专利名称：激活素iib受体多肽的变异体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明的技术领域涉及转化生长因子-β (TGF-β)家族成员和性能改进的可溶性TGF-β受体，以及调节用于治疗各种障碍的TGF-β家族成员活性的方法。
背景技术：
蛋白的转化生长因子β (TGF-β)家族包括转化生长因子-β (TGF-β)、激活素、 骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和生长/分化因子(⑶F)。这些家庭成员都与包括细胞增殖、分化和其它功能的各种不同的生物进程有关。生长/分化因子8 (⑶F-8)，也称为肌肉生长抑制素(myostatin)，是大部分在发育细胞和和成人骨骼肌组织中表达的TGF-β家族成员。肌肉生长抑制素似乎在负控制骨骼肌生长中的起着关键作用(McPherron et al. , Nature (London) 387,83-90 (1997), Zimmers et al. , Science 296 :1486-1488 (2002)) 0拮抗肌肉生长抑制素已被证明增加动物的瘦肌肉质量。蛋白的另一种TGF- β家族成员是一种相关的生长/分化因子，即生长/分化因子 11(⑶F-11)。⑶F-Il与肌肉生长抑制素的氨基酸序列具有约90%的序列同一性。⑶F-Il 在发育动物的轴向模式中发挥作用(Oh et al. ,Genes Dev 11 181246 (1997))，也似乎在骨骼肌发育和生长中发挥作用。激活素A、B和AB分别是两种多肽链的同源二聚体和异源二聚体 (Vale et al. ， Nature 321,776-779(1986)， Ling et al. ， Nature 321,779-782(1986))。 最初发现激活素是在与促卵泡成熟激素刺激性腺合成有关的调控中作为性腺肽，而现在认为其与许多生物活性的调节有关。激活素A是激活素的主要形式。激活素、肌肉生长抑制素、⑶F-Il和TGF-β超家族的其它成员通过激活素II型和激活素IIB型受体的双重作用结合和发送信号，这两者都是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶 (Harrison et al. , J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004)) 交联研究已经确定肌肉生长抑制素能够与激活素II型受体(ActRIIA和ActRIIB)在体外结合(Lee et al.，PNAS USA 98 :9306-11(2001)) ο 还有证据表明，GDF-Il 既与 ActRIIA 结合，又与 ActRIIB 结合(Oh et al.，Genes Dev 16 :2749-54(2002))。已知TGF-β蛋白表达与各种疾病和障碍有关。因此，一些能够拮抗TGF-β蛋白的治疗性分子可同时，特别是对治疗这些疾病和障碍有效。治疗性蛋白的大规模制备，需要在不破坏蛋白完整性的情况下可高效表达和纯化的蛋白。可制备性，可以描述为以充分有效的方式表达和纯化蛋白的能力，以便制备符合效率高成本低的蛋白。在大规模制备中，必须确定每个潜在治疗性蛋白的可制备性。虽然蛋白表达和纯化过程可使蛋白最优化，可制备性似乎也是蛋白固有性质的功能。本发明提供了可制备性改善的具有生物活性的治疗性蛋白，能够有效地拮抗TGF-β蛋白。发明概述本发明提供了包含能够结合激活素、GDF-Il和肌肉生长抑制素并抑制其活性的稳定的人激活素受体IIB(指定svActRIIB)多肽的分离蛋白，其特征在于具有改善的可制备性。稳定的ActRIIB多肽的特征在于相对于SEQ ID NO :2在观位和44位都具有氨基酸置换。在一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述分离蛋白包含具有SEQ ID N0:2所示序列的多肽，其中观位的置换选自W或Y，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸19至134所示的序列，其中观位的置换选自W或Υ，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸23至134所示的序列，其中观位的置换选自W或Y，44 位的置换为Τ。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸25至134所示的序列，其中观位的置换选自W或 Y，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，所述多肽具有与上述任一多肽有至少80%、85%、 90 %、95 %、98 %或99 %同一性的氨基酸序列，其中所述多肽的28位和44位具有单氨基酸置换，其中观位的置换选自W或Υ，44位的置换为Τ，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、 激活素A或⑶F-Il结合。在一个实施例中，上述多肽的观位的置换为W，44位的置换为Τ， 且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在另一个实施例中，所述分离蛋白包含稳定的激活素IIB受体多肽，其中所述多肽具有由SEQ ID N0:4、6、12和14组成的组所示的序列。在另一个实施例中，所述蛋白包含具有与SEQ ID N0:4、6、12或14至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在另一个实施例中，所述蛋白包含具有与SEQ ID N0:4、6、12或14至少90%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或⑶F-Il结合。在另一个实施例中，所述蛋白包含具有与SEQ ID N0:4、6、12或14 至少95%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中，所述观位的置换为 W，44位的置换为T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在又一个实施例中，所述svActRIIB蛋白还包含异源蛋白。在一个实施例中，所述异源蛋白为Fc结构域。在又一个实施例中，所述Fc结构域为人IgG Fc结构域。在又一个实施例中，所述异源蛋白是通过连接子或铰链连接肽结合。在一个实施例中，所述连接子或铰链连接子选自由SEQ ID NO :25、27、38、40、42、44、45、46、48、49和50组成的组所示的氨基酸序列组成的组。在又一个实施例中，SEQ ID NO :27、38、40、42、44、45或46所示的铰链连接子连接人IgG2Fc(SEQ ID NO :22)与svActRIIB多肽。在另一个实施例中，SEQ ID NO: 48、49或50所示的铰链连接子连接人IgG2Fc(SEQ ID NO 23)或修饰IgGlFc (SEQ ID NO: 47)与 svActRIIB 多月太。
在又一个实施例中，所述蛋白包含具有由SEQ ID N0:8、10、16和18组成的组所示的序列的多肽。在另一个实施例中，所述蛋白包含具有与SEQ ID N0:8、10、16或18至少 80%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在另一个实施例中，所述蛋白包含具有与 SEQ ID NO :8、10、16或18至少90%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y， 44位具有T，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在另一个实施例中，所述蛋白包含具有与SEQ ID N0:8、10、16或18至少95%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或⑶F-11结合。在又一个实施例中，上述多肽的观位的置换为W，44位的置换为T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在又一个实施例中，所述蛋白包含上述的多肽，其中64位的氨基酸残基是丙氨酸。在另一方面，本发明提供了一种分离核酸分子，所述核酸分子包含编码稳定的 ActRIIB多肽的多核苷酸。在一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多核苷酸编码SEQ ID NO :2所示的多肽序列，其中观位的置换选自W或Y， 44位的置换为T。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2的氨基酸19至134所示序列的多肽，其中观位的置换选自W或Y，44位的置换为T。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44 位的单氨基酸置换之外，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2的氨基酸23至134所示序列的多肽，其中观位的置换选自W或Y，44位的置换为T。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2的氨基酸 25至134所示序列的多肽，其中观位的置换选自W或Υ，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，所述多核苷酸编码与上述任一多肽具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的28位具有单氨基酸置换，44位具有单氨基酸置换，其中观位的置换选自W或Υ，44位的置换为Τ，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、 激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中，上述多核苷酸编码一种多肽，其中观位的置换为W，44位的置换为Τ，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中，所述核酸分子包含编码具有由SEQ ID NO :4、6、12和14组成的组所示序列的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，所述核酸分子包含编码与SEQ ID NO 4、6、12或14具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的观位具有W或 Y，44位具有T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在另一个实施例中，所述核酸分子包含编码与SEQ ID N0:4、6、12或14具有至少90%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或⑶F-Il结合。在另一个实施例中，所述核酸分子包含编码与SEQ ID NO :4,6,12或14具有至少95%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中，上述多核苷酸编码一种多肽，其中观位的置换为W，44位的置换为T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在另一个实施例中，所述核酸分子包含具有选自由SEQ ID N0:3、5、ll和13或其互补序列组成的组的序列的多核苷酸。在另一个实施例中，所述分离核酸分子包含以上所示的多核苷酸，进一步包含编码至少一种异源蛋白的多核苷酸。在一个实施例中，所述核酸分子包含编码具有由SEQ ID N0:8、10、16和18组成的组所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，所述核酸分子包含编码与SEQ ID NO :8、10、16或18具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸， 其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或⑶F-Il结合。在另一个实施例中，所述核酸分子包含编码与SEQ ID NO :8、10、16或 18具有至少90%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的28位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在另一个实施例中， 所述核酸分子包含编码与SEQ ID N0:8、10、16或18具有至少95%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中，上述多核苷酸编码一种多肽，其中观位的置换为W，44位的置换为T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11结合。 在又一个实施例中，所述核酸分子包含具有选自由SEQ ID N0:7、9、15和17或其互补序列组成的组的序列的多核苷酸。在另一个实施例中，所述核酸分子进一步包含编码由SEQ ID NO :25、27、38、40、 42、44、45、46、48、49和50组成的组所示的连接子和铰链连接子的多核苷酸。在又一个实施例中，所述核酸分子进一步包含一种转录或翻译调控序列。在另一方面，本发明提供了一种包含编码稳定的ActRIIB蛋白或多肽的多核苷酸的重组载体。在另一方面，本发明提供了包含重组载体的宿主细胞，还提供了在促进蛋白或多肽表达条件下通过培养宿主细胞制备稳定的ActRIIB蛋白和多肽的方法。本发明进一步提供了一种含有至少一种稳定的ActRIIB多肽或蛋白的组合物。在一个实施例中，所述组合物是一种含有混合药学上可接受的载体的稳定的ActRIIB多肽或蛋白的药物组合物。在另一方面，本发明提供了一种通过向需要治疗的受试者给予svActRIIB蛋白和多肽或含有这些的药物组合物来降低或阻断肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il的活性的方法。在另一方面，本发明提供了一种通过向需要治疗的受试者给予有效量的含有 svActRIIB蛋白或多肽的组合物或药物组合物来增加瘦肌肉质量或增加瘦肌肉质量与脂肪质量之比的方法。在另一方面，本发明提供了一种通过向受试者给予含有svActRIIB多肽或蛋白的治疗性组合物治疗或预防治疗患有肌肉萎缩疾病(muscle wasting disease)的受试者的方法。所述肌肉萎缩疾病包括，但不限于以下病症癌症恶病质、肌肉萎缩症、肌萎缩侧索硬化、充血性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭、化学恶病质、HIV/AIDS恶病质、肾衰竭、尿毒症、类风湿性关节炎、年龄相关少肌症(age-related sarcopenia)、老年性衰弱、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺(androgen deprivation)及由于长期卧床休养、脊髓损伤、中风、骨折、 烧伤、老化、抗胰岛素性和其它障碍引起的肌肉萎缩。所述肌肉萎缩还可能是由太空飞行失重导致的。在另一方面，本发明提供了一种通过向受试者给予有效量的含有svActRIIB蛋白或多肽的治疗性组合物治疗激活素在需要这种治疗的受试者中过表达的病症的方法。在一个实施例中，所述疾病是癌症。在另一方面，本发明提供一种治疗代谢障碍的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者给予含有svActRIIB蛋白或多肽的治疗性组合物，其中所述代谢障碍选自骨丢失、糖尿病、肥胖症、糖耐量减低、高血糖症和代谢综合症。在另一方面，本发明提供了一种用于治疗肌肉萎缩或代谢或激活素相关病症的基因治疗方法，所述方法包括向需要治疗的受试者给予编码本发明的svActRIIB蛋白或多肽的载体，其中所述载体能够在受试者中表达svActRIIB蛋白或多肽。在另一方面，本发明提供了一种通过在许多实验中使用任何svActRIIB蛋白或多肽作为为捕捉剂或结合剂来检测并量化肌肉生长抑制素、激活素或GDF-Il的方法。附图
简要说明图 1 显示了 SEC 柱上 ActRIIB-Fc (E28W)与 svActRIIB-Fc (E28W, S44T)之间的对比。与显示 3 个峰的 ActRIIB-Fc (E^W)相比，svActRIIB-Fc (E28W，S44T)显示了 1 个单峰。图2显示了相比于施用10mg/kg PBS的10只小鼠，施用单剂量为10mg/kg svActRIIB-Fc (E28W, S44T)的10只C57B1/6小鼠在14日期间体重有所增加。图3 显示了接受单剂量为 0. ;3mg/kg、3mg/kg、10mg/kg 和 30mg/kg 的 svActRIIB-Fc (E28W, S44T)的C57BL/6的瘦体重随时间的剂量相关性变化。发明详述本发明提供了一种包含稳定的人激活素IIB受体(svActRIIB)多肽的分离蛋白。 本发明的蛋白和多肽是以它们与至少三种TGF-β蛋白(肌肉生长抑制素(GDF-8)、激活素 A或⑶F-11)结合的能力为特征，以抑制这些蛋白中至少一种的活性，并比其它ActRIIB可溶性受体具有改善的可制备性。稳定的人激活素IIB受体多肽的特点是SEQ ID N0:2所示的关于ActRIIB胞外域的E^位和S44位的氨基酸置换。在一个实施例中，稳定的人激活素IIB受体多肽进一步可以相对于SEQ ID NO 2在64位具有丙氨酸置换。本文所用的术语“TGF-β家族成员”或“TGF-β蛋白”是指转化生长因子家族的结构相关生长因子，所述转化生长因子家族包括激活素、生长和分化因子(GDF)蛋白 (Kingsley et al. Genes Dev. 8 133-146(1994),McPherron et al·,Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. IB,D. LeRoith禾口C. Bondy. ed. , JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA :pp 357-393)。⑶F-8，也被称为肌肉生长抑制素，是骨骼肌组织的负调控因子(McPherron et al. PNAS USA 94 1M57-1M61 (1997))。生长抑制素是以约为375个氨基酸长、具有人基因库登录号AAB86694(SEQ ID NO 35)的失活蛋白合成的。所述前体蛋白是通过四元加工位点的蛋白酶裂解得到激活，以制备N-末端失活的前域和约109个氨基酸的C-端蛋白，其中所述C-端蛋白二聚化形成约25kDa的同源二聚体。这种同源二聚体是成熟的生物活性蛋白(Zimmers et al.，Science 296,1486 (2002)) 本文所用的术语“前域”或“前肽”是指失活的N-末端蛋白，其裂解以释放活性 C-末端蛋白。本文中所用的术语“肌肉生长抑制素”或“成熟的肌肉生长抑制素”是指成熟的生物活性C-端多肽，以单体、二聚体或其它形式，以及生物活性片段或包括等位基因变异体、剪接变异体、融合肽和多肽的相关多肽形式存在。据报道，成熟的肌肉生长抑制素已在括人、小鼠、鸡、猪、火鸡和大鼠的许多物种间具有100%的序列同一性(Lee et al.，PNAS98,9306(2001)) ο本文所用的⑶F-Il是指具有Swissprot登录号为095390 (SEQ ID NO 36)的 BMP (骨形态发生蛋白)，以及该蛋白的变异体和物种同源。GDF-Il与中轴骨的前/后模式的调节有关(McPherron et al,Nature Genet. 22(93) :260-264(1999) ；Gamer et al,Dev. Biol. 208 (1)，222-232 (1999))，但出生后的功能未知。激活素A是多肽链β A的同源二聚体。本文中所用的术语“激活素Α”是指具有基因库登录号NM_002192 (SEQ ID NO :34)的激活蛋白。激活素A、B和AB分别是两条多肽链 (βΑ和βΒ)的同源二聚体和异源二聚体。本文中所用的“激活素”是指激活素Α、Β和ΑΒ， 以及该蛋白的变异体和物种同源。受体多肽本文所用的术语激活素IIB型受体(ActRIIB)是指具有登录号ΝΡ_001097的人激活素受体或其变异体，如64位使用丙氨酸取代精氨酸的那些受体。术语可溶性ActRIIB (野生型)是指ActRIIB的胞外域，1位至134位的氨基酸(有信号序列)，或SEQ ID NO 2中 19位至134位的氨基酸(无信号序列)。稳定的受体多肽本发明提供了一种分离蛋白，所述分离蛋白包含稳定的ActIIB受体多肽(本文称为“svActRIIB多肽”)。本文所用的术语“svActRIIB蛋白”是指包含稳定的ActRIIB多肽的蛋白。本文所用的术语“分离的”是指从内源性物质纯化到一定程度的蛋白或多肽分子。 这些多肽和蛋白的特点是除了改善可制备性外，具有结合并抑制激活素A、肌肉生长抑制素或⑶F-Il中任何一种的能力。稳定的ActRIIB多肽的特点是SEQ ID NO 2的28位和44位具有氨基酸置换。为了保持一致性，无论多肽是否成熟或截短，稳定的ActRIIB多肽和蛋白的氨基酸位置通常被称为关于SEQ ID NO :2的位置。本文所用的术语“成熟”是指没有信号序列的多肽或肽。 本文所用的术语“截短”是指具有删除N末端或C末端氨基酸的多肽。在一个实施例中，除了 28位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述分离的稳定激活素IIB受体激活多肽(svActRIIB)具有SEQ ID NO :2所示的多肽序列，其中观位的置换选自W或Y，44位的置换为T。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多肽具有SEQ ID NO 2的氨基酸19至134所示的序列，其中观位的置换选自W或Y，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸23至134所示的序列，其中观位的置换选自W或Υ，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多肽具有SEQ ID NO 2的氨基酸25至 Π4所示的序列，其中观位的置换选自W或Υ，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，所述多肽具有与上述任一多肽具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其中所述多肽的28位具有单氨基酸置换，44位具有单氨基酸置换，其中28位的置换选自W或Y，44位的置换为Τ，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或⑶F-Il结合。在一个实施例中，上述多核苷酸编码一种多肽，其中观位的置换为W，44位的置换为Τ， 其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中，所述svActRIIB多肽包括信号序列，例如，SEQ ID NO :4,8,12和16。然而，各种信号肽可用于即时应用的多肽制备中。所述信号肽可以具有SEQ ID NO 4中1至19位氨基酸所示的序列(例如)或SEQ ID NO 31和32所示的信号序列。用于表达svActRIIB多肽的任何其它信号肽可能用到。在其它实施例中，所述信号序列被删除， 留下成熟肽。缺乏信号序列的svActRIIB多肽的实例包括(例如)SEQ ID N0:6、10、14和 18。在一个实施例中，所述蛋白包含稳定的激活素IIB受体多肽，其中所述多肽选自由具有SEQ ID N0:4、6、12和14组成的组所示的序列的多肽组成的组。这些多肽表示SEQ ID NO :2中25位至134位的氨基酸，其中所述多肽的28位具有单氨基酸置换，44位具有单氨基酸置换，其中观位的置换选自W或Y，44位的置换为T，且其中所述多肽能够与含有或不含有不同于SEQ ID NO :2所示的信号序列的肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。 在另一个实施例中，所述蛋白包含与SEQ ID NO :4、6、12或14具有至少80%、85%、90%、 95 %、98 %或99 %序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中二8位的置换为W，44位的置换为T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在又一个实施例中，所述svActRIIB蛋白进一步包含异源蛋白。在一个实施例中， 所述异源蛋白为Fc结构域。在又一个实施例中，所述Fc结构域为人IgG Fc结构域。在一个实施例中，所述蛋白包含具有由SEQ ID N0:8、10、16和18组成的组所示的序列的多肽。 在另一个实施例中，所述蛋白包含与SEQ ID而8、10、16或18具有至少80%、85%、90%、 95^^98%或99%序列同一性的多肽，其中所述多肽的28位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中二8位的置换为W，44位的置换为T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在又一个实施例中，所述蛋白包含上述任何一种多肽，其中64位的氨基酸残基为丙氨酸。在另一个实施例中，术语svActRIIB多肽和蛋白包括包含SEQ ID N0:2、4、6、12和 14片段的蛋白，其中包括N和C末端截断，其中28位为W或Y，44位为T，且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。本文所用的术语svActRIIB多肽的“衍生物”是指至少一种其它化学基团或至少一种其它多肽结合，以形成共价或聚集共轭物，如糖基、脂质、乙酰基，或者C-末端或N-末端融合多肽，PEG分子共轭物，以及以下详细说明的其它修饰物。稳定的ActRIIB受体多肽还可以包括其它修饰物和衍生物，其中包括由于在各种细胞类型(如哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母和其它重组宿主细胞)中表达而加工产生的C和N末端修饰。本发明的svActRI IB蛋白可进一步包含直接或通过连接子序列与svActRI IB多肽结合以形成融合蛋白的异源多肽。本文所用的术语“融合蛋白”是指具有通过重组DNA技术结合的异源多肽的蛋白。异源多肽包括但不限于Fc多肽，其标签和亮氨酸拉链域，以促进寡聚化和使本文所述的稳定的ActRIIB多肽进一步稳定化，例如，WO 00Λ9581，它们的全部内容通过引用并入本文。在一个实施例中，异源多肽是Fc多肽或结构域。在一个实施例中，Fc 结构域选自人 IgGl Fc (SEQ ID NO :23)、修饰的 IgGl Fc (SEQ ID NO :47)、IgG2 Fc (SEQ ID NO :22)和 IgG4 Fc (SEQ ID NO :24)结构域。svActRIIB 蛋白可以进一步包含 IgGl (SEQ ID NO :29)、IgG2(SEQID NO :28)或 IgG4 (SEQ ID NO :30)的铰链序列的全部或部CN 102245634 A
说明书
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分。典型的svActRIIB多肽选自由SEQ ID NO :8、10、16和18所示的序列组成的多肽以及与这些序列具有基本上相似的多肽，其中观位和44位的置换被保留。本文所用的术语“基本上相似”是指与任何SEQ ID N0:8、10、16和18具有至少80%同一性、85%同一性、90% 同一性、95%同一性、96%同一性、97%同一性、98%同一性、99%同一性的序列，其中所述多肽的28位保留了 W或Y，44位保留了 T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A 或⑶F-Il结合。在一个实施例中，观位的置换为W，44位的置换为T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或⑶F-Il结合。svActRIIB多肽可以选择地进一步包含“连接子”序列。连接子主要作为一个多肽和又一个异源多肽之间或其它类型的融合或两种或多种稳定的ActRIIB多肽之间的间隔基团。在一个实施例中，所述连接子是由氨基酸通过肽键连接在一起构成，优选为1至 20个氨基酸通过肽键连接，其中所述氨基酸选自20个天然氨基酸。本领域的普通技术人员认为一个或多个氨基酸可能是糖基化的。在一个实施例中，1至20个氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一个实施例中，连接子是由立体不受阻碍的大多数氨基酸(如甘氨酸和丙氨酸)构成。典型的连接子是聚甘氨酸(特别是(Gly)5、(Gly)8、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸)。以下实例所示的一个典型的合适连接子是(Gly)4Ser (SEQ ID NO :25)。在又一个实施例中，svActRIIB可以包含“铰链连接子”，以 SEQ ID NO :27为例，这是IgG的铰链区或部分铰链区附近提供的连接子序列。铰链序列包括 IgG2Fc(SEQ ID NO :28)、IgGlFc(SEQ ID NO :29)和 IgG4Fc(SEQ ID NO :30)。铰链连接子序列的目的还可能是改善svActRIIB-Fc蛋白的可制备性和稳定性。 在一个实施例中，当与svActRIIB多肽结合时，SEQ ID NO :27、38、40、42、44、45和46的铰链连接子的目的是使用IgG2 Fc (SEQ ID NO :22)改善可制备性。在一个实施例中，当 svActRIIB 多肽与人 IgGl Fc (SEQ ID NO :23)或修饰的人 IgGl Fc (SEQ ID NO 47)结合时， 所述铰链连接子序列的目的是改善可制备性，例如，具有SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :49和 SEQ ID :50的铰链连接子。以下例4描述了这些多肽的改善的可制备性。连接子还可能是非肽类连接子。例如可以使用烷基连接子，如NH-(CH2)S-C(O)-, 其中S = 2-20。这些连接子可能还会被任何非立体位阻基团(如低级烷基(例如C1-C6)低级酰基、卤素(例如氯，溴)CN、NH2、苯基等)取代。就给予所需特性(如减少降解和/或增加半衰期、降低毒性、降低免疫原性和/或增加svActRIIB多肽的生物活性)的目的而言，本文公开的svActRIIB多肽还可以与非多肽分子结合。典型的分子包括但不限于线性高分子，如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、葡聚糖； 脂质；胆固醇基团(如类固醇)；碳水化合物或寡糖分子。与其它ActRIIB可溶性多肽相比，svActRIIB蛋白和多肽具有改善的可制备性。本文所用的术语“可制备性”是指一种特定的蛋白在其重组表达和纯化过程中的稳定性。可制备性被认为是由于该分子在表达和纯化条件下的固有性质。改善的可制备性实例如以下实例所示，包括蛋白(例幻的均勻糖基化、蛋白重组制备过程中细胞滴定度、生长和蛋白表达的提高(例1)、纯化性能的提高(例2)和低pH值下稳定性的提高(例2)。相比于其它可溶性ActRIIB多肽，本发明的svActRIIB蛋白和多肽显示了改善的可制备性，以及体外和体内活性的保留(例2和幻。此外，其它铰链连接子序列可能赋予其它的可制备性收益，如以下例4所示。
本文所用的术语“svActRIIB多肽活性”或“可溶性ActRIIB多肽生物活性”是指一种或多种svActRIIB多肽在体外或体内的活性，包括但不限于以下实例所示的那些活性。svActRIIB多肽的活性包括，但不限于，结合肌肉生长抑制素或激活素A或⑶F-Il活性的能力，以及抑制或消除肌肉生长抑制素或激活素A或GDF-Il活性的能力。本文所用的术语“能够结合”肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il是指通过本领域公知方法测量的结合， 如以下实例所示的KinExA 方法。肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il的体外抑制，可以使用(例如)以下实例所述的pMARE C2C12细胞实验测量。以下例3所示的体内活性，通过在小鼠模型中增加肌肉质量显示。svActRIIB多肽和蛋白的体内活性，包括但不限于增加体重、增加肌肉质量以及增加肌肉质量与脂肪质量之比。治疗活性进一步包括减少或预防某些类型的肿瘤引起的恶病质、防止某些类型的肿瘤生长以及增加某些动物模型的存活率。以下还提供了 svActRIIB蛋白和多肽活性的进一步讨论。在另一方面，本发明提供了包含编码本发明svActRIIB多肽的多核苷酸的分离核酸分子。本文所用的术语“分离的”是指从内源性物质纯化至一定程度的核酸分子。在一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多核苷酸编码具有SEQ ID N0:2所示序列的多肽，其中观位的置换选自从W或Y，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO 2的氨基酸19至134所示的序列的多肽，其中观位的置换选自从W或Y，44位的置换为T。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2的氨基酸23至134所示的序列的多肽，其中观位的置换选自从W或Υ，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2的氨基酸 25至134所示的序列的多肽，其中观位的置换选自W或Υ，44位的置换为Τ。在另一个实施例中，所述多核苷酸编码与上述任一多肽具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99% 同一性的氨基酸序列，其中所述多肽的观位具有单氨基酸置换，44位具有单氨基酸置换， 其中观位的置换选自W或Υ，44位的置换为Τ，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。在一个实施例中，上述实施例的多核苷酸编码一种多肽，其中观位的置换为W，44位的置换为T。在一个实施例中，本发明的分离核酸分子包含编码具有由SEQ ID Ν0:4、6、12和 14组成的组所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，所述核酸包含编码具有与 SEQ ID NO :4、6、12 或 14有至少 80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的28位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能够与激活素Α、 GDF-Il或肌肉生长抑制素结合。在一个实施例中，上述实施例的多核苷酸编码一种多肽，其中观位的置换为W，44位的置换为Τ，其中所述多肽能够与激活素A、GDF-11或肌肉生长抑制素结合。在另一个实施例中，所述分离核酸分子进一步包含编码至少一种异源蛋白的多核苷酸。在一个实施例中，所述异源蛋白为Fc结构域，在又一个实施例中，所述Fc结构域为人IgG Fc结构域。在另一个实施例中，所述核酸分子进一步包含编码SEQ ID NO :25、27、 38、40、42、44、45、46、48、49或50所示的连接子和铰链连接子的多核苷酸。在又一个实施例中，这些多核苷酸具有选自由SEQ ID N0:26、37、39、41和43组成的组的序列。
在一个实施例中，所述核酸分子包含编码由SEQ ID NO :8、10、16和18组成的组所示的序列组成的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，所述核酸包含编码具有与SEQ ID NO :8、10、16或18有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的28位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能够与激活素A、GDF-11 或肌肉生长抑制素结合。在一个实施例中，上述实施例的多核苷酸编码一种多肽，其中观位的置换为W，44位的置换为T，其中所述多肽能够与激活素A、GDF-Il或肌肉生长抑制素
纟口口。在一个实施例中，所述分离核酸分子包含具有选自由SEQ ID NO :3、5、11或13或者其互补序列组成的组的序列的多核苷酸。在另一个实施例中，所述分离核酸分子包含具有选自由SEQ ID NO :7、9、11或13或者其互补序列组成的组的序列的多核苷酸。在又一个实施例中，所述分离核酸分子在严格或适度条件下与SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13、15或17 杂交，其中所述编码的多肽与SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14、16或18基本上相似，其中所述多肽包含28位具有W或Y和44位具有T的氨基酸序列，其中所述编码的多肽能够与激活素A、⑶F-Il或肌肉生长抑制素结合。本发明的核酸分子包括DNA单链和DNA双链形式两种，以及其RNA互补序列。DNA 包括(例如)cDNA、基因组DNA、合成DNA、PCR扩增的DNA及其组合。基因组DNA可通过常规技术得到分离，如采用SEQ ID N0:3、5、ll或13的DNA，或其合适的片段作为探针。编码 ActRIIB多肽的基因组DNA来自对许多物种有用的基因库。合成DNA是从重叠寡核苷酸片段的化学合成中得到，随后组装片段，以重新构建编码区和侧翼序列的部分或全部。RNA可来自mRNA直接高水平合成的原核表达载体，如采用T7启动子和RNA聚合酶的载体。cDNA 来自表达ActRIIB的各种组织分离的mRNA制得的库。本发明的DNA分子包括全长基因以及多核苷酸和其片段。全长基因编码序列还可包括编码N末端信号序列的序列。本发明还提供了上述的核酸分子，其中所述多核苷酸与转录或翻译调控序列可操作地连接。典型的多核苷酸和多肽序列svActRIIB (E28W, S44T)，含有信号序列atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtgg tgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcagga caagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctag atgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgag ggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgac agcccccacc(SEQ ID NO 3)svActRIIB(E28ff, S44T)，含有信号序列mefglswvfIvallrgvqcetrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvk kgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt(SEQ ID NO :4)svActRIIB (E28W, S44T)，不含有信号序列gagacacggtggtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggag cgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgt gaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtc acgtacgagccacccccgacagcccccacc(SEQ ID NO 5)svActRIIB(E28W, S44T)，不含有信号序列etrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtieIvkkgcwlddfncydrqecvat eenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt(SEQ ID NO 6)svActRIIB-Fc (E28W, S44T)，含有信号序列的多核苷酸序列atggagtttgggctgagetgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtg gtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcag gacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctgg ctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgc tgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagcca cccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccg tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtg gtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag acaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactgg ctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaa accaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggag aacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggac aagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag aagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO :7)svActRIIB-Fc (E28W, S44T)，含有信号序列的多核苷酸序列mefglswvfIvallrgvqcetrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvk kgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappva gpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdw lngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenn ykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsispgk(SEQ ID NO :8)svActRIIB-Fc (E28W, S44T)，不含有信号序列的多核苷酸序列gagacacggtggtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggag cgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgt gaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccagg tgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtc acgtacgagccacccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgt ggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgt gcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat gccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccagga ctggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca aaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaaga gcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc ctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO 9)svActRIIB-Fc (E28W, S44T)，不含有信号序列的多核苷酸序列etrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtieIvkkgcwlddfncydrqecvat eenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappvagpsvfIfppkpkdtlmisr tpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapi ektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO :10)svActRIIB(E28Y, S44T)，含有信号序列atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtac tgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcagga caagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctag atgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgag ggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgac agcccccacc(SEQ ID NO :11)svActRIIB(E28Y, S44T)，含有信号序列mefglswvflvallrgvqcetryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvk kgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt(SEQ ID NO :12)svActRIIB(E28Y, S44T)，不含有信号序列gagacacggtactgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggag cgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgt gaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccagg tgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtc acgtacgagccacccccgacagcccccacc(SEQ ID NO :13)svActRIIB(E28Y, S44T)，不含有信号序列etryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvat eenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt (SEQ ID NO 14)svActRIIB-Fc (E28Y, S44T)，含有信号序列的多核苷酸序列atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggta ctgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcag gacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctgg ctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgc tgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagcca cccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccg tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtg gtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag acaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactgg ctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaa
16accaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggag aacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggac aagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag aagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO 15)svActRIIB-Fc (E28Y, S44T)，含有信号序列的多核苷酸序列mefglswvfIvallrgvqcetryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvk kgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappva gpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdw lngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenn ykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsispgk(SEQ ID NO :16)svActRIIB-Fc (E28Y, S44T)，不含有信号序列的多核苷酸序列gagacacggtactgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggag cgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgt gaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccagg tgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtc acgtacgagccacccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgt ggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgt gcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat gccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccagga ctggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca aaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaa caactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaaga gcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc ctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO :17)svActRIIB-Fc (E28Y, S44T)，不含有信号序列的多核苷酸序列etryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtieIvkkgcwlddfncydrqecvat eenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappvagpsvfIfppkpkdtlmisr tpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapi ektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO :18)在本发明的另一方面，提供了含有本发明的核酸分子和多核苷酸的表达载体，还提供了使用这种载体转化宿主细胞以及制备SVActRIIB多肽的方法。术语“表达载体”是指得自多核苷酸序列表达多肽的质粒、噬菌体、病毒或载体。svActRIIB多肽表达的载体含有克隆插入表达载体增殖所需的最小量序列。表达载体包含转录单位，所述转录单位包含 (1)在基因表达中具有调控作用的遗传因子或因子的组装，例如，启动子或增强子( 编码 svActRIIB多肽的序列和被转录为mRNA并被翻译成蛋白的蛋白，以及(3)适当的转录起始和终止序列。这些序列可进一步包括选择标记。适合于在宿主细胞中表达的载体是现成的，采用标准的重组DNA技术将核酸分子插入到载体中。这些载体可以包括特定的组织中发挥功能的启动子，以及用于人或动物靶向细胞中svActRIIB多肽表达的病毒载体。适合于svActRIIB表达的典型表达载体是含有svActRIIB多核苷酸的pDSRa (如WO 90/14363所述，通过引用并入全文中)及其衍生物，以及以下所述本领域公知的任何其它合适的载体。本发明还提供了制备svActRIIB多肽的方法。其它各种表达/宿主系统可加以利用。这些系统包括但不限于微生物，如重组噬菌体转化的细菌，质粒或粘粒DNA表达载体； 酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)转染或细菌表达载体(例如，Ti 或PBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。用于重组蛋白制备的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或其衍生物，如生长于无血清培养基的 Veggie CHO 和相关细胞系(见 Rasmussen et al. , 1998, Cytotechnology 28 31)或缺乏DHFR COS细胞(如猴肾细胞的C0S-7细胞系(ATCC CRL 1651)(见Gluzman et al.，1981，Cell23 :175)，W138、BHK、H印G2、3T3(ATCC CCL 163)、RIN、MDCK、A549、PC12、 K562、L细胞、C127细胞、BHK (ATCC CRL 10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CVl的CVl/ EBNA 细胞系(ATCC CCL 70)(见 McMahan et al.，1991，EMBO J. 10 J821)，人胚胎肾细胞， 如^3J93EBNA或MSR四3、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其它转化灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、来自体外组织培养的细胞株、主要移植组织、HL-60、U937、HaK或淋巴细胞)的 CHO 细胞系 DX-Bll (见 Urlaub et al. , 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20)。哺乳动物表达允许可从生长培养基中回收的分泌或可溶性多肽的制备。采用适当的宿主载体系统，svActRIIB多肽是通过在允许制备的条件下培养含有本发明核酸分子的表达载体转染的宿主细胞进行制备。转化细胞可以用于长期、高收益的多肽制备。一旦这些细胞被含有选择标记以及所需表达试剂盒的载体转染，(例如)在它们被切换到选择性培养基之前，细胞可以被允许生长于富集培养基中。选择标记的目的是允许成功地表达介入序列的细胞的生长和回收。可以采用适合于所用细胞系的组织培养技术使稳定转化细胞的抗团块增殖。重组蛋白表达的概述在Methods of Enzymology, v. 185, Goeddel 1，D. V.，ed.，Academic Press (1990)中找到。在某些情况下，如利用原核系统表达，本发明所表达的多肽可能需要“重折叠”，并氧化为合适的三级结构和产生二硫键，以具有生物活性。重折叠可以通过使用本领域众所周知的一些操作实现。这些方法包括，例如，使溶解的多肽在离液剂存在下接触通常高于7 的PH值。该离液剂的选择类似于包涵体增溶所使用的选择，但离液剂通常是在低浓度下使用。典型的离液剂是胍和尿素。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还将含有还原剂附加其特定比例的氧化形式，以允许半胱氨酸桥形成出现的二硫键滑移的特定氧化还原电位的产生。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/ 二硫基GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/ 二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME) / 二硫代-bME。在许多情况下，共溶剂可用于提高重折叠率。常用的夹带剂包括丙三醇、不同分子量的聚乙二醇和精氨酸。此外，所述多肽可以根据常规技术在溶液中或载体上合成。各种自动合成器是市售的，而且可以根据已知的议定使用。见，例如，Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Ed. , Pierce Chemical Co. (1984) ；Tam et al. , J Am Chem Soc, 105 6442，(1983) ；Merrifield, Science 232:341-347(1986) ；Barany and Merrifield, ThePeptides,Gross and Meienhofer,eds,Academic Press,New York, 1-284 ；Barany et al., Int J Pep Protein Res，30 :705-739 (1987)。本发明的多肽和蛋白可以根据本领域普通技术人员众所周知的蛋白纯化技术进行纯化。这些技术包括，在一个层面上，对蛋白和非蛋白片段的粗分馏。从其它蛋白已分离的肽或多肽，目标肽或多肽可使用气相色谱和电泳技术进一步纯化，以实现部分或完全纯化(或纯化至同质)。本文所用的术语“分离多肽”或“纯化多肽”，是指从其它成分分离的组合物，其中所述多肽被纯化至相对于其天然获得状态的任何程度。因此，纯化多肽还指一种不在其天然存在环境的多肽。一般而言，“纯化”是指经分馏法已除去其它不同成分的多肽组合物，而且所述组合物保留其表达的生物活性。其中所用的术语“基本上纯化”是指多肽或肽形成所述组合物的主要成分(例如)占所述组合物中蛋白的约50%、约60%、约 70 %、约80 %、约85 %或约90 %或以上的肽或多肽组合物。适用于纯化的不同技术对本领域普通技术人员而言是公知的。这些技术包括，例如，使用硫酸铵、PEG、抗体(免疫沉淀反应)等进行沉淀或通过加热变性，接着通过离心；色谱分析，如亲和层析(蛋白-A柱)、离子交换、凝胶过滤、反相色谱法、羟基磷灰石、疏水层析、等电聚焦、凝胶电泳以及这些技术的组合。本领域众所周知，据认为，进行不同纯化步骤的顺序可变化的，或者某些步骤可省略，但还是产生一种制备基本纯化多肽的合适方法。以下实例提供了典型的纯化步骤。根据本发明，用于定量多肽纯化纯度的各种方法将是本领域普通技术人员的公知的。这些方法包括，例如，测定活性成分的特异性结合活性，或通过SDS/PAGE分析评价成分内肽或多肽的量。一种评价多肽成分纯度的优选方法是计算所述成分的结合活性，比较最初提取的结合活性，从而计算纯度，通过“折叠纯化数”在此进行评价。用于表示结合活性量的实际单位将(当然)取决于纯化以及多肽或肽是否表现出可检测的结合活性后所选的特定检测技术。稳定的激活素IIB型多肽与使肌肉降解级联活化的配体结合。svActRIIB多肽能够结合配体激活素A、肌肉生长抑制素和/或GDF-11并抑制其活性，而且具有治疗涉及肌肉萎缩的疾病以及某些癌症和其它疾病的能力。以下实例显示了具有本文所述的氨基酸置换的svActRIIB多肽和蛋白的改善性能，而保留了在体外检测中结合和消除肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il的能力，以及保留了体内活性。相比于其它可溶性受体，这些性能导致蛋白和多肽具有改善的可制备性。抗体本发明进一步包括与稳定的ActRIIB多肽结合的抗体，其中包括特异性结合本发明svActRIIB多肽的那些抗体。本文所用的术语“特异性结合”是指抗体对svActRIIB 多肽结合亲和力(Ka)具有IO6M-1或以上。本文所用的术语“抗体”，是指完整的抗体，其中包括多克隆抗体(见例如，Antibodies :A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988))和单克隆抗体(见例如，美国专利 No. RE 32,011， 4，902，614，4，543，439 和 4，411，993 以及单克隆抗体A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett,McKearn and Bechtol (eds. ) (1980))。本文所用的术语 “抗体”也指抗体片段，如F(ab)、F(ab，)、F(ab，)2、Fv、Fc和通过重组DNA技术或通过酶或完整抗体的化学裂解产生的单链抗体。术语“抗体”也指双特异性或双功能性抗体，其是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过包括杂交瘤细胞融合或Fab'片段连接的各种方法进行制备(见Songsivilai et al, Clin. Exp. Immunol. 79 :315-321 (1990)，Kostelny et al.，J. Immunol. 148 1547-1553(1992))。本文所用的术语“抗体”也指嵌合抗体，S卩，具有人恒定抗体免疫球蛋白结构域共轭到一种或多种非人类可变抗体免疫球蛋白结构域的抗体，或其片段(见，例如，第 55/95898号美国专利和第56/93493号美国专利)。抗体也指“人性化”抗体(见，例如，美国专利第48/16567号和WO 94/10332)、微型抗体(W0 94/09817)、巨型抗体以及通过转基因动物制备的抗体，其中转基因动物含有一部分人类抗体产生基因，但缺乏能够制备人类抗体的内源性抗体(见例如，Mendez et al. ,Nature Genetics 15:146-156(1997)和美国专利No. 6，300, 129)。术语“抗体”还包括多聚抗体或蛋白的较高级复合物，如异质二聚抗体、抗独特型抗体。“抗体”还包括抗独特型抗体。可以使用针对ActRIIB多肽的抗体(例如)体外和体内鉴定和定量svActRIIB。还包括来自任何哺乳动物的多克隆抗体，例如，与本文所述的svActRIIB多肽特异性结合的小鼠和大鼠抗体，以及兔抗体。发现这些抗体作为研究工具和用于检测和分析本文所公开的多肽的定量分析。这些抗体是采用上述以及本领域公知的方法制得。药物组合物还提供了含有本发明的svActRIIB蛋白和多肽的药物组合物。这些组合物包含治疗上或预防上有效量的多肽或蛋白与药学上可接受的材料，以及生理上可接受的配方材料形成的混合物。所述药物组合物可包含用于改变、保持或保存(例如，组合物的PH值、渗透压、粘度、清晰度、颜色、等渗性、气味、无菌、稳定性、溶解率或释放率、吸附或渗透)的配方材料。合适的配方材料包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、 碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其它有机酸类)；填充剂(如甘露醇或甘氨酸)，螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精)；填充料；单糖；双糖和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物 (如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；盐形式抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如ρluronics、PEG、山梨醇酯，聚山梨酯，如聚山梨酯20、聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal)；稳定性增强剂(蔗糖或山梨醇)；弹性增强剂(如碱金属卤化物(优选为氯化钠或氯化钾，甘露醇山梨醇))；递送载体；稀释剂；辅料和/或药物佐剂(Remington’ s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，A. R. Gennaro, ed.，Mack Publishing Company，1990)。最佳的药物组合物将由本领域的普通技术人员确定，取决于(例如)给药的预定路径、传送形式以及所需的剂量。见，例如，Remington’ s Pharmaceutical Sciences，上文。 这些组合物可影响物理形态、稳定性、体内释放率以及体内多肽清除率。例如，合适的组合物可以是非消化道给药的注射水、生理盐溶液。
药物组合物中的主要载体或载体人可能实际是含水或无水的。例如，合适的载体或载体可能是注射液、生理盐溶液或人工脑脊液中的水，可能补充有非肠道给药的组合物中的其它常见材料。中性缓冲生理盐水或生理盐水与血清白蛋白形成的混合物还是典型的载体。其它典型的药物组合物包含Tris缓冲剂或醋酸缓冲剂，其可能进一步包括山梨醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施例中，组合物可通过混合具有所需纯度的选定组合物与以冻干块状或水溶液形式存在的可选的制剂(Remington，s Pharmaceutical kiences，上文)为储存作好准备。此外，治疗组合物可使用适当的赋形剂(如蔗糖)配制为冷冻干产物。所述配方可以通过多种方法传送，例如，通过吸入疗法、口服或注射。当考虑非肠道给药时，用于本发明的治疗组合物，可能是在包含药学上可接受的载体中所需多肽的无热原质、非肠道可接受的水溶液中。一种特别合适的非肠道注射载体是无菌蒸馏水，其中多肽制成适当保存的无菌等渗溶液。又一种制剂可以涉及所需分子与试剂(如可注射微球、 生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、小球或脂质体)的配方，所述试剂然后提供可通过积存注射传送的产物的控释或缓释。还可使用透明质酸分子，这可能具有增加血液循环持续时间的效果。介入所需分子引入的其它合适方法包括植入式给药装置。在另一方面，适合于注射给药的药物配方可在水溶液中制成，优选为在生理兼容性缓冲剂中，如汉克斯液、林格氏液或生理缓冲盐水。水相注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡萄聚糖。此外，活性化合物的悬浮液，可制成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、三酸甘油脂或脂质体。非脂质阳离子型氨基聚合物还可用于传送。或者，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，并允许高浓缩液的制备。在另一个实施例中，药物组合物可制成吸入试剂。吸入试剂溶液还可使用气溶胶传送的推进剂制成。在再一个实施例中，溶液可能是雾化的。肺部给药还在PCT专利申请NO.PCT/US94/001875中有所描述，其描述了化学修饰蛋白的肺部给药。还需考虑的是，某些配方可能是口服给药。在本发明的一个实施例中，以这种方式给药的分子可以制成含有或不含有通常用于固体剂型(如片剂和胶囊剂)的配料的那些载体。例如，胶囊剂的可能被设计为当生物利用度最大化和预系统退化减至最低时在接近胃肠道内的活动部分释放。其它试剂可以包括在内是为了促进治疗性分子的吸收。还可使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑油、悬浮剂、药片崩解剂和粘合剂。口服药物组合物还可使用本领域众所周知的药学上可接受的载体制成适合于口服的剂量。这些载体使药物组合物被制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、料浆和悬浮液等，以供病人服用。口服药物制剂可通过活性化合物与固体赋形剂结合以及加工颗粒剂(可选地，在研磨后)的所得混合物，以获得药片或糖衣丸核心。可以添加合适的助剂，如果需要的话。 合适的赋形剂包括碳水化合物或蛋白填充料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄芪胶；和蛋白，如明胶和胶原蛋白。如果需要，可添加崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，如海藻酸钠。核心可配合合适的包衣材料使用，如浓缩糖溶液，其还可含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向产品鉴定或表征活性化合物量(即，剂量)的药片或糖衣丸包衣中加入染料或颜料。 可以口服的药物制剂还包括明胶制成的压接式胶囊，以及明胶和包衣制成的软密封胶囊，如丙三醇或山梨醇。压接式胶囊可以含有活性成分与填充料或粘合剂(如乳糖或淀粉、润滑剂，如滑石粉或或硬脂酸镁)的混合物，以及可选的稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于合适的液体中，如脂肪油、液体或含有或不含有稳定剂的液体聚乙二包括涉及缓释或控释传送配方中多肽的配方的其它的药物组合物对本领域的普通技术人员而言将是将是显而易见的。制成其它缓释或控释传送工具的技术，如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔小球和药性持久注射，也是本领域的普通技术人员公知的。见，例如，PCT/US93/00^9描述了传送药物组合物的多孔聚合物微粒的控释。缓释制剂的其它实例包括特型制品形式的半透型聚合物，例如膜、微胶囊。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(U. S. 3，773，919，EP 58，481)，L-谷氨酸和γ乙基_L_谷氨酸的共聚物(Sidman et al. , Biopolymers, 22 :547-556 (1983), M (2_ 羟乙基-丙烯酸甲酯) (Langer et al. , J. Biomed. Mater. Res. ,15 167-277, (1981) ；Langer et al. , Chem. Tech. , 12 :98-105 (198 )，乙烯醋酸乙烯酯(Langer et al.，上文)或聚-D (-)-3-羟丁酸 (EP 133，988)。缓释组合物还包括脂质体，可以通过本领域公知的几种方法制得。见，例如 Eppstein et al.，PNAS(USA)，82 :3688(1985) ；EP 36, 676 ；EP 88, 046 ；EP 143,949。用于体内局部给药的药物组合物通常必须是无菌的。这可能是通过无菌过滤膜的过滤实现的。其中所述组合物是冻干的，采用这种方法的杀菌可以在冷冻干燥和重建之前或之后进行。用于非肠道给药的组合物可能以冻干形式或溶液形式储存。此外，非肠道组合物通通常置于有无菌接入端口的容器中，例如，具有通过皮下注射针头刺破的输液袋或塞小瓶。一旦药物组合物已制成，可能以溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或无水或冻干粉末形式储存于无菌小管中。这些配方可能以随时可用形式或以在给药前需要重建的形式(例如，冻干的)储存。在一个特定实施例中，本发明涉及到制备单剂量给药单位的试剂盒。所述试剂盒各自可含有具有干燥蛋白的第一容器和具有水相配方的第二容器。本发明的范围还包括含有单或多腔预填充注射器的试剂盒(例如，液体注射器和冻干注射器)。治疗所用的药物组合物的有效量将取决于(例如)治疗范围和目标。因此，本领域的普通技术人员将会领会治疗的适当剂量水平是变化的，部分取决于传送的分子、所使用多肽的显示、给药路径、患者的大小(体重、体表面积或器官大小)和情况(年龄和基本健康)。因此，临床医生可修改滴度剂量和给药途径，以获得最佳的治疗效果。一个典型的剂量范围为约0. lmg/kg至约100mg/kg或以上，这取决于上述的因素。多肽组合物可优选为静脉注射或给药。长效药物组合物可能是每3至4天、每周或每两周给药，这取决于特定配方的半衰期和清除率。剂量的频率将取决于所用配方中多肽的药代动力学参数。通常情况下，使用组合物进行给药直至达到实现所需效果的剂量。因此，所述组合物可作为一定时期内的单剂量或多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)，或作为连续灌注进行给药。适当剂量的进一步提纯是经常进行的。适当剂量可通过使用剂量效应数据得到确定。所述药物组合物的给药路径对应于已知的方法，例如，通过静脉内、腹腔内、脑内 (脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内路径、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下或腹腔注射；以及鼻腔、肠道、外用、舌下、尿道、阴道或直肠的方法，通过持续释放系统或植入装置。其中需要的是，所述组合物可通过弹丸注射、连续不断地灌注或植入装置进行给药。二者择一地或另外地，所述组合物可通过膜、海绵或其它适当的材料植入已吸附或装入的所需分子上进行给药。其中使用了植入装置，所述装置可植入任何合适的组织或器官，所需分子可通过扩散、定时释放药丸或连续不断地给药进行传送。在一些情况下，本发明的svActRIIB多肽可以使用本文所述的方法植入某些基因工程细胞传送，以表达和分泌多肽。这些细胞可能是动物或人类细胞，而且可能是自体同源，异源或异种的。或者，所述细胞可能是永生化的。为了降低免疫反应的可能性，可封装所述细胞以避免周围组织的浸润。封装材料通常是生物可相容性的半透型聚合物外壳或膜，以允许多肽产物释放，但防止患者免疫系统或其它周围组织的其它不利因素对细胞的破坏。svActRIIB基因治疗也是预想的，其中编码svActRIIB或svActRIIB衍生物的核酸分子被直接介入受试者。例如，编码svActRIIB的核酸序列通过含有或不含有适当的传送载体(如腺相关病毒载体)的核酸构建的局部注射被介入靶细胞。替代的病毒载体包括、 但不限于，逆转录酶病毒、腺病毒、单纯性疱疹病毒和乳头状瘤病毒载体。病毒载体的物理转移可通过所需核酸分子构建或含有所需核酸分子序列的适当传送载体的局部注射、脂质体介导转移、直接喷射(裸DNA)或微粒轰击(基因枪)在体内实现。本发明的组合物可单独或与其它治疗剂组合使用，以提高其治疗效果或降低潜在的副作用。svActRIIB组合物的用途本发明提供了降低或压制肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il在体内和体外的量或活性的方法和药物组合物。svActRIIB多肽对肌肉生长抑制素、激活素A或⑶F-Il具有高亲和力，并且能够降低和抑制和抑制肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il中至少一种的生物活性。一方面，本发明提供了通过向需要治疗的受试者给予有效剂量的svActRIIB组合物治疗所述受试者的肌肉生长抑制素相关和/或激活素A相关障碍的方法和试剂。本文所用的术语“受试者”是指任何包括动物，如包括人类的哺乳动物。本发明的组合物对增加受试者的瘦肌肉质量有用。所述组合物还可对增加受试者的瘦肌肉质量与脂肪质量之比有用，从而降低受试者体重的脂肪质量百分比。实施例3表明，本发明的svActRIIB多肽和蛋白可以增加动物的肌瘦肉质量。可以通过svActRIIB组合物治疗的障碍包括但不限于各种形式的肌肉萎缩，以及代谢障碍，如糖尿病及相关障碍，和骨质退化病如骨质疏松症。肌肉萎缩症还包括营养障碍，如杜兴肌营养不良、进行性肌营养不良、贝克型肌营养不良、代-兰二氏肌营养不良、欧勃肌营养不良和幼儿神经轴索性营养不良。其它肌肉萎缩症是由慢性疾病或障碍引起的，如肌萎缩性脊髓侧索硬化、充血性阻塞性肺疾病、癌症、 AIDS、肾衰竭、器官萎缩、雄激素剥夺和类风湿性关节炎。
肌肉生长抑制素和/或激活素的过度表达可能有助于恶病质(一种严重的肌肉萎缩综合症)。恶病质起因于癌症，还由于类风湿性关节炎、糖尿病肾病、肾衰竭、化学疗法、烧伤以及其它原因而产生。在另一个实例中，肌肉生长抑制素免疫蛋白的血清和肌肉注射浓度被认为在显示AIDS相关肌肉萎缩的男性中增加，并与不含脂肪质量呈负相关(Gonzalez-Cadavid et al.，PNAS USA 95:14938-14943(1998))。肌肉生长抑制素水平也已经被证明在烧伤后增加，造成肌肉异化作用(Lang et al, FASEB J 15， 1807-1809(2001))。其它病症导致的肌肉萎缩可能由于残疾(如轮椅限制，因中风、疾病、 脊髓损伤、骨折或外伤导致的长期卧床休养，以及微重力环境下(太空飞行)的肌肉萎缩)造成的静止产生。例如，血浆肌肉生长抑制素免疫蛋白被发现在长期卧床休养后增加(Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2) :11(1999)。还发现，在航天飞机飞行过程中大鼠肌肉暴露于微重力环境下与未暴露的大鼠肌肉相比表达的肌肉生长抑制素量增加 (Lalani et al. , J. Endocrin 167(3) :417-28 U000))。此外，脂肪与肌肉之比的年龄相关性增加，以及年龄相关性肌肉萎缩似乎与肌肉生长抑制素有关。例如，平均血清肌肉生长抑制素免疫蛋白在年青组(19-35岁)、中年组 (36-75岁)和老年组(76-92岁)的男性和女性中随年龄的增加而增加，而平均肌肉质量和不含脂肪质量，在这些组中随年龄的增加而下降(Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5) 343-8(2002))。此外，现在肌肉生长抑制素现已被发现在心肌中表达水平低，且表达在梗塞后的心肌细胞中上调(Sharma et al.，J Cell Physiol. 180(1) :1-9(1999)) 因此，降低心肌中的肌肉生长抑制素水平可改善梗塞后心肌的恢复。肌肉生长抑制素似乎还影响着代谢障碍，其中包括2型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、高血糖症和肥胖症。例如，缺乏肌肉生长抑制素被证明能改善两种小鼠模型的肥胖和糖尿病表型(Yen et al. FASEB J. 8 :479 (1994)。本发明的svActRIIB多肽适合于治疗这些代谢障碍。因此，本发明组合物的施用将改善合适受试者中的糖尿病、肥胖症和高血糖病症。此外，含有svActRIIB多肽的组合物可降低肥胖受试者的食物摄入量。本发明稳定的ActRIIB多肽的施用可提高骨骼强度，并降低骨质疏松症和其它退化性骨疾病。据发现，例如，肌肉生长抑制素缺陷型小鼠显示了其肱骨的矿物含量和密度的增加，小梁及皮质骨与肌肉结合的区域的矿物含量的增加，以及肌肉质量的增加(Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1) :63-8 Q002))。此外，本发明的 svActRIIB 组合物可以用于治疗雄激素剥夺，例如，在雄激素剥夺情况下用于治疗前列腺癌。本发明还提供了通过向所述动物施用效剂量的svActRIIB蛋白增加食用动物中肌肉质量的方法和组合物。由于成熟的C-末端肌肉生长抑制素多肽与所有测试的物种类似或相同，预计svActRIIB多肽将有效增加肌肉质量，并降低任何重要农业物种(包括牛、 鸡、火鸡和猪)的脂肪。本发明的svActRIIB多肽和组合物还拮抗激活素A的活性，如以下的体外检测所示。已知激活素A通过某些类型的癌症表达，特别是性腺肿瘤，如卵巢癌，导致严重恶病质。(Ciprano et al. Endocrinol 141 (7) :2319-27 (2000), Shou et al. , Endocrinol 138(11) :5000-5(1997) ；Coerver et al, Mol Endocrinol 10(5) :534-43(1996) ；Ito et al.British J Cancer 82(8) 1415-20 (2000), Lambert-Messerlian, et al, Gynecologic Oncology 74:93-7(1999)。因此，本发明的组合物可用于治疗与激活素A过表达以及肌肉生长抑制素表达相关的病症，如某些癌症导致的恶病质和某些性腺型肿瘤的治疗。此外，本发明的svActRIIB多肽对检测和定量许多实验中的肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il非常有用。一般而言，本发明的稳定的ActRIIB可用作结合和固定许多实验中肌肉生长抑制素、激活素A或⑶F-Il的捕捉剂，类似于(例如)ASai，ed. ,Methods in Cell Biology,37,Antibodies in Cell Biology,Academic Press, Inc. , New York(1993) 所述。多肽可能以某种方式标记或可能与第三分子(如标记的抗体)发生反应，使得肌肉生长抑制素被检测和定量。例如，多肽或第三分子可以使用检测基团(如生物素)修饰，然后可以通过第四分子(如酶标记的抗生蛋白链菌素或其它蛋白)结合(AkerstronuJ Immunol 135 :2589(1985) ；Chaubert, Mod Pathol 10:585(1997))。本发明已被描述，以下实例是通过说明方式，而不是限制方式提供。实施例1svActRIIB多肽的表达和纯化以下方法是用于表达和纯化稳定的ActRIIB多肽。人类激活素IIB型受体是从人类睾丸源(Clontech，Inc.)的cDNA库中分离得到， 并如第11/590962号美国专利申请和第2007/0117130号美国专利申请公布所述进行了克隆，此处通过引用并入本文。以下方法被用来制备svActRIIB-Fc (E28W, S44T)多肽(SEQ ID NO 10)和 ActRIIB-Fc (E28W) (SEQ ID NO :21)。编码 svActRIIB (E^W，S44T) (SEQ ID NO:5)的多核苷酸或编码ActRIIB (E28W) (SEQ ID NO 19)的多核苷酸通过编码铰链连接序列(SEQ ID NO 26)的多核苷酸采用含有突变导致观位E至W和44位S至T的氨基酸置换引物的 PCR重叠延伸融合到编码人类IgG2Fc(SEQ ID NO :22)的核苷酸上。完整的多核苷酸序列是svActRIIB-IgG Fc 的 SEQ ID NO 9 (E28W,S44T)和 ActRIIB-ActRIIB-IgG Fc 的 SEQ ID NO :20 (E^W)。将双链 DNA 片段亚克隆到载体 pTT5 (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada(NRCC),6100 Avenue Royalmount,Montreal(Quebec) Canada H4P 2R2)，W0/9014363 中所述的 pDSRa )和 / 或 pDSRa 衍生物。稳定的ActRIIB-Fc多肽进行了瞬时表达如下。svActRIIB-IgG Fc(E28W, S44T) (SEQ ID NO 10)和 ActRIIB-IgG Fc(E28W)(SEQ ID NO 21)多肽在保持于 FreeStyle 培养基(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)并补充有 250 μ g/ml 遗传霉素(Invitrogen)和 0. Pluronic F68 (Invitrogen)的无血清 IcSiSlS 293-6E MM (National Research Council of Canada, Ottawa, Canada) ψ ^Τ 了瞬时表达。对IL培养物进行了转染。简单地说，细胞接种量在费氏摇瓶(Corning，Inc.) 中增长到1. IXlO6细胞/ml。将摇瓶培养物保持在一个置于保持37°C、5% 二氧化碳、转速为 65rpm 的培养箱的 Innova 2150 摇床平台上(News Brunswick Scientif ic，Edison，NJ)。 在转染时，将细胞稀释至1.0X 106细胞/ml。转染复合物形成于100ml FreeStyle 四3介质中Qnvitrogen)。先将Img 质粒DNA加入培养基中，随后加入3ml FuGene HD转染试剂(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)。转染复合物在室温下共培养约15分钟，然后加入摇瓶的细胞中。在转染后 24 小时，将 20% (w/v)的蛋白胨 Tm (OrganoiTechnie S. A. , TeknieScience, QC, Canada)加入，以达到0.5% (w/v)的终浓度。转染/表达进行了 4_7天，之后通过在4000rpm、4°C下离心60分钟收获条件培养基。稳定的转染和表达进行如下。采用标准电穿孔操作，svActRIIB-IgG-Fc细胞系通过含有编码 svActRIIB-IgG Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO 9)或 ActRIIB-IgG Fc (E28W) (SEQ ID NO 20)的多核苷酸的表达质粒转染稳定的CHO宿主细胞而产生。在表达质粒转染宿主细胞系后，细胞在不含GHT的无血清选择培养基中生长2-3周，以允许质粒的选择和细胞的回收。选择细胞，直到它们达到85%以上的存活率。然后，对这种转染细胞池在含有150nM 甲氨蝶呤的介质中进行培养。在为期六天的表达检测中，svActRI IB-Fc (E28W, S44T)表达细胞池相比于 ActRIIB-Fc (E28W)表达细胞池显示出较高的细胞滴定度、生长性能和所制备蛋白的改善特异性制备率(皮克/细胞/天)。例如，相比于ActRIIB-Fc (E28W)的0. 9g/l，选择池制备约 1.2g/l svActRIIB-Fc(E28W, S44T)。使用典型的补料分批工艺将svActRI IB-Fc (E28W, S44T)和 ActRI IB-Fc (E28W)表达细胞系都按比例放大。将细胞接种到Wave生物反应器(Wave Biotech LLC)中。使用药丸饲料对培养物进行三次喂食。在第10天收获10L，第11天收获剩余物，两种收获都进行深度过滤，随后进行无菌过滤。通过一个10英寸的0. 45/0. 2微米预过滤器对条件培养基进行过滤，随后通过一个6英寸0. 2微米过滤器进行过滤。蛋白纯化将约5L的条件培养基直接装到220mL MabSelect 系列蛋白A柱(GE Healthcare)上。该柱在PBS (磷酸盐缓冲剂2. 67mM氯化钾、138mM氯化钠、1. 47mM磷酸二氢钾、8. ImM磷酸氢二钠，pH值7. 4)中达到预平衡。使用平衡缓冲剂洗涤该柱，直到在 0D280的读数约为0，然后使用0. IM的醋酸对蛋白进行洗脱。将Mabselect 池应用于一个 300mL SP-HP 柱(GE Healthcare) (5x15cm)。使用 IOmM NaOAC(pH 5)使该柱达到预平衡。然后使用平衡缓冲剂洗涤该柱，直到在0拟80的读数约为0。使用从IOmM NaOAC(pH 5)中的0_150mM NaCl得到的20柱体积梯度缓冲剂对该柱进行洗脱。对SP-HP池进行浓缩，并使用0.2 μ M醋酸纤维素(Corning)过滤器进行过
滤。所用蛋白的序列如下表所示。
权利要求
1.一种包含稳定的激活素IIB受体多肽的分离蛋白，其中所述多肽选自(a)由SEQID NO :4、6、12和14所示的序列组成的多肽；(b)具有与(a)至少90%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合；以及(c)具有与(a)至少95%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。
2.权利要求1的蛋白，其中所述多肽与至少一种异源蛋白连接。
3.权利要求2的蛋白，其中所述异源多肽是IgGFc结构域。
4.权利要求2的蛋白，其中所述异源多肽通过连接子序列与所述多肽连接。
5.权利要求4的蛋白，其中所述连接子选自SEQID NO 25, SEQ ID NO 27、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 49 和 SEQ ID NO :50。
6.权利要求3的蛋白，其中所述蛋白包含选自以下的多肽(a)由SEQID NO :8、10、16和18所示的序列组成的多肽；(b)具有与(a)至少90%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合；以及(c)具有与(a)至少95%序列同一性的多肽，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。
7.权利要求1的蛋白，其中64位的氨基酸残基是丙氨酸。
8.一种包含稳定的激活素IIB受体多肽(svActRIIB)的分离蛋白，其中所述多肽选自(a)除了28位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，由SEQ ID NO 2所示的序列组成的多肽，其中所述观位的置换选自W和Y，并且所述44位的置换为T ；(b)除了28位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，由SEQ ID NO 2的氨基酸19至134所示序列组成的多肽，其中所述观位的置换选自W和Y，并且所述44位的置换为T;(c)除了28位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，由SEQ ID NO 2的氨基酸23至134所示序列组成的多肽，其中所述观位的置换选自W和Y，并且所述44位的置换为T;(d)除了28位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，由SEQ ID NO 2的氨基酸25至134所示序列组成的多肽，其中所述28位的置换选自W和Y，并且所述44位的置换为T;(e)除了观位的单氨基酸置换和44位的单氨基酸置换之外，具有与(a)至(d)中的任一者至少80%序列同一性的多肽，其中所述观位的置换选自W和Y，并且所述44位的置换为T，其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-Il结合。
9.一种分离核酸分子，包含编码权利要求8所述多肽的多核苷酸。
10.一种包含多核苷酸的分离核酸分子，所述多核苷酸选自(a)编码由SEQID NO :4、6、12和14所示序列组成的多肽的多核苷酸；(b)编码与(a)具有至少90%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，并且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11结合； 以及(c)编码与(a)具有至少95%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，并且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11结合。
11.权利要求10的核酸分子，其中所述多核苷酸具有选自SEQID NO :3、5、11和13或其互补序列的序列。
12.权利要求10的核酸分子，其中所述多核苷酸还包含编码至少一种异源蛋白的多核苷酸。
13.权利要求12的核酸分子，包含选自以下的多核苷酸(a)编码由SEQID NO :8、10、16和18所示序列组成的多肽的多核苷酸；(b)编码与(a)具有至少90%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，并且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11结合； 以及(c)编码与(a)具有至少95%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的观位具有W或Y，44位具有T，并且其中所述多肽能够与肌肉生长抑制素、激活素A或GDF-11结合。
14.权利要求13的核酸分子，其中所述多核苷酸具有选自SEQID NO :7、9、15和17或其互补序列的序列。
15.权利要求10的核酸分子，其中所述多核苷酸与转录或翻译调控序列可操作地连接。
16.一种包含权利要求10所述的核酸分子的重组载体。
17.一种包含权利要求16所述的重组载体的宿主细胞。
18.权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
19.一种svActRIIB蛋白的制备方法，包括在促进所述蛋白表达的条件下培养权利要求17所述的宿主细胞，以及回收所述蛋白。
20.一种药物组合物，包含混合药学上可接受的载体的有效量的权利要求1所述蛋白。
21.一种在需要这种治疗的受试者中抑制肌肉生长抑制素活性或激活素活性的方法， 包括向所述受试者给予治疗有效量的权利要求20所述的组合物。
22.—种在需要这种治疗的受试者中增加瘦肌肉质量或增加瘦肌肉质量与脂肪质量之比的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的权利要求20所述的组合物。
23.一种在需要这种治疗的受试者中治疗肌肉萎缩疾病或代谢障碍的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的权利要求20所述的组合物。
24.权利要求23的方法，其中所述肌肉萎缩疾病选自肌肉萎缩症、肌萎缩侧索硬化、 充血性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭、癌症恶病质、AIDS、肾衰竭、尿毒症、类风湿性关节炎、 年龄相关少肌症、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺、烧伤、糖尿病、以及由于长期卧床休养、脊髓损伤、中风、骨折、老化或接触微重力引起的肌肉萎缩。
25.权利要求23的方法，其中所述代谢障碍选自糖尿病、肥胖症、高血糖症和骨丢失。
26.一种在需要这种治疗的受试者中治疗其中激活素过表达的疾病的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的权利要求20所述的组合物。
27.权利要求沈的方法，其中所述疾病为癌症。
28. 一种在需要这种治疗的受试者中治疗肌肉萎缩或代谢或激活素相关病症的方法， 包括向所述受试者给予权利要求16所述的载体，其中所述载体能够在所述受试者中指导 svActRIIB多肽的表达。
全文摘要
本发明提供能够与激活素A、肌肉生长抑制素或GDF-11结合并抑制其活性的稳定的激活素IIB受体多肽和蛋白。本发明还提供能够制备稳定的多肽和蛋白的多核苷酸、载体和宿主细胞。还提供用于治疗肌肉萎缩疾病和代谢障碍的组合物和方法。
文档编号C07K14/705GK102245634SQ200980147945
公开日2011年11月16日 申请日期2009年11月24日 优先权日2008年11月26日
发明者H·韩, J·孙, L-T·T·谭, M·L·迈克尔斯, R·德什潘德, T·C·布恩, Y-S·李 申请人:安姆根有限公司