NOS 3和4表示。实施例2: 3D8 VL 4M抗体文库的构建
观察到3D8 VL 4M在酵母细胞表面高水平表达之后，构建3D8 VL 4M文库。为了产生能够特异性的结合并水解特定碱基序列的变体，文库基于3D8 VL 4M的模板进行构建。首先，分析3D8 VL的结构以确定由c-，c’-和f-β-链构成的推定的核酸结合位点。设计其可以随机地在c_(4广45位残基)，c’_ (50 54位残基)和f-β-链(90 94位残基)用简并 NNB密码子(N=A/T/C/G，B=C/G/T)靶定突变体残基以在酵母细胞表面产生文库。因为3D8 VL并不是所有的残基都突变，使用4M作为模板和突变引物(其某些残基突变)进行重叠PCR 构建酵母表面显示的基因文库。用于文库构建的引物(明、21 、31 、4 、51 、6 、710的碱基序列分别为SEQ ID NOS :5 11。在NNB密码子中，N代表等摩尔的A、T、C和G (各25%)的核酸混合物，B代表等摩尔C、G和T的核酸混合物(各33%)。NNB密码子是所有20种具有2. 1% 比率终止密码子的氨基酸密码子的组合。扩增的文库与酵母表面显示载体一起通过同源重组转化到酵母细胞中。为此，使用电穿孔技术将扩增的基因组文库(10 yg/mL)和酵母表面显示载体(pCTCON，Colby等， Methods enzymol, 388:248-258) (1 μ g/mL)引入酵母细胞中以在酵母细胞表面显示文库(Lee HW 等，Biochem Biophys Res Communj 343:896-903，2006 ；Kim YS 等，Proteins: structure, function, and bioinformatics，62:1026-1035，2006)。文库基因以总量 300 μ g制备，同时使用载体的量为30 μ g。通过在选择性琼脂平板上将连续稀释转化的细胞倒平板，测定的3D8 VL 4M文库大小约为2X108。使用FACS定量分析文库的表达。因为任何在构建中发生的问题都不允许文库基因的正常表达。FACS分析同样也可以用于检测是否正确构建文库。图3示出了 3D8 VL (A)的三级结构和氨基酸序列以及c_ (4广45位残基)，C’ -(50 54位残基)和f-β-链(90 94位残基)的碱基序列，其构成了 3D8 VL野生型的推定的DNA/RNA识别位点和用于突变体⑶的NNB密码子。参照图4，以下的示意图示出了 3D8 VL 4M (A)的模板上核酸水解性抗体的文 库构建，在通过电穿孔(B)将酵母显示载体共转移和用FACS (分析文库的表达水平(C)之后进行酵母细胞表面的文库表达。在构建体文库中的突变体频率如下表1所示 [表1]
权利要求
1.一种核酸水解性抗体，其能够渗透进入细胞并特异性结合特定碱基序列的单链或双链核酸靶标，且水解该靶标核酸。
2.根据权利要求1所述的核酸水解性抗体，其中靶标为G18或Her218。
3.根据权利要求2所述的核酸水解性抗体，其中G18具有SEQID N0:12的碱基序列。
4.根据权利要求2所述的核酸水解性抗体，其中Herf18具有SEQID NO 13的碱基序列。
5.根据权利要求1所述的核酸水解性抗体，其中抗体具有从包括SEQID NOS 14 24 氨基酸序列的组中选择的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸水解性抗体，其中抗体具有从包括SEQID N0S:25 35碱基序列的组中选择的碱基序列。
7.根据权利要求1所述的核酸水解性抗体，其中抗体选自下组中的一个完整的IgG、 重链可变区域的单结构域、轻链可变区域的单结构域、单链可变片段(scFv)、(ScFV)2、Fab、 Fab，、F(ab，)2、双链抗体和dsFv及其组合。
8.一制备权利要求1中所述核酸水解性抗体的方法，包括1)构建一没有底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体的模板的基因文库；2)通过使用表面显示载体在细胞表面表达步骤1)中构建的基因文库以生成蛋白质文库；3)从步骤2)中表达的蛋白质文库中选择能特异性结合特定碱基序列的核酸靶标的变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中没有底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体是从包括一完整的IgG，重链可变区域的单结构域，轻链可变区域的单结构域，单链可变片段(scFv)，(scFv) 2，Fab, Fab'，F (ab，)2，双链抗体和dsFv及其组合的组中选择的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中没有底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体是3D8 VL 4M或其变体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中3D8VL 4M是以这样的方式突变的，包括θα 广 45 位残基 )， c’- (50 54位残基)和f-β-链(90 94位残基)的3D8 VL的DNA/RNA 结合位点用NNB密码子(N=A/T/C/G，B=C/G/T)随机组合。
12.根据权利要求8所述的方法，其中步骤2)中的表面显示载体是从包括噬菌体显示载体、细菌显示载体、核糖体显示载体、RNA显示载体和酵母细胞显示载体及其组合的组中选择的。
13.据权利要求8所述的方法，其中步骤3)中的核酸靶标是内源性核酸或外源性核酸。
14..据权利要求13所述的方法，其中内源性核酸是编码在癌细胞中特异性过表达的蛋白质的核酸。
15.据权利要求13所述的方法，其中外源性核酸是病毒基因组核酸或编码病毒蛋白的核酸。
16.一种预防或治疗癌症的组合物，其包括权利要求1中所述的核酸水解性抗体作为活性成分。
17.一种预防或治疗病毒增殖的组合物，其包括权利要求1中所述的核酸水解性抗体作为活性成分。
全文摘要
公开了一具有细胞穿透性，碱基序列特异性和核酸水解性的抗体、其制备方法及包含所述抗体的药物组合物。所述抗体可通过改变无底物特异性的细胞穿透性，核酸水解性抗体的特定位点制备，不改变抗体的核酸水解能力并赋予其序列特异性。当该抗体自身渗透到细胞内或在细胞内异位表达时，其与单链或双链目标核酸特异性结合并水解核酸，因此下调了目标基因的表达。
文档编号C07K16/28GK102209726SQ200980144976
公开日2011年10月5日 申请日期2009年11月11日 优先权日2008年11月11日
发明者权明姬, 李又览, 金容星 申请人:亚州大学校产学协力团