专利名称：多肽、抗体可变结构域和拮抗剂的制作方法
多肽、抗体可变结构域和拮抗齐IJ本发明涉及免疫球蛋白单个可变结构域(dAbs)，例如蛋白酶抗性的dAbs，并且还涉及用于眼递送的包括此种dAbs的制剂和组合物，及其治疗眼疾病和状况的用途。
背景技术：
治疗眼疾病和状况的困难是治疗试剂递送至眼的无效率。当药物递送至眼时，它经非常快速地从眼组织中清除。另外，当治疗剂局部递送至眼时，问题是它们可能不到达眼的后段(视网膜、玻璃体和脉络膜)。因此，许多后段眼状况已通过静脉内施用药物或通过玻璃体内施用进行治疗。这些疾病中的许多，例如AMD、青光眼、糖尿病性视网膜病，不能得到最佳治疗。因此，需要提供进一步试剂，其可以适合于眼递送并且可以治疗或预防眼疾病和状况。多肽和肽已成为用于作为医学、治疗和诊断试剂使用的越来越重要的试剂。然而， 在特定体内环境例如眼和特定生理学状态例如癌症和炎症状态中，组织、器官或动物中存在的蛋白酶的量可以增加。蛋白酶中的这种增加可以导致内源蛋白质以及进行施用以治疗疾病的治疗用肽、多肽和蛋白质的加速降解和灭活。因此，具有用于体内使用(例如，用于治疗、诊断或预防疾病)的潜力的一些试剂仅具有有限功效，这是因为它们由蛋白酶快速降解且灭活。蛋白酶抗性多肽提供了几个优点。例如，蛋白酶抗性多肽在体内保持活性长于蛋白酶敏感性试剂，并且因此保留功能足以产生生物学作用的时间段。VEGF是由于其初级转录物的可变剪接以几种可变形式存在的分泌的、肝素结合、 同二聚糖蛋白(Leung等人，1989，Science 246:1306)。VEGF也称为血管通透因子(VPF)， 这是由于其诱导血管渗漏一一在炎症中重要的过程的能力。在眼中，已知VEGF和VEGF受体刺激脉络膜和视网膜血管的血管发生且调节此种血管的血管通透性。这两个特征促成视网膜损害和随之发生的视敏度退化，这起因于许多视网膜炎症状况、血管病变和黄斑病。调节VEGF活性或VEGF受体活性的尝试先前已显示有效管理动物模型和人疾病中的血管通透性(Gragoudas等人，2004 :N. Engl. J. Med 351 2805)
用目前可用的治疗剂靶向VEGF并非在所有患者中都是有效的。因此，需要改良的试剂用于治疗由VEGF介导的病理学状况，例如血管增殖性疾病(例如年龄相关性黄斑变性 (AMD))。TNF-α (肿瘤坏死因子-α )是促炎细胞因子，其已牵涉于许多眼炎症状况例如葡萄膜炎和AMD，和其中存在炎症组分的视网膜血管病变的生成。与年龄相关性黄斑疾病相关的脉络膜新生血管损伤的生成已证实具有相关的炎症组分。这种相关炎症组分的有效管理已证实直接影响脉络膜新血管生成损害和血管通透性的发展，这两者可以影响人疾病。人 AMD患者中的近期证据已暗示抗TNFa治疗剂的使用可以影响患者中的疾病，所述患者对抗 VEGF 治疗无反应(Theodossiadis 等人，2009 :Am. J. Ophthalmol. 147:825-830)。白细胞介素1 (IL-I)是免疫应答的重要介质，其对几种类型的细胞具有生物学作用。白细胞介素1与2种受体结合一一白细胞介素1受体1型(IL-1R1，⑶121a，p80)(其在结合IL-I后将信号转导到细胞内)，和白细胞介素1受体2型(IL-1R1，CDwl21b)(其在结合IL-I后不转导信号且充当IL-I的内源调节剂)。调节IL-I与IL-IRl的相互作用的另一种内源蛋白质是白细胞介素1受体拮抗剂(IL-lra)。IL-Ira结合IL-1R1，但不激活 IL-IRl以转导信号。在结合IL-I (例如，IL-I α或IL-1 β )后通过IL-1R1转导的信号诱导可以是致病性的广谱生物活性。例如，在结合IL-I后通过IL-IRl转导的信号可以导致局部或全身炎症，以及另外炎症介质(例如，IL-6、11-8、TNF)的确立。因此，IL-1与IL-IRl的相互作用已牵涉于眼疾病的发病机理。结合白细胞介素1受体1型(IL-IRl)且中和其活性的特定试剂(例如，IL-lra)已证明是用于特定炎症状况的有效治疗试剂。发明概述
在第一个方面，本发明提供了包括免疫球蛋白单个可变结构域(或dAb)或由免疫球蛋白单个可变结构域(或dAb)组成的组合物，所述免疫球蛋白单个可变结构域可以例如在递送部位与所需靶分子(例如VEGF、IL-I或TNF-α )结合，用于施用于眼。本发明还提供了包括免疫球蛋白单个可变结构域(或dAb )或由免疫球蛋白单个可变结构域(或dAb)组成的组合物，所述免疫球蛋白单个可变结构域可以与所需靶分子(例如 VEGF.IL-1或TNF-α、TNFR1、TNFR2、IL-Ir)结合，用于治疗、预防或诊断眼疾病或状况的用途，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性视网膜病和糖尿病性黄斑水肿。在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域可以是蛋白酶抗性的，例如对下述一种或多种有抗性丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶制剂、凝血酶、纤溶酶、组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶 G)、蛋白酶(例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、猕猴桃蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶和分离酶(s印arase)。在特定实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme。此种蛋白酶抗性多肽尤其适合于递送给体内的富蛋白酶环境例如眼。蛋白酶还可以由生物提取物、生物勻浆或生物制剂提供。在一个实施方案中， 蛋白酶是在眼和/或眼泪中发现的蛋白酶。在眼中发现的此种蛋白酶的例子包括胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B和D、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、丝氨酸蛋白酶rassi、泛蛋白蛋白体途径(UPP)。在一个实施方案中，蛋白酶是非细菌蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是动物例如哺乳动物例如人蛋白酶。组合物可以递送给眼的不同区域，例如眼的表面、角膜、或泪管(tear duct)或泪腺，或可以存在眼内递送(例如，眼前房或后房例如玻璃体液)和递送给眼结构例如虹膜、睫状体、泪腺，并且组合物可以在眼的这些部分中与靶分子(例如，VEGF, IL-I或TNF-α )结合。组合物还可以递送给眼的眼周区域。靶分子可以例如是VEGF、IL-I或TNF- α，或它可以是任何其他所需靶，例如在眼中存在的靶分子，例如在眼的表面上、在眼内或在泪管或泪腺中，例如靶可以是IL-1、IL_17 或 TNF 受体例如 TNFRl、TGF β、IL-6、IL-8、IL-21、IL-23、CD20、Nogo-a、髓鞘相关糖蛋白 (MAG)或β淀粉状蛋白。在一个实施方案中，本发明提供了用于施用于眼的蛋白酶抗性免疫球蛋白单个可变结构域(或dAb)，例如以滴眼剂的形式或作为凝胶或例如在植入体中。dAb可以例如与眼中存在的靶分子结合，例如VEGF、IL-I或TNF- α。施用于眼可以例如通过局部施用，例如以滴眼剂的形式；或可替代地，它可以通过注射到眼内。使免疫球蛋白单个可变结构域的递送靶向进入眼的特定区域内可以是有用的， 例如眼的表面、或泪管或泪腺，或可以存在眼内递送(例如，眼前房或后房例如玻璃体液)。 因此，本发明进一步提供了将组合物直接递送给眼的方法，其包括通过选自下述的方法将所述组合物施用于眼眼内注射、局部递送、滴眼剂、眼周施用和缓释制剂(例如聚合纳米 (nano)或微粒或凝胶)的使用或通过使用利用离子电渗疗法的递送装置。如果免疫球蛋白单个可变结构域例如通过局部递送例如作为滴眼剂递送给眼，连同眼穿透增强剂例如癸酸钠，或连同粘度增强剂例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)，那么这也可以是有用的。因此，本发明进一步提供了包括下述的组合物(a)与例如眼中的靶分子 (例如VEGF、IL-1或TNF-α )结合的免疫球蛋白单个可变结构域，以及(b)眼穿透增强剂和 /或(c)粘度增强剂，例如用于局部递送给眼。在一个方面，待递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是WO 2008/149146、 WO 2008149147或WO 2008149150中公开的任何一种VEGF dAbs，其与VEGF结合。例如它可以是由氨基酸序列编码的多肽，所述氨基酸序列与D0M15-26-593的氨基酸序列(图Ia中所示SEQ ID NO 1)至少80%等同。在一个实施方案中，同一性百分比是至少70、80、85、 90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%或100%。在一个实施方案中，蛋白酶抗性多肽可通过本文描述的用于分离蛋白酶抗性多肽的方法获得。用于递送给眼的D0M15-26-593还可以进一步包括抗体恒定区的结构域。例如，它可以具有与D0M15-26-593-FC融合物的氨基酸序列(图Ib中所示SEQ ID NO 2)等同的氨基酸序列，或同一性百分比可以是与图Ib SEQ ID NO 2 中所示的那种至少 70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。在一个方面，通过与DOMl5-26-593的氨基酸序列至少80%等同的氨基酸序列(例如，通过97%等同或更多的氨基酸序列)编码的VEGF dAb可以包括在位置6上的缬氨酸和 /或在位置99上的亮氨酸，和/或在位置30上的赖氨酸(Kabat编号)，如WO 2008149150 和WO 2008149147 (其内容引入本文作为参考)中所述的。在进一步的方面，待递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是WO 2008/149144 或 WO 2008/149148 中公开的任何一种抗 TNFRl dAbs。在一个实施方案中，与α -TNF-α Rl结合的免疫球蛋白单个可变结构域可以包括与Dom lh-131-206的氨基酸序列(图4中所示；SEQ ID NO 6)至少97% (例如98%、99% 或100%等同)等同的氨基酸序列。Dom lh-131-206的制备和选择在W02008149148中描述。在再进一步的方面，待递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是WO 2008/149149中公开的任何一种抗IL-IRl dAbs。
在一个实施方案中，与IL-I结合的免疫球蛋白单个可变结构域可以包括与下述至少97% (例如98%、99%或100%等同)等同的氨基酸序列(a)D0M 4-130-54的氨基酸序列(图3中所示；SEQ ID NO 5)；或(b) DOM 0400 PEG的氨基酸序列(图2中所示；SEQ ID NO 4)。DOM 4-130-54 的制备和选择在 WO 2007063311 以及 W02008149149 中描述。为了制备Dom 0400，获得DOM 4-130-54 dAb序列且这样突变，从而使得在位置80上的半胱氨酸替换DOM 4-130-54中存在的脯氨酸，随后通过与在dAb的位置80上的游离半胱氨酸的标准马来酰亚胺偶联，使这种dAb与40KDa线性PEG分子(得自NOF Corporation,欧洲)附本发明还提供了包括免疫球蛋白单个可变结构域或由免疫球蛋白单个可变结构域组成的任何组合物在制备用于治疗、预防或诊断眼状况或疾病的药物中的用途，例如其中所述眼疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性视网膜病或糖尿病性黄斑水肿。本发明还提供了包括免疫球蛋白单个可变结构域或由免疫球蛋白单个可变结构域组成的组合物，例如VEGF、IL-1或TNF-α dAb，用于在治疗、预防或诊断眼状况或疾病中使用，例如AMD、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性视网膜病或糖尿病性黄斑水肿。在一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是D0M15-26-593的氨基酸序列(图Ia中所示；SEQ ID NO 1)或不是 D0M15-26-593-Fc融合物的氨基酸序列(图Ib中所示；SEQ ID NO 2)。在另一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是包括下述申请中公开的任何分子或由下述申请中公开的任何分子组成的分子PCT/GB2008/050399、PCT/GB2008/050400, PCT/GB2008/050406、PCT/GB2008/050405、 PCT/GB2008/050403、PCT/GB2008/050404、PCT/GB2008/050407。在另一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是如 PCT/GB2008/050400 中公开的 Domlh-131-511、Domlh-131-201、 Domlh-131-202、Domlh-131-203、Domlh-131-204、Domlh-131-205 的氨基酸序列。在另一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是如PCT/GB2008/050406中公开的Dom4-130_202的氨基酸序列。在另一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是如PCT/GB2008/050405中公开的Domlh-131_206的氨基酸序列。与免疫球蛋白单个可变结构域组合或结合将其他试剂递送给眼，也可以是有用的，例如递送眼穿透增强剂例如癸酸钠或粘度增强剂例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)，可以是有用的。用于眼递送的单个免疫球蛋白可变结构域(dAbs)(例如，与VEGF、IL-l或TNF-α 结合的那种)可以格式化为具有较大的流体动力学大小，例如通过附着PEG基团、血清清蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或通过与抗体结构域缀合。例如，dAb单体(例如，VEGF dAb)可以格式化为抗体的较大抗原结合片段(例如，格式化为Fab、Fab，、F (ab)2、F (ab，)2、IgG、scFv)。dAb的流体动力学大小及其血清半衰期也可以通过使其与结合结构域(例如，抗体或抗体片段)缀合或连接得到增加，所述结合结构域与增加体内半衰期的抗原或表位结合，如本文描述的(参见，整体引入本文作为参考的 W02006038027的附录1)。例如，VEGF dAb可以与抗血清清蛋白或抗新生Fc受体抗体或抗体片段缀合或连接，例如抗SA或抗新生Fc受体dAb、Fab、Fab，或scFv，或与抗SA亲和体 (affibody)或抗新生Fc受体亲和体缀合或连接。用于在本文描述的组合物中使用的例如与VEGF结合dAbs连接的合适清蛋白、清蛋白片段或清蛋白变体的例子在WO 2005/077042A2和W02006038027中描述，其整体引入本文作为参考。格式化的dAbs (例如由加入聚乙二醇格式化的dAbs)可以具有例如30KDa - 100 KDa例如约50-60 KDa的分子量，并且可以用于递送给视网膜和/或脉络膜和/或泪液。具有约15 KDa分子量的裸(未格式化的)dAbs可以用于递送给玻璃体液和/或房水和/或视网膜和/或脉络膜。在本公开内容自始至终描述的本发明的其他实施方案中，代替在本发明的拮抗剂或配体中使用单个免疫球蛋白可变结构域或“dAb”，预期技术人员可以使用包括dAb的 ⑶Rs的结构域，其结合例如VEGF、IL-I或TNF-α (例如，嫁接到合适的蛋白质支架或骨架上的⑶Rs，例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域)，或可以是包括关于 VEGF, IL-I或TNF-α的结合位点的蛋白质结构域，例如，其中结构域选自亲和体、SpA结构域、LDL受体A类结构域或EGF结构域。公开内容就整体而言应相应解释为提供使用此种结构域代替dAb的拮抗剂、配体和方法的公开内容。本文描述的蛋白酶抗性dAbs可以使用WO 2008149143中描述的方法和教导进行选择，其内容引入本文作为参考。在一个方面，本发明提供了包括例如VEGF、IL-I或TNF-α结合位点的蛋白酶抗性免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述可变结构域当与下述温育时对蛋白酶有抗性
(i)在37°C至少10微克/ml蛋白酶的浓度(c)进行至少1小时的时间(t)；或
(ii)在30°C至少40微克/ml蛋白酶的浓度(c’)进行至少1小时的时间(t)。在一个实施方案中，蛋白酶例如胰蛋白酶与可变结构域的比(基于摩尔/摩尔)是8，000 - 80，000 蛋白酶可变结构域，例如当C是10微克/ml时，比是800 - 80，000蛋白酶可变结构域；或当C或C’是100微克/ml时，比是8，000 - 80，000蛋白酶可变结构域。在一个实施方案中，蛋白酶(例如胰蛋白酶)与可变结构域的比(基于重量/重量，例如微克/微克)是16，000 - 160，000蛋白酶可变结构域，例如当C是10微克/ml时，比是1，600 -160，000蛋白酶可变结构域；或当C或C’是100微克/ml时，比是1，6000 - 160, 000蛋白酶可变结构域。在一个实施方案中，浓度(c或c’)是至少100或1000微克/ml蛋白酶。在一个实施方案中，浓度(c或c’)是至少100或1000微克/ml蛋白酶。参考当与肽或多肽的谱(repertoires)或文库一起作用时(例如，w/w参数)，用于使用的适合于蛋白酶的蛋白酶解活性条件的本文描述。这些条件可以用于测定特定免疫球蛋白单个可变结构域的蛋白酶抗性的条件。在一个实施方案中，时间(t)是或是约1、3或24小时或过夜(例如，约 12-16小时)。在一个实施方案中，可变结构域在条件(i )下是抗性的，并且浓度(c)是或是约10或100微克/ml蛋白酶，并且时间(t)是1小时。在一个实施方案中，可变结构域在条件(ii)下是抗性的，并且浓度(c’)是或是约40微克/ml蛋白酶，并且时间(t)是或是约 3小时。在一个实施方案中，蛋白酶选自胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶制剂。在一个实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是在痰、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗、肺勻浆、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或眼泪或眼中发现的蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是在眼和/或眼泪中发现的蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是非细菌蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是动物例如哺乳动物例如人蛋白酶。在一个实施方案中，可变结构域对胰蛋白酶和/或选自弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶制剂的至少一种其他蛋白酶有抗性。例如，抗性针对胰蛋白酶和弹性蛋白酶；胰蛋白酶和leucozyme ；胰蛋白酶和胰酶制剂；胰蛋白酶、弹性蛋白酶和leucozyme ；胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰酶制剂；胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰酶制剂和leucozyme ；或胰蛋白酶、胰酶制剂和 leucozyme。在一个实施方案中，当在条件(i)或(ii)下例如以IO6- IO13例如IO8- IO12复制单位(感染性病毒体)的噬菌体文库大小温育时，可变结构域展示在噬菌体上。在一个实施方案中，在条件(i)或(ii)下温育后，可变结构域特异性结合VEGF、 IL-I或TNF- α，例如使用BiaCore TM或ELISA，例如噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA 评估的。在一个实施方案中，可变结构域特异性结合A蛋白或L蛋白。在一个实施方案中， 与A或L蛋白特异性结合在条件(i )或(i i )下温育后存在。在一个实施方案中，例如在条件(i )或(ii )下温育后，可变结构域在ELISA例如噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA)中可以具有至少0. 404的OD450读数。在一个实施方案中，例如在条件(i)或(ii)下温育后，可变结构域在凝胶电泳中展示出(基本上)单一条带。在另一个实施方案中，试剂(dAb)可以经由可植入递送设备局部施用于眼。因此， 在一个实施方案中，本发明提供了包含例如VEGF、IL-1或TNF-α dAb的可植入递送设备用于眼递送
在进一步的方面，本发明提供了药物组合物，其包括免疫球蛋白单个可变结构域(例如 dAb)，和药学或生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂用于眼递送。附图
简述
图Ia 描述了 D0M15-26-593的氨基酸序列图Ib 描述了 D0M15-26-593-FC融合物的氨基酸序列图Ic 描述了抗体Fc的氨基酸序列
图2 描述了 DOM 0400 PEG (加入聚乙二醇的抗ILl dAb，分子量约52 KDa)的氨基酸
序列
图3 描述了 D0M4-130-54 (抗ILl dAb)的氨基酸序列图4 描述了 Dom lh-131-206 (抗TNFa Rl dAb)的氨基酸序列发明详述
在本说明书内已参考实施方案描述了本发明，其方式使得能够书写清楚和简明说明书。预期且应当认识到实施方案可以在不背离本发明的情况下不同组合或分开。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与由本领域普通技术人员通常理解相同的含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)。标准技术用于分子、遗传学和生物化学方法(一般参见，Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.禾口 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第4版，John Wiley & Sons, Inc.，其引入本文作为参考)和化学方法。如本文使用的，术语“血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂”或“抗VEGF拮抗剂”等指结合VEGF且可以抑制VEGF的(即一种或多种)功能的试剂(例如，分子、化合物)。如本文使用的，“肽”指经由肽键连接在一起的约2个到约50个氨基酸。如本文使用的，“多肽”指通过肽键连接在一起的至少约50个氨基酸。多肽一般包括三级结构且折叠成功能结构域。如本文使用的，当在适合于蛋白酶活性的条件下与蛋白酶温育时，“对蛋白酶降解有抗性的”肽或多肽(例如，结构域抗体(dAb))基本上不由蛋白酶降解。当在适合于蛋白酶活性的温度与蛋白酶温育约1小时后，不超过约25%、不超过约20%、不超过约15%、不超过约14%、不超过约13%、不超过约12%、不超过约11%、不超过约10%、不超过约9%、不超过约8 %、不超过约7 %、不超过约6 %、不超过约5 %、不超过约4 %、不超过约3 %、不超过约2 %、不超过约1 %、或基本上无一蛋白质由蛋白酶降解时，多肽(例如，dAb )基本上不降解。例如在37或50°C。蛋白质降解可以使用任何合适的方法例如通过SDS-PAGE或如本文描述的功能测定(例如配体结合)进行评估。如本文使用的，“靶配体”指由多肽或肽特异性或选择性结合的配体。例如，当多肽是抗体或其抗原结合片段时，靶配体可以是任何所需抗原或表位。与靶抗原结合依赖于多肽或肽是功能的。如本文使用的，抗体指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F (ab，)2、Fv、 二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双抗体)，无论是衍生自天然产生抗体的任何物种，还是通过重组DNA技术生成的；无论是从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是细菌中分离的。如本文使用的，“抗体形式”指任何合适的多肽结构，其中可以掺入一个或多个抗体可变结构域，以便对结构赋予对于抗原的结合特异性。多种合适的抗体形式是本领域已知的，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、 抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、前述任何一种的抗原结合片段(例如Fv片段 (例如，单链Fv (scFv)、二硫键键合的Fv)、Fab片段、Fab，片段、F (ab，)2片段)、单个抗体可变结构域(例如，dAb、VH、VHH、Vl)和前述任何一种的修饰形式(例如通过聚乙二醇或其他合适聚合物的共价附着修饰的或人源化VHH)。短语“免疫球蛋白单个可变结构域”指抗体可变结构域(VinVffinVJ,其不依赖于其他V区或结构域特异性结合抗原或表位。免疫球蛋白单个可变结构域可以以具有其他可变区或可变结构域的形式(例如，同或异多聚体)存在，其中所述其他区或结构域不是通过单个免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所需的(即，其中免疫球蛋白单个可变结构域不依赖于另外的可变结构域结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与“免疫球蛋白单个可变结构域” 相同，如该术语在本文中使用的。“单个抗体可变结构域”与“免疫球蛋白单个可变结构域” 相同，如该术语在本文中使用的。免疫球蛋白单个可变结构域在一个实施方案中是人抗体可变结构域，但还包括来自其他物种例如啮齿类动物(例如，如WO 00/29004中公开的，其内容整体引入本文作为参考)、护士鲨(nurse shark)和骆驼科物种Vhh dAbs的单个抗体可变结构域。骆驼科物种Vra是免疫球蛋白单个可变结构域多肽，其衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼的物种，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。Vhh可以是人源化的。“结构域”是具有不依赖于蛋白质的其余的三级结构的折叠蛋白质结构。一般地， 结构域负责蛋白质的不连续功能性质，并且在许多情况下可以添加、去除或转移至其他蛋白质，而不丧失蛋白质和/或结构域的剩余部分的功能。“单个抗体可变结构域”是包括抗体可变结构域特有的序列的折叠的多肽结构域。它因此包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已由并非抗体可变结构域特有的序列替换，或已截短或包括N或C末端延伸的抗体可变结构域，以及保留至少全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。如本文使用的，术语“剂量”指一次(单位剂量)全部或经过限定时间间隔以2次或更多次施用施用于受试者的配体的量。例如，剂量可以指在1天(24小时)(日剂量)、2天、1 周、2周、3周或一个或多个月(例如，通过单次施用，或通过2次或更多次施用)的过程期间施用于受试者的配体(例如，包括结合靶抗原的免疫球蛋白单个可变结构域的配体)的量。 剂量之间的时间间隔可以是任何所需时间量。短语“半衰期”指配体(例如，dAb、多肽或拮抗剂)的血清浓度在体内减少50%花费的时间，例如由于配体的降解和/或配体通过天然机制的清除或隔离。本发明的配体可以在体内稳定并且其半衰期通过与分子结合得到增加，所述分子抵抗降解和/或清除或整合。一般地，此种分子是天然存在的蛋白质，其自身具有长体内半衰期。配体的半衰期增加， 如果其功能活性在体内持续长于相似配体的时间段的话，所述相似配体对于半衰期增加分子不是特异性的。例如，对于人血清清蛋白(HSA)特异的配体和靶分子与相同配体比较，在所述相同配体中不存在对于HSA的特异性，即不结合HSA但结合另一种分子。例如，它可以结合细胞上的第三种靶。一般地，半衰期增加10%、20%、30%、40%、50%或更多。半衰期 2乂、31、4乂、51、1(^、2(^、3(^、4(^、5(^或更多范围中的增加是可能的。可替代地或另外地，半衰期最高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x范围中的增加是可能的。如本文使用的，“流体动力学大小”指基于分子通过水溶液的扩散，分子(例如蛋白质分子、配体)的表观大小。可以处理蛋白质通过溶液的扩散或运动，以得到蛋白质的表观大小，其中大小由蛋白质粒子的“斯托克斯(Stokes)半径”或“流体动力学半径”给出。蛋白质的“流体动力学大小”依赖于质量和形状(构象)，从而使得基于蛋白质的总体构象，具有相同分子量的2种蛋白质可以具有不同的流体动力学大小。如本文提及的，术语“竞争”意指第一种靶与其关连靶结合结构域的结合在第二种结合结构域的存在下被抑制，所述第二种结合结构域对于所述关连靶特异。例如，结合可以在立体上被抑制，例如通过结合结构域的物理封闭或通过结合结构域的结构或环境的改变，从而使得其对于靶的亲和力或抗体亲抗原性减少。关于如何执行竞争ELISA和竞争 BiaCore实验，以测定第一种和第二种结合结构域之间的竞争的细节，参见W02006038027。如下执行2个序列之间的“同源性”或“同一性”或“相似性”(该术语在本文中可互换使用)的计算。序列就最佳比较目的进行比对(例如，缺口可以引入第一个和第二个氨基酸或核酸序列的一个或两个中用于最佳比对，并且非同源序列为了比较目的可以被忽视)。在一个实施方案中，就比较目的比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30%、或至少40 %、或至少50 %、或至少60 %、或至少70 %、80 %、90 %、100 %。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置由与第二个序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在那个位置上是等同的(如本文使用的，氨基酸或核酸“同源性”等价于氨基酸或核酸“同一性”)。2个序列之间的百分比同一性是由序列共享的等同位置数目的函数，其中考虑缺口数目和每个缺口的长度，这需要引入用于2个序列的最佳比对。如本文定义的，氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性可以使用算法BLAST 2 Sequences进行制备且测定，其中使用缺省参数(Tatusova， Τ. Α.等k, FEMS Microbiol Lett, 174·ΛΚΙ-Υ视(1999)。蛋白酶抗性
在一个实施方案中，本发明涉及已通过用于蛋白酶抗性dAbs的选择方法进行选择的 dAbs，例如抗VEGF dAbs,TNFRl dAbs,IL-I dAbs，用于递送给眼，其具有所需生物活性例如与VEGF、TNFRl或IL-I结合。2种选择压力在方法中用于产生用于选择多肽的有效过程， 所述多肽是高度稳定的且对蛋白酶降解有抗性，并且具有所需生物活性。如本文描述的，蛋白酶抗性肽和多肽一般保留生物活性。相比之下，蛋白酶敏感肽和多肽在本文描述的方法中被蛋白酶切割或降解，并且因此丧失其生物活性。因此，蛋白酶抗性肽或多肽一般基于其生物活性例如结合活性进行选择。眼环境是富含蛋白酶的环境，并且因此如本文描述的蛋白酶抗性dAbs用于眼递送的用途提供了几个优点。例如，就对于通过一种蛋白酶(例如，胰蛋白酶)的蛋白酶解降解的抗性选择的可变结构域对于通过其他蛋白酶(例如，弹性蛋白酶、leucozyme)的降解也是有抗性的。蛋白酶抗性可以与肽或多肽的较高解链温度(Tm)相关。较高解链温度指示更稳定的可变结构域、拮抗剂、肽和多肽。对蛋白酶降解的抗性还可以与对于靶配体的高亲和力结合有关。因此，本文描述和提及的方法(在WO 2008149143中)提供了选择、分离和/ 或回收dAbs的有效方法，所述dAbs具有所需生物活性，并且充分适合于体内治疗和/或诊断眼用途，因为它们是蛋白酶抗性和稳定的。在一个实施方案中，蛋白酶抗性可以与改善的 PK相关，例如改善超过并非蛋白酶抗性的可变结构域、拮抗剂、肽或多肽。改善的PK可以是改善的AUC (曲线下面积)和/或改善的半衰期。蛋白酶抗性还可以与可变结构域、拮抗剂、肽或多肽对于剪切和/或热应激改善的稳定性和/或在雾化过程中减少的聚集倾向相关，例如改善超过并非蛋白酶抗性的可变结构域、拮抗剂、肽或多肽。在一个实施方案中，蛋白酶抗性与改善的贮存稳定性相关，例如改善超过并非蛋白酶抗性的可变结构域、拮抗剂、 肽或多肽。在一个方面，提供了一个、两个、三个、四个或所有优点，所述优点是对于蛋白酶降解的抗性、较高的Tm和与靶配体的高亲和力结合。本文描述且提及的方法(在WO 2008/149143中)可以用作分离蛋白酶抗性肽或多肽例如dAbs的程序的部分，若需要则其可以包括其他合适的选择方法。在这些情况下，本文描述的方法可以在程序的任何所需点上采用，例如在其他选择方法使用之前或之后。在特定实施方案中，用于眼递送的dAb就针对通过胰蛋白酶、弹性蛋白酶或 leucozyme的降解的抗性进行选择，并且特异性结合VEGF。在这些实施方案中，提供了包括dAbs的文库或谱，并且在适合于蛋白酶解消化的条件下，与胰蛋白酶、弹性蛋白酶或 leucozyme (或包括胰蛋白酶的生物制剂、提取物或勻浆)组合。选择结合VEGF的胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme抗性dAbs。例如，当在37°C在0. 04% (w/w)蛋白酶溶液中温育至少约2小时的时间段时，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。在另一个例子中，当在37°C在 0. 04% (w/w)蛋白酶溶液中温育至少约3小时的时间段时，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。 在另一个例子中，当在37°C在0. 04% (w/w)蛋白酶溶液中温育至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11 小时或至少约12小时的时间段时，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。在另一个方面，提供了产生蛋白酶抗性肽或多肽(例如dAbs)的谱的方法。该方法包括提供肽或多肽的谱；在适合于蛋白酶活性的条件下，使肽或多肽的谱和蛋白酶组合； 和回收特异性结合VEGF的多种肽或多肽，由此产生蛋白酶抗性肽或多肽的谱。相对于其他方法，在本文中描述了蛋白酶、展示系统、用于蛋白酶活性的条件、和用于选择适合于用于在方法中使用的肽或多肽的方法。在一些实施方案中，使用包括肽或多肽谱的展示系统(例如，使核酸的编码功能和由核酸编码的肽或多肽的功能特征连接的展示系统)，并且该方法进一步包括扩增或增加编码多种所选择的肽或多肽的核酸拷贝数。核酸可以使用任何合适方法进行扩增，例如通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链反应。在特定实施方案中，提供了产生包括抗VEGF dAbs的蛋白酶抗性多肽的谱的方法。该方法包括提供包括抗VEGF dAbs的多肽的谱；在适合于蛋白酶活性的合适条件下， 使肽或多肽的谱和蛋白酶(例如，胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme)组合；和回收包括对于 VEGF具有结合特异性的dAbs的多种多肽。该方法可以用于产生首次用于实验的谱，或朝所需结合特异性偏倚的谱，例如基于对于VEGF具有结合特异性的亲本dAb的亲和力成熟谱。选择/分离/回收
使用任何合适的方法可以从谱或文库(例如，在展示系统中)中选择、分离和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽(例如，蛋白酶抗性多肽的群体)。在一个实施方案中，基于可选择的特征 (例如，物理特征、化学特征、功能特征)，选择或分离蛋白酶抗性多肽。合适的可选择功能特征包括谱中肽或多肽的生物活性，例如与一般配体(例如超抗原)结合、与靶配体(例如，抗原、表位、底物)结合、与抗体结合(例如通过肽或多肽上表达的表位)、和催化活性。(参见例如，Tomlinson 等人，WO 99/20749 ；WO 01/57065 ；WO 99/58655)。在一个实施方案中，选择基于与VEGF的特异性结合。在另一个实施方案中，选择基于选择的功能特征，以产生其中成员是蛋白酶抗性的第二个谱，随后从第二个谱中选择特异性结合VEGF的成员。在一些实施方案中，从肽或多肽的文库或谱中选择和/或分离蛋白酶抗性肽或多肽，其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽共享共同的可选择特征。例如，蛋白酶抗性肽或多肽可以选自文库或谱，其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽结合共同一般配体，结合共同靶配体，结合共同抗体(或由之结合)，或具有共同催化活性。这类选择特别用于制备蛋白酶抗性肽或多肽的谱，其基于具有所需生物活性的亲本肽或多肽，例如当执行免疫球蛋白单个可变结构域的亲和力成熟时。基于与共同一般配体的结合的选择可以获得包含所有或基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽的肽或多肽集合或群体，所述肽或多肽是原始文库或谱的组分。例如，通过淘选或使用合适的亲和基质，可以选择、分离和/或回收结合靶配体或一般配体的肽或多肽，例如 A蛋白、L蛋白或抗体。淘选可以这样完成通过将配体(例如，一般配体、靶配体)溶液添加到合适容器(例如，管、培养皿)，并且允许配体沉积或包被到容器的壁上。可以洗掉过量配体，并且可以将肽或多肽(例如，已与蛋白酶温育的谱)添加到容器中，并且使容器维持在适合于肽或多肽结合固定化配体的条件下。可以洗掉未结合的肽或多肽，并且使用任何合适的方法例如刮取或降低PH，可以回收结合的肽或多肽。合适的配体亲和基质一般包含配体与之共价或非共价附着的固体支持体或珠(例如，琼脂糖)。在适合于肽或多肽与基质上的配体结合的条件下，使用分批过程、柱过程或任何其他合适过程，亲和基质可以与肽或多肽(例如，已与蛋白酶温育的谱)组合。可以洗掉不结合亲和基质的肽或多肽，并且可以使用任何合适方法洗脱且回收结合的肽或多肽，例如用较低PH的缓冲液洗脱、用温和的变性剂(例如，尿素)、或用与配体竞争结合的肽。在一个例子中，在适合于谱中的肽或多肽结合靶配体(VEGF)的条件下，使生物素化的靶配体与谱组合。使用固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(例如，在珠上)回收结合的肽或多肽。在一些实施方案中，一般配体是抗体或其抗原结合片段。结合肽或多肽的结构特征的抗体或抗原结合片段作为一般配体是特别有用的，所述结构特征在文库或谱的肽或多肽中基本上保守的。适合于用作配体用于分离、选择和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽的抗体和抗原结合片段可以是单克隆或多克隆的，并且可以使用任何合适的方法进行制备。用于产生蛋白酶抗性多肽的核酸、宿主细胞和方法
通过本文描述的方法选择的蛋白酶抗性肽或多肽还可以在合适的体外表达系统中，例如大肠杆菌(E. coli)或毕赤氏酵母属(Pichia)物种例如巴斯德毕赤氏酵母(P. pastoris)，通过化学合成或通过任何其他合适方法产生。多肽、dAbs和拮抗剂
如本文描述的，蛋白酶抗性dAbs —般以高亲和力结合其靶配体。例如，VEGFdAb 可以以 300 nM - 1 pM (即 3 χ 10"- 5 χ I(T12M)的亲和力(KD ； KD=Koff (kd)/K。n (ka)，如通过表面等离振子共振测定的)结合VEGF，例如50 nM - 1 pM、 例如5 nM - 1 pM和例如1 nM - 1 pM ；例如1 χ IO"7 M或更少、例如1 χ IO"8 M或更少、 例如1 χ 10_9 M或更少、例如1 χ ICTki M或更少和例如1 χ 10_" M或更少的Kd ；和/或5 χ IO"1 S-1 - 1 χ IO"7 s人例如 1 χ IO"2 S-1 - 1 χ IO"6 s人例如 5 χ IO"3 s"1 - 1 χ 1(Γ5 s入例如5 χ ICT1 或更少、例如1 χ 1(T2 或更少、例如1 χ 1(Γ3 或更少、例如1 χ 10_4 s—1或更少、例如1 χ 10_5 s—1或更少、和例如1 χ 10_6 s—1或更少的K。ff速率常数，如通过表面等离振子共振测定的。尽管我们不受任何具体理论束缚，但对蛋白酶抗性的肽和多肽被认为具有较低的熵和/或较高的稳定能量。因此，蛋白酶抗性和高亲和力结合之间的关联可以涉及肽和多肽表面与通过本文描述的方法选择的dAbs的紧密性和稳定性。在一个实施方案中，VEGF dAb以约1 μ M或更少、约500 nM或更少、约100 nM或更少、约75 nM或更少、约50 nM或更少、约10 nM或更少或约1 nM或更少的IC50的浓度 50 (IC50)抑制VEGF的结合。在特定实施方案中，VEGF dAb特异性结合VEGF，例如人VEGF，并且以300 nM -ΙρΜ、或 300nM - 5pM、或 50ηΜ - ΙρΜ、或 50nM - 5pM、或 50nM - 20 pM、或约 10 pM、或约 15pM、或约20pM的解离常数(Kd)与人VEGF解离，如通过表面等离振子共振测定的。在特定实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂特异性结合VEGF，例如人VEGF，并且以5 χ 10—1 s—1 - 1 χ 10-78-1、例如1 χ 1(Γ2 s"1 - 1 χ 1(Γ6 s人例如 5 χ 1(Γ3 s"1 - 1 χ 1(Γ5 s人例如 5 χ IO"1 s—1或更少、例如1 χ 10_2 s—1或更少、例如1 χ 10_3 s—1或更少、例如1 χ 10_4 s—1或更少、 例如1 χ 10_5 s—1或更少、和例如1 χ 10_6 s—1或更少的K。ff速率常数与人VEGF解离，如通过表面等离振子共振测定的。在特定实施方案中，VEGFdAb 以 IxliT3 M^1S-1 - 1x10" IT1S入或 IxliT3 M^1S-1 -IxlO-6 Μ、—1、或约 IxlO-4 Μ—1 S—1、或约 IxlO-5 Μ、—1 的Κ。η特异性结合VEGF，例如人 VEGF。在一个实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂特异性结合VEGF，例如人VEGF，并且以如这个段落中限定的解离常数(Kd)和K。ff与人VEGF解离。在一个实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂特异性结合VEGF，例如人VEGF，并且以如这个段落中限定的解离常数(Kd)和K。n与人VEGF解离。在一些实施方案中，多肽或dAb以如这个段落中所述的Kd和/或K。ff和/或K。n特异性结合VEGF (例如人VEGF)，并且包括与dAb的氨基酸序列至少或至少约80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%等同的氨基酸序列，所述 dAb 具有 DOMl5_26_593 的氨基酸序列。dAb可以在大肠杆菌或毕赤氏酵母属物种(例如巴斯德毕赤氏酵母)中表达。在一个实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤氏酵母属物种(例如巴斯德毕赤氏酵母)中表达时，配体或dAb单体以至少约0.5 mg/L的量分泌。尽管当在大肠杆菌或毕赤氏酵母属物种(例如巴斯德毕赤氏酵母)中表达时，本文描述的配体和dAb单体可以是可分泌的，但它们可以使用不采用大肠杆菌或毕赤氏酵母属物种的任何合适方法产生，例如合成化学方法或生物生产方法。在一些实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂不包括骆驼科动物免疫球蛋白可变结构域，或由骆驼科动物种系抗体基因区段编码的免疫球蛋白可变结构域独特的一个或多个构架氨基酸，例如在位置108、37、44、45和/或47上。VEGF的拮抗剂可以是单价或多价的。在一些实施方案中，拮抗剂是单价的，并且包含与VEGF相互作用的一个结合位点，所述结合位点由本发明的多肽或dAb提供。多价拮抗剂结合一个VEGF，并且可以不诱导VEGF在细胞表面上的交联或聚簇，这可以导致受体激活和信号转导。可替代地，VEGF的拮抗剂是多价的。VEGF的多价拮抗剂可以包含关于VEGF的特定结合位点的2个或更多个拷贝，或包含结合VEGF的2种或更多种不同结合位点，至少一种结合位点由本发明的dAb提供。例如，如本文描述的，VEGF的拮抗剂可以是包括结合VEGF 的dAb的2个或更多个拷贝，或结合VEGF的2种或更多种不同dAbs的二聚体、三聚体或多聚体。在其他实施方案中，dAb以本文描述的Kd特异性结合VEGF，并且在标准鼠异种移植物模型中抑制肿瘤生长(例如，与合适对照相比较，使肿瘤生长抑制至少约10%)。在一个实施方案中，当以约1 mg/kg或更多例如约5或10 mg/kg施用时，与标准鼠异种移植物模型中的合适对照相比较，多肽、dAb或拮抗剂使肿瘤生长抑制至少约10%或至少约25%、或至少约50%。在其他实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂结合VEGF，并且在标准细胞测定中以< 100 nM的ND50拮抗VEGF的活性。
在特定实施方案中，当施用有效量时，dAbs在眼疾病的动物模型中是有效的。一般地，有效量是约1 mg/kg -约10 mg/kg (例如约1 mg/kg、约2 mg/kg、约3 mg/kg、约4 mg/kg、约 5 mg/kg、约 6 mg/kg、约 7 mg/kg、约 8 mg/kg、约 9 mg/kg 或约 10 mg/kg)。dAb 可以以例如每天一次或两次、每周一次或两次、每月一次或两次的给药频率施用。一般地，dAbs将以纯化形式连同用于眼递送的药理学上合适的载体一起利用。一般地，这些载体可以包括水或醇/水溶液、乳状液或悬浮液、包括盐水和/或缓冲介质的任何一种。维持悬浮液中的多肽复合物所需的合适的生理学上可接受的佐剂，可以选自增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体 (Mack(\^2)Remington fs Pharmaceutical Sciences，第 16 版)。可以使用多种合适制剂， 包括延长释放制剂。这些可以包括植入体、凝胶、纳米颗粒(nanoparticle)和微粒。药物装载的PLA纳米颗粒和微粒已用于在制剂的结膜下递送后将药物递送给眼的后段(Kompella 等人IOVS 2003 44 (3) 1192-1201)。具体地，小球体保留在递送部位，并且与可以更快速清除的纳米颗粒相比较，看起来更适合于视网膜药物递送(Amrite等人ARVO摘要#5067/ B391 2003)。本发明的配体(例如，拮抗剂)可以作为分开施用的组合物或与其他试剂一起使用。这些可以包括用于眼递送给眼的各种药物和/或眼穿透增强剂和/或粘度增强剂。药物组合物可以包括与本发明的配体一起的各种其他试剂的“混合物 (cocktails)”，或甚至具有不同特异性的根据本发明的配体的组合，例如使用不同靶抗原或表位选择的配体，无论它们是否在施用前合并。dAbs对于眼的施用的精确剂量和频率将依赖于患者的年龄、性别和状况，其他药物的同时施用，禁忌症和由临床医生考虑的其他参数。本发明的dAbs可以冻干用于贮存且在使用前在合适载体中重构。这种技术已显示对于常规免疫球蛋白是有效的，并且可以采用领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将认识到冻干和重构可以导致不同程度的抗体活性丧失(例如对于常规免疫球蛋白， IgM抗体趋于具有比IgG抗体更大的活性丧失)，并且使用水平可能必须向上调整以补偿。包含本文的dAbs或其混合物的组合物可以施用用于预防和/或治疗处理。在特定治疗应用中，实现所选细胞群体的至少部分抑制、阻抑、调节、杀死或一些其他可测量参数的足够量可以被定义为“治疗有效剂量”。达到这个剂量所需的量将依赖于疾病的严重程度和患者的自身免疫系统的一般状态。有经验的临床医生将能够确定治疗、阻抑或预防疾病的合适给药时间间隔。如果相对于治疗前存在的此种症状，或相对于未用此种组合物治疗的个体(人或模型动物)中的此种症状或其他合适对照，一种或多种症状减少(例如，在临床评估规模上至少10%或至少1个点)，那么使用本文描述的组合物进行的治疗或疗法被视为“有效的”。 症状将明显依赖于靶向的疾病或病症而改变，但可以通过普通有经验的临床医生或技术员进行测量。例如通过监控疾病或病症的一种或多种生物化学指示剂的水平(例如，与疾病相关的酶或代谢物的水平、受累细胞数目等)，通过监控物理表现或通过公认的临床评估量表，可以测量此种症状。类似地，如果相对于未用此种组合物治疗的相似个体(人或模型动物)中的此种症状，一种或多种症状的发作或严重程度延迟、减少或取消，那么使用如本文描述的组合物执行的预防是“有效的”。在一个实施方案中，本发明是用于治疗、阻抑或预防眼疾病或状况的方法，所述眼疾病或状况选自例如癌症(例如实体瘤)、炎性疾病、自身免疫性疾病、血管增殖性疾病(例如AMD (年龄相关性黄斑变性))，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、与VEGF结合的dAb或VEGF的拮抗剂，或IL-1、或TNF- α或 TNF-QR0此种眼疾病或状况的例子包括AMD、葡萄膜炎、干眼病、糖尿病性视网膜病和糖尿病性黄斑水肿。形式
增加的半衰期在免疫球蛋白的体内应用中是有用的，特别是抗体且最特别是小尺寸的抗体片段。此种片段(Fvs、二硫键键合的FVS、FabS、SCFVS、dAbS)可以遭受从身体快速清除的缺点；因此，虽然它们能够快速到达身体的大多数部分，并且快速生产且更易于处理，但它们的体内应用已受其在体内的仅短暂持续限制。因此，本文描述的dAbs可以进行修饰， 以提供增加的体内半衰期和因此体内更长的持续时间。用于药物代谢动力学分析和配体半衰期测定的方法将是本领域技术人员熟悉的。 细节可以在如仰< 仇义 .-Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists 禾口 Zfeier1S^yLPharmacokinetic analysis :A Practical ApproachC 1996) 中找至LU 还参考"Pharmacokinetics，，，M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker，2nd Rev. ex edition (1982)，其描述了药物代谢动力学参数，例如t α和 β半衰期和曲线下面积(AUC)。半衰期(伐α和伐β )和AUC可以由配体血清浓度针对时间的曲线进行测定。 WinNonlin 分析包(可从 Pharsight Corp. ,Mountain View，CA94040，USA 获得)可以例如用于给曲线建模。在第一个相(α相)中，配体经历在患者中的主要分布，伴随一些消除。第二个相(β相)是终末相，那时配体已分布且血清浓度随着配体从患者中清除而减少。ta 半衰期是第一个相的半衰期，并且t β半衰期是第二个相的半衰期。因此，在一个实施方案中，本发明提供了配体或包括根据本发明的配体的组合物，所述配体具有在15分钟或更多的范围中的t α半衰期。在一个实施方案中，范围的下端是30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。此外或可替代地，根据本发明的配体或组合物将具有在最高达且包括12小时的范围中的t α半衰期。在一个实施方案中，范围的上端是11、10、9、8、7、6或5小时。合适范围的例子是1 - 6小时、2 -5小时或3 - 4小时。在一个实施方案中，dAb或包括根据本发明的dAb的组合物具有在30分钟或更多的范围中的ti3半衰期。在一个实施方案中，范围的下端是45分钟、1小时、2小时、3小时、 4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。此外或可替代地，根据本发明的配体或组合物具有在最高达且包括21天的范围中的t β半衰期。在一个实施方案中，范围的上端是12小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天或20天。在一个实施方案中，根据本发明的配体或组合物将具有在12 - 60小时的范围中的ti3半衰期。在进一步的实施方案中，它将在12 - 48小时的范围中。在再一个进一步的实施方案中，它将在12 - 26小时的范围中。
对于上述标准另外或可替代地，本发明提供了 dAb或包括根据本发明的配体的组合物，所述配体具有在1 mg.分钟/ml或更多的范围中的AUC值(曲线下面积)。在一个实施方案中，范围的下端是5、10、15、20、30、100、200或300 mg.分钟/ml。此外或可替代地， 根据本发明的配体或组合物具有在最高达600 mg.分钟/ml的范围中的AUC。在一个实施方案中，范围的上端是500、400、300、200、150、100、75或50 mg.分钟/ml。在一个实施方案中，根据本发明的配体将具有在选自下述的范围中的AUC :15 - 150 mg.分钟/ml、15 -100 mg.分钟/ml、15 - 75 mg.分钟/ml、和 15 - 50mg.分钟/ml。本发明的dAbs可以格式化为具有较大的流体动力学大小，例如通过附着PEG基团、血清清蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或通过与抗体结构域缀合。例如，dAbs可以格式化为抗体的较大抗原结合片段或抗体(例如，格式化为Fab、Fab，、F (ab)2、F (ab，)2、IgG、scFv)。在另一个实施方案中，根据本发明的dAbs 可以格式化为具有另一种多肽或肽的融合物或缀合物。本发明的配体(例如，dAb单体和多聚体)的流体动力学大小可以使用本领域众所周知的方法进行测定。例如，凝胶过滤层析可以用于测定配体的流体动力学大小。用于测定配体的流体动力学大小的合适凝胶过滤基质例如交联琼脂糖基质是众所周知且可容易获得的。配体即dAb形式的大小(例如，与dAb单体附着的PEG部分的大小)可以依赖于所需应用而改变，例如如果需要dAb保留在体循环中更长时间段，那么可以例如通过格式化为Ig样蛋白质来增加大小。通丄寸靶向 曾力口体内半衰其月的抗JC或表位的半衰其月延长
配体的流体动力学大小及其血清半衰期还可以通过使dAb与结合结构域(例如，抗体或抗体片段)缀合或结合得到增加，所述结合结构域结合增加体内半衰期的抗原或表位，如本文描述的。例如，VEGF dAb可以与抗血清清蛋白或抗新生Fc受体抗体或抗体片段缀合或连接，例如抗SA或抗新生Fc受体dAb、Fab、Fab，或scFv，或与抗SA亲和体或抗新生Fc受体亲和体或抗SA avimer、或抗SA结合结构域缀合或连接，其包括选自但优选不限于下述的支架CTLA-4、脂质运载蛋白(lipocallin)、SpA、亲和体、avimer、GroEl和纤连蛋白(关于这些结合结构域的公开内容，参见于2008年2月8日提交的PCT/GB2008/000453，所述结构域及其序列引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分)。缀合指包括与结合结构域键合(共价或非共价)的本发明的多肽、dAb或拮抗剂的组合物，所述结合结构域结合血清清蛋白。增强体内血清半衰期的合适多肽包括例如运铁蛋白受体特异性配体-神经药物试剂融合蛋白质(参见美国专利号5，977，307，其教导引入本文作为参考)、脑毛细血管内皮细胞受体、运铁蛋白、运铁蛋白受体(例如，可溶性运铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1 (IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2 (IGF 2)受体、胰岛素受体、凝血因子X、α 1-抗胰蛋白酶和HNF Ia。增强血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类粘蛋白；AAG)、 α -1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α -1微球蛋白(蛋白质HC ；AIM)、抗凝血酶IIKAT III)、脱脂载脂蛋白A-I (Apo A-1)、脱脂载脂蛋白B (Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3 (C3)、 补体成分C4 (C4)、Cl酯酶抑制剂(Cl INH)、C反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血红素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a) (Lp (a))、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前清蛋白(运甲状腺素蛋白；PAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。来自细胞外基质的合适蛋白质包括例如胶原、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。 胶原是细胞外基质的主要蛋白质。约15种类型的胶原分子是目前已知的，在身体的不同部分中发现，例如在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现的I型胶原(占90%的身体胶原)，或在软骨、脊椎盘、脊索和眼的玻璃体液中发现的Π型胶原。来自血液的合适蛋白质包括例如血浆蛋白质(例如，血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清清蛋白、纤维蛋白原(例如，纤维蛋白原Α、纤维蛋白原B)、血清淀粉状蛋白A蛋白、触珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白和β-2-微球蛋白)、酶和酶抑制剂(例如，纤溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)、免疫系统的蛋白质例如免疫球蛋白蛋白质(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(κ/λ ))、转运蛋白(例如，视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白)、防卫素(例如，β -防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素2和嗜中性粒细胞防卫素3)等。在血脑屏障处或在神经组织中发现的合适蛋白质包括例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸盐转运蛋白等。增强体内血清半衰期的合适多肽还包括定位至肾的蛋白质(例如，多囊蛋白、IV 型胶原、有机阴离子转运蛋白Kl、Heymarm氏抗原)、定位至肝的蛋白质(例如，醇脱氢酶、 G250)、定位至肺的蛋白质(例如，分泌成分，其结合IgA)、定位至心脏的蛋白质(例如，HSP 27，其与扩张型心肌病相关)、定位至皮肤的蛋白质(例如，角蛋白)、骨特异性蛋白质例如形态发生蛋白质(BMPs)，其是显示生骨活性的蛋白质的转化生长因子β超家族亚群(例如， ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8)、肿瘤特异性蛋白质(例如，滋养层抗原、赫赛汀(here印tin)受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B，其可以在肝和脾中发现))。合适的疾病特异性蛋白质包括例如仅在活化T细胞上表达的抗原，包括LAG_3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白配体(0PGL ；参见^Vatore 402,304-309 (1999)),0X40 (TNF受体家族成员，在活化T细胞上表达且在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)生产细胞中特异性上调；参见/厕卯^. 165 (1) :263-70 (2000))。合适的疾病特异性蛋白质还包括例如金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠 ftsH;和生血管生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、转化生长因子-a (TGF α)、 肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、血管生成素、白细胞介素-3 (IL_3)、白细胞介素_8 (IL_8)、 血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(P1GF)、中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB (PDGF)JP CXXXC 趋化因子(fractalkine)。增强体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白质例如热休克蛋白(HSPs)。HSPs 通常在细胞内发现。当它们在细胞外发现时，它是细胞已死亡且溢出其内容物的指示剂。当由于创伤、疾病或损伤，细胞外HSI^s触发来自免疫系统的应答时，这种非程序性细胞死亡 (坏死)发生。与细胞外HSP结合可以导致本发明的组合物定位至疾病部位。与及Fc转运有关的合适蛋白质包括例如Brambell受体(也称为FcRB)。这种Fc 受体具有2种功能，这两者对于递送都潜在有用。功能是(DIgG从母亲跨越胎盘转运到孩子，(2)保护IgG不受降解，从而延长其血清半衰期。认为受体使来自内体的IgG再循环。(参见，Holliger 等人，Sio iecAflo/ 15 (7):632-6 (1997)·) 结合血清清蛋白的dAbs
在一个实施方案中，本发明与眼靶分子例如VEGF、IL-I或TNF-α结合的第一种dAb， 和结合血清清蛋白(SA)的第二种dAb，如通过表面等离振子共振测定的，所述第二种dAb以 InM - 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400 或 500 μ M(即 χ 1(Γ9 - 5 χ 1(Γ4)，或 100 ηΜ - 10 μ Μ，或 1 - 5 μ Μ，或 3 - 70 ηΜ，或 IOnM - 1、2、3、4 或 5μ M 的 Kd结合SA。例如，如通过表面等离振子共振测定的30 - 70 ηΜ。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测定的，第一种dAb (或dAb单体)以约1、50、70、100、150、200、300 ηΜ 或1、2或3 μ M的Kd结合SA (例如HSA)。在一个实施方案中，对于包括第一种抗SA dAb 和针对VEGF的第二种dAb的双重特异性配体，第二种dAb对于其靶的亲和力(例如，如通过表面等离振子共振测量的Kd和/或K。ff，例如使用BiaCore)是第一种dAb对于SA的亲和力的 1 - 100000 倍(例如 100 - 100000、或 1000 - 100000、或 10000 - 100000 倍)。在一个实施方案中，血清清蛋白是人血清清蛋白(HSA)。例如，第一种dAb以约10 μΜ的亲和力结合SA，而第二种dAb以100 pM的亲和力结合其靶。在一个实施方案中，血清清蛋白是人血清清蛋白(HSA)。在一个实施方案中，第一种dAb以约50，例如70、100、150或200 ηΜ的 Kd结合SA (例如HSA)。双重特异性配体的细节在W0030(^609、W004003019和W004058821 中找到。在一个实施方案中，本发明的dAbs可以包括dAb，如通过表面等离振子共振测定的，所述 dAb 以 InM- 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400 或 500 μ M (即 χ 10-9 - 5 χ 10-4)，或 100 nM - 10 μ Μ，或 1 - 5 μ Μ，或 3 - 70 ηΜ，或 IOnM -1、2、3、4或5μ M的Kd结合血清清蛋白(SA)。例如，如通过表面等离振子共振测定的30 -70 ηΜ。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测定的，第一种dAb (或dAb单体)以约 1、50、70、100、150、200、300 ηΜ 或 1、2 或 3 μ M 的 Kd 结合 SA (例如 HSA)。在一个实施方案中，第一种和第二种dAbs通过接头连接，例如1-4个氨基酸或1-3个氨基酸，或超过3 个氨基酸或超过4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸的接头。在一个实施方案中，较长接头 (超过3个氨基酸)用于增强效价(拮抗剂中的一种或两种dAbs的KD)。在特定实施方案中，dAb结合人血清清蛋白且与选自下述的dAb竞争与清蛋白的
结合
MSA-16、MSA-26(关于这些序列的公开内容参见W004003019，所述序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分)，(关于这些序列的公开内容参见W02007080392，所述序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分；这个段落中的SEQ ID No，s是W02007080392中出现的那些)，
权利要求
1.一种组合物，其包括与靶分子结合的免疫球蛋白单个可变结构域，用于眼递送。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域对蛋白酶有抗性， 其中所述蛋白酶选自眼蛋白酶、胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶d、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、丝氨酸蛋白酶rassi、和泛蛋白蛋白体途径(UPP)，用于眼递送。
3.根据任何前述权利要求的组合物，其包括与选自下述的靶分子结合的免疫球蛋白单个可变结构域VEGF、TNFa、TNF a R、IL-1、IL_lr、TNF a Rl、TGF β、IL-6、IL-8 IL-17、 IL-21、IL-23、CD20、Nogo-a、髓鞘相关糖蛋白(MAG)和β淀粉状蛋白，用于眼递送。
4.根据权利要求3的组合物，其中与VEGF结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与下述至少97%等同的氨基酸序列(a)D0M15-26-593的氨基酸序列(SEQ ID NO 1中所示)，或(b)D0M15-26-593-Fc 的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域包括在位置6上的缬氨酸，其中编号根据Kabat。
6.根据权利要求4的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域包括在位置99上的亮氨酸，其中编号根据Kabat。
7.根据权利要求4的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域包括在位置30上的赖氨酸，其中编号根据Kabat。
8.根据权利要求4的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与选自下述的序列等同的氨基酸序列(a)D0M15-26-593的氨基酸序列(SEQ ID NO 1中所示)，(b) D0M15-26-593-Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO 2中所示)。
9.根据权利要求3的组合物，其中与IL-I结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与下述至少97%等同的氨基酸序列(a) DOM 4-130-54的氨基酸序列(SEQ ID NO 5中所示)；或(b)DOM 0400 PEG的氨基酸序列(SEQ ID NO 4中所示)。
10.根据权利要求9的组合物，其中与IL-I结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与下述等同的氨基酸序列(a) DOM 4-130-54的氨基酸序列(SEQ ID NO 5中所示)，或 (b)DOM 0400 PEG的氨基酸序列(SEQ ID NO 4中所示)。
11.根据权利要求3的组合物，其中与a-TNF-aRl结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与Dom lh-131-206的氨基酸序列(SEQ ID NO 6中所示)至少97%等同的氨基酸序列。
12.根据权利要求3的组合物，其中与α-TNF-αRl结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与Dom lh-131-206的氨基酸序列(SEQ ID NO 6中所示)等同的氨基酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包括抗体恒定区的结构域，其中所述抗体恒定区是抗体Fc区。
14.根据权利要求9的组合物，其中所述抗体Fc区具有SEQID NO 3中所示的氨基酸 Fc序列。
15.根据权利要求9的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域作为具有Fc的融合物存在，并且具有与D0M15-26-593-FC融合物的氨基酸序列(SEQ ID NO 2中所示)等同的氨基酸序列。
16.一种组合物，其包括裸免疫球蛋白单个可变结构域，其与靶分子结合用于递送至选自下述的一个或多个眼区域玻璃体液、房水、视网膜和脉络膜。
17.根据权利要求16的组合物，其中所述靶分子选自VEGF、VEGF拮抗剂、TNFα ,TNFa 受体、IL-I、a -TNF- a Rl、IL-6、IL-8、IL-17、IL-21、IL-23、Nogo_a、髓鞘相关糖蛋白(MAG) 和β淀粉状蛋白。
18.根据权利要求16或17的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域对蛋白酶有抗性，其中所述蛋白酶选自眼蛋白酶、胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、丝氨酸蛋白酶 I3RSS1、和泛蛋白蛋白体途径(UPP )。
19.根据权利要求16或17的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域选自(a) 与VEGF结合且包括与下述至少97 %等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域(i ) D0M15-26-593的氨基酸序列(SEQ ID NO 1中所示)，或(ii) D0M15-26-593_Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO 2中所示)，(b)与IL-I结合且包括与下述至少97%等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域(i)D0M 4-130-54的氨基酸序列(SEQ ID NO 5中所示);或(ii) DOM 0400 PEG的氨基酸序列(SEQ ID NO 4中所示);(c)与α-TNF-α Rl结合且包括与Dom lh-131-206的氨基酸序列(SEQ ID NO 6中所示)至少97%等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域。
20.一种组合物，其包括格式化的免疫球蛋白单个可变结构域，其与靶分子结合用于递送至选自下述的一个或多个眼区域视网膜、脉络膜和泪液。
21.根据权利要求20的组合物，其中所述靶分子选自VEGF、VEGF拮抗剂、TNFa、 TNFa 受体、IL-I、a-TNF-a Rl、IL-17、IL-21、IL-23、Nogo_a、髓鞘相关糖蛋白(MAG)和 β 淀粉状蛋白。
22.根据权利要求20或21的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域对蛋白酶有抗性，其中所述蛋白酶选自眼蛋白酶、胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属蛋白酶(ADAMs)和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、丝氨酸蛋白酶 I3RSS1、和泛蛋白蛋白体途径(UPP )。
23.根据权利要求16或17的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域选自(a) 与VEGF结合且包括与下述至少97 %等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域(i ) D0M15-26-593的氨基酸序列(SEQ ID NO 1中所示)，或(ii) D0M15-26-593_Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO 2中所示)，(b)与IL-I结合且包括与下述至少97%等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域(i)D0M 4-130-54的氨基酸序列(SEQ ID NO 5中所示);或(ii) DOM 0400 PEG的氨基酸序列(SEQ ID NO 4中所示);(c)与α-TNF-α Rl结合且包括与Dom lh-131-206的氨基酸序列(SEQ ID NO 6中所示)至少97%等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域。
24.根据权利要求20-23的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域具有约50 KDa的分子量。
25.根据权利要求20-24的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域通过加入聚乙二醇或与抗体Fc融合进行格式化。
26.根据前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包括选自下述的一种或多种增强剂眼穿透增强剂和粘度增强剂。
27.根据前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包括药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
28.一种将根据权利要求1-27中任一项的组合物直接递送给眼的方法，其包括通过选自下述的方法将所述组合物施用于所述眼例如通过滴眼剂或眼内注射局部递送给眼、眼周施用或通过缓释制剂。
29.一种用于治疗、预防或诊断眼状况的方法，其包括通过选自下述的方法将根据权利要求1-27中任一项的组合物直接施用于眼眼内注射、玻璃体内注射、例如通过滴眼剂局部递送给眼、或通过眼周施用和缓释制剂。
30.根据权利要求28或29的方法，其中所述组合物施用于选自下述的一个或多个眼区域眼的表面、泪管、泪腺、眼内区域、前房、后房和玻璃体液。
31.一种将根据权利要求16-19和26-27的组合物递送给选自下述的一个或多个眼区域的方法玻璃体液、房水、视网膜和脉络膜，所述方法包括通过局部递送例如通过使用滴眼剂将所述组合物施用于所述眼。
32.—种将根据权利要求20-27的组合物递送给选自下述的一个或多个眼区域的方法视网膜、脉络膜和泪液，所述方法包括通过局部递送例如通过使用滴眼剂将所述组合物施用于所述眼。
33.一种用于产生药物组合物的方法，其包括(a)使权利要求1-27中任一项的组合物与(b)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
34.根据权利要求33的方法，其中所述药物组合物用于治疗、预防或诊断眼状况或疾病。
35.根据权利要求34的方法，其中所述眼状况或疾病选自AMD、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿和葡萄膜炎。
全文摘要
本发明涉及免疫球蛋白单个可变结构域(dAbs)，例如其为蛋白酶抗性的dAbs，并且还涉及用于眼递送的包括此种dAbs的制剂和组合物，及其治疗眼疾病和状况的用途。
文档编号C07K16/22GK102224169SQ200980146999
公开日2011年10月19日 申请日期2009年11月4日 优先权日2008年11月26日
发明者F·库克, G·W·高夫, I·R·凯奇波尔, L·耶斯佩斯, M·斯图尔德 申请人:葛兰素集团有限公司