专利名称：多发性硬化的诊断的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断受试者的多发性硬化(MQ的方法和试剂盒。特别地，本发明涉及用于诊断受试者的MS亚型的方法和试剂盒，所述亚型选自复发-缓解型MS (RRMS)、继发-进展型MS (SPMS)、原发-进展型MS (PPMS)以及选自I型MS病变和II型MS病变的MS病变的病理亚型。
背景技术：
多发性硬化(MS)是推测具有自身免疫病因的中枢神经系统(CNS)的慢性炎症性疾病。MS的特征为脑和脊髓中的局灶性病变(斑块)，导致进行性神经功能异常。MS的病因是未知的，但是认为它是由遗传因素和环境因素联合产生的。目前，没有用于诊断MS的特异性测试，诊断依赖于对受试者临床病史的认识。大脑和脊髓的MRI、脑脊液的分析以及视觉途径和躯体感觉途径的诱发电位的研究可支持诊断。此外，必须排除具有相似表现的全身性病因或传染性病因。多发性硬化可以不可预测地进展和退化；然而，存在几种模式的症状。大约85-90%的患者开始于复发-缓解型(RRMS)进程并且40%患者最终变为进展型(继发进展型MS，SPMS)；在10%患者中，MS呈现原发进展型病程(PPMS)。不同的MS亚型以过去的疾病进程(例如，神经衰退不可预测的复发、缓解和进展)为特征。从临床角度看，具有不同病程的患者显示不同的治疗响应。例如，具有复发-缓解型MS的患者相比于具有进展型病程的患者更有可能响应于免疫调节疗法(Bitsch和Brilck，CNS Drugs, 2002 ；16(6) :405-18)。因此，表征MS亚型不仅对于预后而且对于治疗决策而言都是重要的。MS不仅在其临床症状和进展速率上是多样的，而且在其对疗法的响应和组织病理学发现上也是多样的(Lucchinetti等人，2000，Ann Neurol 47，707-17)。在从给定MS患者检查的多种病变中主动脱髓鞘的模式是相同的，但在不同患者之间是多样的，暗示了致病异质性。I型以T细胞/巨噬细胞介导的脱髓鞘为特征。II型以抗体/补体相关联的脱髓鞘为特征。III型根据远端少突胶质细胞病变(distal oligodendrogliopathy)定义，IV型以斑块周边(periplaque)白质中的少突胶质细胞变性为特征；迄今为止IV型仅在尸检病例中被鉴定。I型病变和II型病变显示典型的静脉周分布和分明的边界，它们是MS病变的病理标志并且被认为由经典自身免疫机制产生(Lucchinetti，等人，2004，Arm Neurol56，308)。MRI通常用来观察体内MS病变。然而，利用MRI研究MS病变受限制，因为它不能提供关于病变的病理构成的信息。从临床观点看，已报道具有II型而不是I型的患者响应于血浆去除术(Keegan等人，2005，Lancet 366，579-82)。因此，对于鉴定将响应于用血浆去除术治疗的患者存在需要。McDonald标准作为有助于多发性硬化(MS)的早期诊断和准确诊断的指南于2001年被引入并修订于2005年(Polman等人，2006，Ann Neurol. ；59(4) :727-8)。将诊断分类减少至a)有MS，b)没有MS，或c)可能有MS。该标准的优点包括在单症状表现后或者在原发进展型进程的情况下作出确定的MS诊断的能力。然而，诊断分类方案和MRI标准仍是复杂的和繁琐的，这种复杂性限制了其在日常实践中的使用。此外，这些标准的特异性相对较低，突出了排除其他诊断的临床判断的重要性。此外，研究已观察到，标准的MS疾病调修药剂(disease-modifying medication)能够使还不满足这些诊断标准的患者受益。最后，McDonald标准大大减少了 MS诊断所需的时间，然而它对于被诊断可能患有MS或最终将接受PPMS诊断的那些个体而言仍受限制。尽管MS被认为是T细胞介导的疾病，但几条证据支持B细胞在该病中的作用(Archelos等人，2000，Ann Neurol. 47，694-706)。B细胞能够通过其分泌抗体和细胞因子或者通过充当激活致病性T细胞的抗原递呈细胞(APC)对MS进展产生影响。B细胞在加工和递呈由其产生的抗体所识别的抗原上明显更为有效。因此，在MS的人模型和实验模型中，线性B细胞表位和T细胞表位共同定位于由自身免疫应答所靶向的CNS抗原中并不出人意料(Meinl 等人，2006，Ann Neurol. 59,880-92 ；Wucherpfennig 等人，1997，J ClinInvest. 100，1114—22)。免疫系统牛物标志免疫系统的先天分支和适应性分支可视为一种类型的生物健康维持系统。在生理学方面，认为构成免疫系统的细胞和分子起作用以对付炎症(Cohen，2000，AcademicI^ess，London)。炎症被经典地定义为导致痊愈的由损伤激活的共同过程。根据免疫系统发起并应付炎症的方式，免疫系统通过愈合伤口、包含病原体、组织结缔组织的结构、生长(血管发生)或破坏血管、触发某些器官的再生、激活衰老细胞和具有无法修复的DNA损坏的细胞的凋亡、降解累积的异常分子、除去废物以及进行其他生命活动来维持身体(Cohen，2000)。炎症的这些不同的表现维持器官的完整性以响应于其不间断的发育后衰变，器官不间断的发育后衰变是由于瘤形成，环境损伤及感染，代谢产物、废物以及其他中毒物的累积，以及不可抗拒的熵增加。已详细调查在MS患者中产生脑脊液(CSF)抗体作为对髓鞘自身抗原的响应的可能性。已描述了对几种CNS抗原有反应性的抗体，包括针对如下蛋白的那些抗体髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘相关糖蛋白、2'，3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNP酶)以及ab-晶状体蛋白。当分析时，这些抗体的亚类与促炎症免疫应答相关。这些自身抗体中许多也在血液中被检出(Lalive 等人，2006，Proc Natl Acad Sci US. 103，2280-5)。此外，还在 MS 患者中发现对非髓鞘自身抗原(Annunziata等人，1999，J Neurol Sci. 168，32-6 ；Barned等人，1995，Neurology. 45，384-5 ；Colaco 等人，1987，Clin Exp Immunol. 68，313-9 ；Roussel 等人，2000，J Autoimmun. 14，259-65 ；Spadaro 等人，1999，.Mult Scler. 5,121-5)有反应性和对病原体(C印ok等人，2005，J Clin Invest. 115，1352-60)有反应性的高滴度抗体。抗体在MS中所起的作用仍有待进一步分类。针对MOG中的构象表位的抗体已从MS病变中被纯化并且其显示改变CNS细胞的生理学(Lalive等人，2006)。因此，美国专利申请公布第2005/0009096号提供了利用针对髓鞘/MOG组分的特异性表位的自身抗体的检测或定量以用于MS的诊断或预后的方法。对CNS抗原中的线性表位有反应性的抗体也已经从MS病变中分离(Dalakas，2006, Pharmacol Ther. 112，57-70，Genain等人，1999，Nat Med. 5，170-5)，暗示它们还在MS病理学中起直接作用。而且，从MS患者中分离的针对MBP的抗体已显示具有直接的蛋白水解活性(Ponmarenko 等人，2006，Proc Natl Acad Sci US. 103,281-6) 美国专利申请公布第2003/0092089号涉及用于检测MBP自身抗体的测定，该测定可选地结合与MS及相关疾病有关的其他生物化学标志的测量。生物标志是与特定的疾病状态有关的解剖学、生理学、生物化学或分子的参数。对MS生物标志的寻找已聚焦于炎症过程的一般活动的指示物。几种生物标志目的在于不是追踪炎症过程本身，而是追踪其后果，诸如神经变性和轴突缺失。因此，已描述神经微丝轻链、tau和14-3-3蛋白的水平改变与MS患者的轴突缺失相关。因为MS被认为是器官特异性自身免疫疾患，所以免疫生物标志具有反映疾病活动及其对疗法的响应的潜力。几项大规模蛋白质组学研究已尝试表征CSF和血清中的抗体，目的是鉴定MS患者中还未知的自身免疫攻击的靶(Lefran等人，2004，J Immunol 172，669-78)。而且，已研究特异性抗体作为MS的生物标志，导致鉴定针对CSF和/或血清中的髓鞘抗原的若干上调的抗体应答。然而，这些生物标志不可概括至大多数MS患者或者不能在独立研究中被验证(Rinaldi 和 Gallo, 2005，Neurol Sci. 26，S215-7 ；Lim 等人，2005，Mult Scler. 11，492-4)。与其他自身免疫疾病诸如糖尿病(Quintana等人，2004，NatlAcad Sci，14615-21)和系统性红斑狼疫(Li 等人，2005，J Clin Invest. 115，3428-39)中观察到的类似，有可能单个生物标志将不是决定性的，而是需要形成指纹的几种生物标志的一种模式。抗原芯片抗原微阵列是用于免疫应答的高通量表征的新开发的工具(Robinson等人，2002, Nat Med 8，295-301)，已用于分析免疫接种中和自身免疫疾患中的免疫应答(Robinson 等人，2002 ；Robinson 等人，2003，Nat Biotechnol. 21，1033-9 ；Quintana 等人，2004 ;Kanter等人，2006，Nat Med 12，138-43)。已经假定，多种反应性的模式可能比单一抗原-抗体关系更能说明问题(Quintana等人，2006，Lupus 15，428-30)，如之前对健康和患病的小鼠(Quintana 等人，2004 ;Quintana 等人，2001，J Autoimmun 17，191-7)以及人(Merbl 等人，2007，J Clin Invest 117，712-8 ；Quintana 等人，2003，J Autoimmun 21，65-75)的自身免疫所有组成部分的分析所显示的。因此，自身抗体所有组成部分具有提供对疾病发病机理的新见解和充当疾病过程的免疫生物标志的潜力(Cohen，2007，Nat RevImmunol. 7,569-74)。抗原微阵列已用于表征系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和视神经脊髓炎中的血清自身抗体。然而，没有报道MS中的高亲和力特异性抗体以某种规律存在于血清中(Meinl等人，2006，Ann Neurol. 59，880-92 ;0，Connor 等人，2007，Nat Med 12，12 ;Zhou 等人，2006,Proc Natl Acad Sci US. 103，19057-62)。与血清中的自身抗体相反，Kanter 和同事使用微阵列来检测CSF中的脂质(Kanter等人，2006)和α α B-晶状体蛋白(Ousman等人，2007，Nature. 448，474-9)反应性抗体。引人注目地，针对α B-晶状体蛋白的抗体具有低亲和力，以1 20稀释度可检出(Ousman等人，2007)。本发明的发明人中的一些发明人的PCT公布第WO 02/08755号涉及用于对预定抗原分类并藉此鉴定它们的方法、系统和制品，所述预定抗原对源自需要诊断疾病或监测治疗的患者受试者的血清的未确定的免疫球蛋白有反应性。该'755公布公开了抗原阵列用于鉴定对源自患多种疾病的受试者的血清的免疫球蛋白有反应性的抗原的用途。还公布了诊断方法和可用于这些方法的系统，这些方法和系统采用对多种抗原的抗原亚组进行分类的步骤，所述抗原亚组对源自患有免疫系统受损或遭受疾病的多个患者的多种抗体有反应性，并且将受试者的抗体与得到的类(cluster)相关联或去关联。尽管WO 02/08755公开了可用于诊断除其他自身免疫疾病之外的MS的方法，但没有公开诊断MS的不同亚型或监测MS进展。本发明的发明人中的一些发明人的美国专利申请公布第2005/(^60770号公开了抗原阵列系统及其诊断用途。该申请提供了在受试者诊断免疫疾病且特别是1型糖尿病或免疫疾病倾向的方法，该方法包括确定受试者的免疫球蛋白特异性结合抗原探针组的每种抗原探针的能力。抗原探针组包括选自由以下组成的组的多种抗原探针细胞/组织结构分子的至少一部分、热休克蛋白的至少一部分、免疫系统分子的至少一部分、同聚多肽的至少一部分、激素的至少一部分、代谢酶的至少一部分、微生物抗原的至少一部分、软体动物抗原的至少一部分、核酸的至少一部分、植物抗原的至少一部分、血浆分子的至少一部分、以及组织抗原的至少一部分，其中受试者的免疫球蛋白的结合能力指示免疫疾病或免疫疾病倾向。然而，现有技术没有公开可提供用于诊断MS、具体用于区别MS的不同亚型并预测或监测疾病进展的特异性、可靠的、准确的且区别性测定的抗原阵列。这些区别性测定在为每位患者定制适当的治疗方法上将具有高度价值。PCT公布第WO 07/137410号涉及用于诊断MS、MS的不同形式或另外的脱髓鞘疾患的方法。具体地说，WO 07/137410涉及根据分子质量鉴定的、发现在临床诊断的MS或其他神经疾患与正常患者之间具有不同的丰度或强度的特异性代谢产物。尽管如此，WO07/137410既没有公开也没有提及利用测试抗体反应性模式来鉴定不同MS亚型中的独特特征标记(signature)模式并且区分患有MS的患者与患其他神经疾患的患者。因此，对可用于在受试者中诊断MS且特别是诊断MS亚型的改进的诊断方法和试剂盒存在需要。发明概述本发明提供了用于诊断受试者的多发性硬化(MS)的方法和试剂盒，用于实施这种诊断的抗原探针阵列以及用于产生这些阵列的抗原探针组。特别地，本发明提供了用于诊断受试者的MS亚型的方法和试剂盒，其中所述MS亚型选自复发-缓解型MS (RRMS)、继发进展型MS (SPMS)、原发进展型MS (PPMS)以及选自I型MS病变和II型MS病变的MS病变的
病理亚型。本发明部分地基于当使用抗原阵列测试MS患者的抗体反应性时获得的出人意料的结果。该分析导致自身抗体反应性的独特特征标记模式的鉴定。现在第一次公开的是，根据对中枢神经系统(CNS)抗原、热休克蛋白(HSP)和脂质抗原的反应性，独特自身抗体特征标记模式表征MS亚型，也就是复发-缓解型MS (RRMS)、继发进展型MS (SPMS)以及原发进展型MS(PPMS)。弓丨人注目地，独特自身抗体特征标记模式区分MS亚型与其他的神经疾病或自身免疫驱动性疾病，包括阿尔兹海默病(AD)、肾上腺脑白质营养不良(ALD)和红斑狼疮。还公开了 根据对脂质和CNS来源的肽的反应性，独特的自身抗体特征标记模式表征MS病变的不同免疫病理学模式，由此第一次提供用于对MS类别和阶段进行分亚型的基于生物标志的测定。因此，本发明涉及用于诊断MS亚型的方法和试剂盒。根据本发明的原理，试剂盒包括在本文也称为抗原探针组的多种抗原。包括多种抗原的这些抗原探针组与患有MS的受试者的血清特异性反应。根据本发明的原理，多种抗原可有利地以抗原阵列的形式使用。根据一些实施方案，抗原阵列便利地以抗原芯片形式排列。本发明鉴定了与MS亚型相关的抗原的类，并且确定了用测试血清相比于对照血清观察到的反应性。尽管没有鉴定凭自身足以充分诊断患有MS或MS亚型的受试者的单一抗原，但本文在以下表1到表4中详述的这些抗原的特定组合比每种单独的抗原在区别患者受试者和对照受试者上明显地更加准确和可靠。如以下详述的表1包含SEQ IDN0:7、14、23-83及98-100，源自SEQ ID NO :4_6、10以及12的片段和非肽部分乳糖脑苷月旨(Iactocerebroside)。如以下详述的表 2 包含 SEQ ID NO :7、8、13、16、22、29、42、51、60、67-71、84、85及101，源自SEQ ID NO :4_6、9、10、12以及20的片段，以及非肽部分明尼苏达沙门氏菌(S.mirmes0ta)LPS、大肠杆菌LPS和硫酸软骨素4。如以下详述的表3包含 SEQ ID NO :6、7、19、21、25、26、28、29、31、32、35-38、40-42、44、48、53、55、56、64、70、73、75、85-96、100、102及103，源自SEQ ID NO :4_6、10、12及15的片段，以及非肽部分无唾液酸神经节苷脂-GM2、心磷脂和胆固醇。如以下详述的表4包含SEQ ID NO 17,29,43,85及97，源自SEQ ID N0:5及12的片段，以及非肽部分15-酮胆甾烷、15α-羟基胆甾烯、神经节苷脂-GM4、15-酮胆留烯、四唾液酸神经节苷脂-GQ1B、脑L- α -溶血磷脂酰丝氨酸(L-α -Iysophosphatidylserine)和乳糖基神经酰胺。表1- K^ll RRMS与健康对照(HC)的杭原
权利要求
1.一种诊断受试者的多发性硬化(MQ亚型的方法，该方法包括确定从该受试者获得的样品中的抗体对选自由表1到表4中列出的抗原组成的组的多种抗原的反应性，从而确定该样品对所述多种抗原的反应性模式，并且比较所述样品的反应性模式与对照反应性模式，其中所述MS亚型选自由以下组成的组(i)复发缓解型多发性硬化(RRMS)，其中所述多种抗原选自由表1中列出的抗原组成的组；( )原发进展型多发性硬化(PPMS)，其中所述多种抗原选自由表2中列出的抗原组成的组；(iii)继发进展型多发性硬化(SPMS)，其中所述多种抗原选自由表3中列出的抗原组成的组；以及(iv)选自I型病变和II型病变的MS病理亚型，其中所述多种抗原选自由表4中列出的抗原组成的组。
2.如权利要求1所述的方法，其中在获自该受试者的所述样品的反应性模式与对照样品的反应性模式之间的显著性差异是该受试者患MS亚型的指示。
3.如权利要求2所述的方法，其中使用学习与模式识别算法计算该差异。
4.如权利要求1所述的方法，所述方法用于诊断受试者的复发缓解型多发性硬化(RRMS)，其中所述多种抗原选自表1中列出的抗原，并且所述对照反应性模式从健康受试者获得。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述多种抗原包括表1中列出的抗原中的至少5种不同的抗原。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述多种抗原包括表1中列出的所有抗原。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述多种抗原包括不超过大约130种抗原。
8.如权利要求1所述的方法，所述方法用于诊断受试者的原发进展型多发性硬化(PPMS)，其中所述多种抗原选自表2中列出的抗原，并且所述对照反应性模式从健康受试者获得。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述多种抗原包括表2中列出的抗原中的至少5种不同的抗原。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述多种抗原包括表2中列出的所有抗原。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述多种抗原包括不超过大约100种抗原。
12.如权利要求1所述的方法，所述方法用于诊断受试者的继发进展型多发性硬化(SPMS)，其中所述多种抗原选自表3中列出的抗原，并且所述对照反应性模式从RRMS受试者获得。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述多种抗原包括表3中列出的抗原中的至少5种不同的抗原。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述多种抗原包括表3中列出的所有抗原。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述多种抗原包括不超过大约100种抗原。
16.如权利要求1所述的方法，所述方法用于在患有MS的受试者中诊断I型病变，其中所述多种抗原选自表4中列出的抗原，并且所述对照反应性模式从具有II型病变的受试者获得。
17.如权利要求1所述的方法，所述方法用于在患有MS的受试者中诊断II型病变，其中所述多种抗原选自表4中列出的抗原，并且所述对照反应性模式从具有I型病变的受试者获得。
18.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述对照选自由以下组成的组来自至少一个个体的样品、来自一组个体的一小组对照样品和来自对照个体的一组储存的数据。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是血清样品。
20.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括在确定所述样品中的抗体的反应性之前1 10稀释所述样品。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述多种抗原以抗原阵列形式使用。
22.一种用于诊断MS亚型的试剂盒，该试剂盒包括(i)选自由表1中列出的抗原组成的组的用于诊断RRMS的多种抗原；( )选自由表2中列出的抗原组成的组的用于诊断PPMS的多种抗原；(iii)选自由表3中列出的抗原组成的组的用于诊断SPMS的多种抗原；和/或(iv)选自由表4中列出的抗原组成的组的用于在患有MS的受试者中区分I型病变与II型病变的多种抗原。
23.如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒用于诊断RRMS，该试剂盒包括选自由表1中列出的抗原组成的组的多种抗原。
24.如权利要求23所述的试剂盒，该试剂盒包括表1中列出的所有抗原。
25.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述多种抗原包括表1中列出的抗原中的至少5种、至少10种或至少15种不同的抗原。
26.如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒用于诊断PPMS，该试剂盒包括选自由表2中列出的抗原组成的组的多种抗原。
27.如权利要求沈所述的试剂盒，该试剂盒包括表2中列出的所有抗原。
28.如权利要求沈所述的试剂盒，其中所述多种抗原包括表2中列出的抗原中的至少5种、至少10种或至少15种不同的抗原。
29.如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒用于诊断SPMS，该试剂盒包括选自由表3中列出的抗原组成的组的多种抗原。
30.如权利要求四所述的试剂盒，该试剂盒包括表3中列出的所有抗原。
31.如权利要求四所述的试剂盒，其中所述多种抗原包括表3中列出的抗原中的至少5种、至少10种或至少15种不同的抗原。
32.如权利要求22所述的试剂盒，所述试剂盒用于在患有MS的受试者中区别I型病变与II型病变，该试剂盒包括选自由表4中列出的抗原组成的组的多种抗原。
33.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述试剂盒是以抗原阵列的形式。
34.如权利要求22所述的试剂盒，该试剂盒还包括用于确定样品中的抗体对所述多种抗原的反应性的装置。
35.如权利要求22所述的试剂盒，该试剂盒还包括用于比较不同样品中的抗体对所述多种抗原的反应性模式的装置。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述用于比较反应性模式的装置包括学习与模式识别分析仪。
37.一种抗原探针组，该抗原探针组包括表1中列出的抗原探针。
38.一种抗原探针组，该抗原探针组包括表2中列出的抗原探针。
39.一种抗原探针组，该抗原探针组包括表3中列出的抗原探针。
40.一种抗原探针组，该抗原探针组包括表4中列出的抗原探针。
41.一种制品，该制品包括权利要求37-40中任一项所述的抗原探针组。
42.抗原探针组用于制备诊断MS亚型的诊断组合物的用途，所述抗原探针组包含选自由表1到表4之一列出的抗原组成的组的多种抗原，其中所述MS亚型选自由以下组成的组(i)RRMS，其中所述多种抗原选自由表1中列出的抗原组成的组；(ii)PPMS，其中所述多种抗原选自由表2中列出的抗原组成的组；(iii)SPMS，其中所述多种抗原选自由表3中列出的抗原组成的组；以及(iv)选自I型病变和II型病变的MS病理亚型，其中所述多种抗原选自由表4中列出的抗原组成的组。
43.如权利要求42所述的用途，其中所述诊断组合物用于确定样品中的抗体的反应性，从而确定所述样品对所述多种抗原的反应性模式，其中在所述样品的反应性模式与对照样品的反应性模式之间的显著性差异是MS亚型的指示。
全文摘要
本发明涉及用于诊断受试者的多发性硬化(MS)的方法和试剂盒。特别地，本发明涉及用于诊断受试者的MS亚型的方法和试剂盒，所述亚型选自复发缓解型MS(RRMS)、继发进展型MS(SPMS)、原发进展型MS(PPMS)以及选自I型MS病变和II型MS病变的MS病变的病理亚型。
文档编号C07K16/00GK102388307SQ200980154256
公开日2012年3月21日 申请日期2009年11月12日 优先权日2008年11月12日
发明者弗朗西斯科·J·昆塔纳, 艾润·R·科恩, 霍华德·L·韦纳 申请人:伯莱翰女子医院公司, 耶达研究与发展有限公司