专利名称：有效的缀合物和亲水性连接体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的连接体，所述新的连接体以连接体有助于增加药物活性的方式将药物(例如细胞毒剂)连接至细胞结合剂(例如抗体)。具体来讲，本发明涉及新型的亲水性连接体的用途，其中此类连接体在多种癌细胞类型中使细胞结合剂-药物缀合物的效价或效能增强若干倍，所述癌细胞类型包括在细胞表面表达低数量抗原的癌细胞或对治疗有抗性的癌症。本发明还涉及用于制备美登木素生物碱的方法，所述美登木素生物碱带有硫醚部分和允许将所述美登木素生物碱连接至细胞结合剂的反应性基团。
背景技术：
细胞毒性药物的抗体缀合物正在被开发为靶标特异性治疗剂。针对各种癌细胞表面抗原的抗体已与抑制各种主要细胞靶标的不同细胞毒剂缀合，所述细胞靶标如微管(美登木素生物碱、阿里他汀类(auristatins)、紫杉烷美国专利第5，208，020号；第 5，416，064 号；第 6，333，410 号；第 6，441，163 号；第 6，340，701 号；第 6，372，738 号；第 6，436，931 号；第 6，596，757 号；第 7，276. 497 号)、DNA(加利车霉素、阿霉素、CC-1065 类似物；美国专利第5，475，092号；第5，585，499号；第5，846，545号；第6，534，660号； 第6，756，397号；第6，630，579号)。与这些细胞毒性药物中的一些的抗体缀合物正在临床中积极地研究用于癌症治疗(Richart, A. D.和 Tolcher, A. W. , 2007, Nature Clinical Practice,4,245-255)。抗体-细胞毒剂缀合物通常通过对抗体上的反应性部分(如赖氨酸氨基或半胱氨酸基团(通过还原天然二硫键产生或通过使用分子生物学方法将其它非天然半胱氨酸残基构造到抗体上产生))的初始修饰来制备。因此，首先用异双功能连接体试剂(如前述的那些，示例为SPDB、SMCC和SIAB (美国专利第6，913，758号和美国专利公布第20050169933 号))修饰抗体以并入具有反应性基团(如混合的吡啶基二硫、马来酰亚胺或卤代乙酰胺) 的连接体。在抗体中并入的反应性连接体基团随后与含有反应性部分(如硫羟基)的细胞毒剂缀合。另一种缀合途径是通过含有硫羟反应性基团(如卤代乙酰胺或马来酰亚胺) 的细胞毒剂衍生物与细胞结合剂上的硫羟基的反应。通过还原天然二硫残基(R. Singh等人，Anal. Biochem.，2002，304，147-156)，或还原并入的二硫部分(经由SPDP、琥珀酰亚胺基3-(2-批唳基二硫)丙酸酯)，随后用二硫苏糖醇还原(D. G. Gilliland等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，1980，77，4539-4543)，或通过并入其它非天然半胱氨酸残基(J. B. Stimmel 等人，J. Biol. Chem.，2000，275，30445-30450)，将硫羟基团并入细胞结合剂(如抗体)，或通过与2-亚氨基四氢噻吩(R. Jue等人,Biochemistry, 1978,17, 5399-5406)或3-巯基丙亚胺酸甲酯(T. P. King等人，Biochemistry, 1978,17,1499-1506)反应并入硫轻基。
为了在癌细胞内递送活性细胞毒剂，具有二硫键或硫醚键的抗体-细胞毒剂缀合物在细胞内(大概在溶酶体中)裂解(H. K. Erickson等人,2006, Cancer Research, 66, 4626-4433)。除了杀灭靶细胞之外，具有可还原二硫键的抗体-细胞毒剂缀合物还杀灭在体外抗原阴性和抗原阳性细胞混合种群中和体内异种移植模型中的邻近的抗原阴性细胞， 这显示靶细胞释放的细胞毒剂提高对具有异源抗原表达的肿瘤中的邻近非抗原表达细胞功效中的作用(Y. V. Kovtun 等人，Cancer Research，2006，66，3214-3221)。虽然抗体-细胞毒性药物缀合物显示体外细胞杀灭活性和体内抗肿瘤活性，但是其效价在许多情况下降低，特别是当在靶癌细胞上的抗原表达低时，或当靶细胞对治疗有抗性时。这在临床情形中是很常见的情况，导致在患者中产生低至中度抗肿瘤活性。试图克服抗性的可能方法是合成带有亲水性或疏脂性功能的新药(参见G. Szokacs等人，Nature Reviews, 5 ;219_235，2006)。然而，这种方法是繁杂的且必须合成若干类似物，并且药物结构的修饰经常引起生物活性的损失。因此需要一种不同的方法。本领域所述的用于制备细胞结合剂和药物经由不可裂解的连接体的细胞毒性缀合物的方法需要两个反应步骤(美国专利5，208，020和美国公布第2005/0169933号)。首先，用与细胞结合剂的反应性基团(如赖氨酸残基上的氨基或半胱氨酸残基上的巯基)反应的双功能交联剂修饰细胞结合剂(如抗体)以形成共价化学键。修饰细胞结合剂之后，纯化产物以从未反应的交联剂分离所需的修饰的细胞结合剂。在第两步骤(称为缀合步骤) 中，将反应性药物衍生物(如含有硫羟的美登木素生物碱)加入修饰的细胞结合剂以与修饰的细胞结合剂反应。这个反应之后，需要再纯化以从最终缀合物除去任何未反应的药物种类和其它副产物。所述多重反应和纯化步骤导致最终缀合物的低产率并且当考虑大规模地实现这些步骤时可能是昂贵和繁杂的。这些方法的其它缺点是当未反应的交联剂保持与未连接药物的细胞结合剂连接时引入的缀合物异质性。未反应的交联剂随后可能进行其它副反应(如水解和分子内或分子间反应)。因此，需要可以在基本上一个反应步骤中经由不可裂解的键共价连接至细胞结合剂(如抗体)的功能化的反应性药物衍生物(如美登木素生物碱)。发明概述本发明通过设计以连接体有助于增加药物活性的方式将药物连接至细胞结合剂的新的连接体来解决抗性问题。因此，本发明改善药物与细胞结合剂连接的方式，以致连接体设计提供对广谱的肿瘤(特别是在低抗原表达或抗药性肿瘤中)有活性的缀合物。本发明基于以下新发现当传统的连接体(例如描述于美国专利公布第 20050169933号中的SMCC、SIAB等)通过并入聚乙二醇[PEGn，(-CH2CH2O) J间隔物而被修饰为亲水性连接体时，细胞结合剂-药物缀合物在多种癌细胞类型中的效价或效能意外地增加若干倍，所述癌细胞类型包括在细胞表面表达低数量抗原的癌细胞。此外，与前述的缀合物相比，这些含有PEG的缀合物对于对治疗有抗性的细胞系出乎意料地更有效。此外，在抗体缀合物的情况下，亲水性连接体的并入允许每个抗体分子缀合最多 15个药物分子，产率高并且没有聚集或沉淀。具有每个抗体分子连接最多15分子药物的亲水性连接体的这些缀合物高亲合力地与靶抗原(类似于未修饰的抗体)结合。本发明还公开了对细胞结合剂的氨基或硫羟基有反应性的新型的美登木素生物碱，以致与细胞结合剂的硫醚连接的美登木素生物碱缀合物可以在基本上一个反应步骤中制备，而不用进行细胞结合剂的先前化学修饰。本发明公开了用于合成带有硫醚部分和反应性基团的新型的美登木素生物碱衍生物的方法。这些新型的美登木素生物碱可用于在基本上一个反应步骤中制备与细胞结合剂的硫醚连接的缀合物。还公开了使用这些新型的反应性美登木素生物碱制备细胞结合剂缀合物的方法。因此，本发明提供式(I)化合物或式(Γ )的特定化合物Z-X，_ (_CH2_CH2_0_)n_Yp_D (I)D_Yp_(_CH2_CH2_0_)n_Xi_Z (I，)其中Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；I 是 O 或 I ;P是O或I ;以及η是I至2000的整数。本发明的另一个方面是式(2)的细胞结合剂药物缀合物或式(2’ )的特定化合物CB- [XK-CH2-CH2-O-) n-Yp-D] m (2)[D-Yp-(-CH2-CH2-O-) J1-Xjm-CB (2，)其中，CB表示细胞结合剂；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；I 是 O 或 I ;P 是 O 或 I ;m是2至15的整数；以及η是I至2000的整数。本发明的另一个方面是式(3)化合物或式(3’ )的特定化合物Z-X, _ (-CHg-CH2O-) n_Y_D (3)D-Y-(-CH2-CH2O-) n-Xi_Z (3，)其中Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、非芳族杂环基或芳族杂环基团；I是O或I ;以及η是I至14的整数。本发明的另一个方面是式(4)的细胞结合剂药物缀合物或式(4’ )的特定化合物CB- (Xi- (-CH2-CH2O-) n-Y~D) m (4)[D_Y_ (-CH2-CH2O-) n_X, ]m-CB (4，)其中，CB表示细胞结合剂；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；I是O或I ;以及m是3至8的整数；以及η是I至14的整数。本发明的再一个方面是用于治疗对用所述方法的治疗敏感的癌症的方法，所述方法包括对有需要的患者肠胃外施用有效剂量的包含式(2)或(4)的缀合物的组合物。在本发明的又一个方面中，提供了具有带有反应性基团且由式(5)所示的硫醚部分的新型的美登木素生物碱D，-Y’ -V-Q-W-Z，(5)其中D’表示带有巯基的美登木素生物碱，如Ν2’ -去乙酰基-Ν2’ -(3-巯基_1_氧代丙基)_美登素(DMl)或Ν2’-去乙酰基-Ν2’-(4-巯基-4-甲基-I-氧代戊基)美登素(DM4)；Y’表示硫醚键V是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；Q表示任选的芳族或杂环部分；W是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；以及V表示胺或巯基反应性基团。带有硫醚部分的反应性美登木素生物碱衍生物由带有巯基的美登木素生物碱 (如DMl和DM4)和异双功能交联剂制备。反应由以下化学方程式表示D，+V-V-Q-W-Z，— D，-Y，-V-Q-W-Zj其中D’表示带有巯基的美登木素生物碱，如Ν2’ -去乙酰基-Ν2’ - (3-巯基-I-氧代丙基)_美登素(DMl)或Ν2’-去乙酰基-Ν2’-(4-巯基-4-甲基-I-氧代戊基)美登素(DM4)；V是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；Q表示任选的芳族或杂环部分；W是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
V是胺或巯基反应性基团；Y"表示巯基反应性部分；以及Y’表示介于带有巯基的美登木素生物碱和交联剂之间的硫醚键。本发明还公开了用于制备经由不可裂解的键连接的美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性缀合物(式10)的方法，所述方法包括使细胞结合剂与式Z’ -W-Q-V-Y’ -D’ 化合物反应以提供式CB-(Z" -W-Q-V-Y’ -D’ )m的细胞结合剂缀合物，其中，V表示胺或巯基反应性基团；W是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；Q表示任选的芳族或杂环部分；V是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；Y’表示硫醚键；D’表示带有巯基的美登木素生物碱，如N2’ -去乙酰基-N2’ -(3-巯基_1_氧代丙基)_美登素(DMl)或N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-I-氧代戊基)美登素(DM4)；CB表示细胞结合剂；I"表示酰胺键；以及m是2至8的整数。所述细胞结合剂美登木素生物碱缀合物可进一步纯化。附图简述图I示出本发明的代表性的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的结构示意图(mAb =单克隆抗体)。图2示出本发明的代表性的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的结构示意图。图3示出本发明的代表性的含有PEG的二硫连接的化合物的结构示意图。图4示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的合成方案。图5示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的合成方案。图6示出本发明的含有PEG的二硫连接的化合物的合成方案a.)用于与细胞结合剂一步缀合的含有PEG的二硫连接的化合物的合成；和b.)异双功能的含有PEG的二硫连接的交联化合物的合成。图7示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。图8示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。图9示出本发明的含有PEG的硫醚连接的(硫代乙酰氨基连接的)缀合物的缀合过程(一步缀合)。
图10示出本发明的含有PEG的硫醚连接的(硫代乙酰氨基连接的)缀合物的缀合过程(两步缀合)。图11示出本发明的含有PEG的二硫连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。
图12示出本发明的含有PEG的二硫连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。图13示出本发明的含有PEG的巯基反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的合成方案。图14示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。图15示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。图16示出本发明的含有PEG的巯基反应性硫代乙酰氨基连接的化合物的合成方案；a.)用于一步缀合的含有PEG的巯基反应性硫代乙酰胺连接的化合物的合成；和b.)用于两步缀合的异双功能的含有PEG的巯基反应性交联化合物的合成。图17示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。图18示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。图19示出本发明的含有PEG的巯基反应性硫醚连接的化合物的合成方案a.)用于一步缀合的含有PEG的巯基反应性硫代乙酰氨基连接的化合物的合成；和b.)用于两步缀合的同双功能的含有PEG的巯基反应性交联化合物的合成。图20示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。图21示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。
(MS)。
(SEC)。图24示出HuAb-PEG4Mal-DMl缀合物(10. 7美登木素生物碱/抗体)的FACS结合类似于与未修饰的抗体的结合。图25示出抗EpCAM抗体-美登木素生物碱缀合物对抗多药物性C0L0205-MDR细胞的细胞毒性。图26示出抗CanAg抗体-美登木素生物碱缀合物对抗多药物性C0L0205-MDR细胞的细胞毒性。
图22示出去糖基化HuAb-PEG4MaI-DMl缀合物(10. 7DM1/AL·,平均值)的质谱23示出HuAb-PEG4MaI-DMl缀合物(10. 7DM1/AL·,平均值)的尺寸排阻层析法图
细胞毒性。图活性。图
肿瘤活性。
27示出抗CD56抗体-美登木素生物碱缀合物对Molp-8多发性骨髓瘤细胞的
28示出抗EpCAM抗体-美登木素生物碱缀合物对HCT15细胞的细胞毒性。
29示出抗EpCAM抗体-美登木素生物碱缀合物对C0L0205mdr细胞的细胞毒性。 30示出抗EpCAM抗体美登木素生物碱缀合物对HCT15异种移植的体内抗肿瘤
31示出抗EpCAM抗体美登木素生物碱缀合物对C0L0205mdr异种移植的体内抗
120123]图32示出抗EpCAM抗体美登木素生物碱缀合物对C0L0205异种移植的体内抗肿
瘤活性。
0124]图33示出抗CanAg抗体美登木素生物碱缀合物对C0L0205mdr异种移植的体内抗肿瘤活性。
0125]图34示出具有最多17个D/A的抗CanAg抗体(huC242) _PEG24_Mal_DMl缀合物的结合。
0126]图35示出具有4至17个D/A的抗CanAg抗体(huC242) _PEG24_MaI_DMl缀合物对COLO 205细胞的体外效价。
0127]图36示出具有4至17个D/A的抗CanAg抗体(huC242) _PEG24_MaI_DMl缀合物对抗多药物性(pgp+) C0L0205-MDR细胞的体外效价。
0128]图37示出抗EGFR抗体-美登木素生物碱缀合物对U0-31细胞的细胞毒性。
0129]图38示出抗体-PEG4-Mal-DM1的血浆药代动力学。
0130]图39示出本发明的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的结构示意图(mAb =抗体， =2-8)。
0131]图40示出本发明的硫代乙酰氨基连接的缀合物的结构示意图(mAb =抗体，m = 2-8)。
0132]图41示出用本发明的化合物制备的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程 mAb =抗体,m = 2-8)。
0133]图42示出用本发明的化合物制备的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(mAb =抗体，m = 2-8) ο
0134]图43示出本发明的胺反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的合成方案。
0135]图44示出制备在马来酰亚胺和NHS酯之间含有直链烃的胺反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的合成方案。
0136]图45示出用本发明的化合物制备的去糖基化mAb-SMCC-DMl缀合物(3. 42DM1/ mAb，平均值)的质谱图(MS)。
0137]图46示出在马来酰亚胺和NHS酯之间含有环烷基的胺反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的两步制备法的合成方案。
0138]图47示出在马来酰亚胺和NHS酯之间含有环烷基的胺反应性不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的两步制备法的合成方案。
0139]
0140]
0141]
_8)。
0142] mAb =
0143]案。
图48示出制备本发明的硫代乙酰氨基连接的化合物的合成方案。
图49示出本发明的硫代乙酰氨基连接的化合物的两步制备法的合成方案。
图50示出本发明的硫代琥拍酰亚胺基连接的缀合物的结构(mAb =抗体，m =
图51示出用本发明的化合物制备的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程 :抗体，m = 2-8) ο
图52示出制备本发明的巯基反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的合成方图 53 示出具有 3. 8 或 D/A 的抗 CanAg (huC242)-Mal-(CH2)6-Mal-DMl 缀合物与抗
原阳性C0L205细胞结合。
图54 示出具有 3. 8D/A 的抗 CanAg 抗体(huC242) -Mal-(CH2) 6_Mal_DM I 缀合物对抗原阳性C0L0205细胞有效但比对抗原阴性Namalwa细胞的有效性低。发明详述本发明公开了以下新发现通过聚乙二醇或聚环氧乙烷连接体((-CH2CH2O)n)与药物(例如细胞毒剂)连接的细胞结合剂(如抗体)的缀合物显示对靶癌细胞的细胞毒性比基于与具有典型的脂肪族连接体和类似药物负载的传统细胞结合剂药物缀合物比较所预期的大若干倍。重要的是，本发明所述的缀合物对抗多药物性(mdr)癌细胞(其对用细胞毒性药物的治疗敏感性差)是非常有力或有效的。癌症治疗造成解决用不同化学治疗剂进行多轮治疗之后经常遇到的抗药性机制的障碍。在癌细胞中观察到的一种称为抗多药物性的此类机制是由ATP结合盒(ABC)转运蛋白的药物输出增加所引起(C.Drumond， B. I. Sikic, J Clin. Oncology,1999,17,1061-1070, G, Szokacs 等，Nature Reviews,5 ； 219-234,2006)。解决这些抗药性机制的治疗(如通过癌细胞干扰或解决药物的这种流出) 将是非常有用的。将细胞结合剂和细胞毒性药物的PEG连接的缀合物对于抗多药物性癌细胞的细胞毒性进行评估以检测PEG连接体是否赋予针对这些抗性细胞的任何优势。在针对 mdr细胞的这些分析中，与衍生自常规的连接体的非常低效的缀合物相比，细胞结合剂和细胞毒性药物的PEG连接的缀合物显示对mdr细胞出乎意料地有效的细胞杀灭。此外，本发明的缀合物还在用抗多药物性肿瘤细胞建立的动物模型中显示显著更高的抗肿瘤活性。使用亲水性聚乙二醇或聚环氧乙烷连接体(PEG或PEO ； (-CH2CH2O) n)还允许每个细胞结合剂分子并入相对大量的药物，在大于治疗使用所希望的lmg/ml浓度下具有大于 90%的高蛋白单体水平。此外，具有一定范围的细胞毒性药物负载(每个细胞结合剂连接的从较小值2到较大数(例如15个药物))的细胞结合剂的聚乙二醇(PEG)连接的缀合物对靶癌细胞显示的细胞毒性比基于缀合物增加的药物负载而在药物递送的化学计量增加所预期的大大增加。在本发明中描述了细胞结合剂和具有PEG间隔物的药物的缀合物，与具有类似药物负载的传统制备的缀合物相比，其显示对靶癌细胞的细胞毒性的超化学计量增加到多达260-650倍的效价增强(参见，例如图29)。因此，在本发明的一个方面中，描述了带有具有聚乙二醇间隔物(_0120120)11和能够与细胞结合剂反应的反应性基团的连接体的药物。在这方面中具体考虑的是式(I)的修饰的化合物或式(Γ )的特定化合物 Z-X，_ (_CH2_CH2_0_) n_Yp_D (i)D_Yp_(_CH2_CH2_0_)n_Xi_Z (I，)其中Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；I 是O或 I;P是O或I;以及
η是I至2000的整数。
优选地，将Y连接至药物的共价键是硫醚键或酰胺键。
优选地，η是I至100的整数。更优选地，η是I至14的整数。在最优选的方面中，η是I至4的整数。
在本发明的第二方面中，描述了具有聚乙二醇连接体(-CH2CH2O) 的细胞结合剂和药物的新型的缀合物。这些缀合物比具有传统连接体和等同药物负载的缀合物对癌细胞更有效。
在一个优选方面中具体考虑的是细胞结合剂与式(2)的药物的缀合物或式(2’ )的特定化合物
CB- [X，- (-CH2-CH2-O-) n-Yp-D] m (2)
[D-Yp- (-CH2-CH2O-) n-X , ] m-CB (T)
其中
CB表示细胞结合剂；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
I是O或I ;
P是O或I;以及
m是2至15的整数；以及
η是I至2000的整数。
优选地，所述共价键是硫醚键或酰胺键。
优选地，m是3至8的整数。
优选地，η是I至100的整数。更优选地，η是I至14的整数。在最优选的方面中，η是I至4的整数。
本发明还基于以下新发现在抗体缀合物的情况下，其中抗体经由二硫键连接至
细胞毒性药物，在免疫缀合物效价或效能的增强中，在连接的药物数目和聚乙二醇间隔物长度之间有重要的相关性。这种连接体设计的其它益处是抗体-药物缀合物的希望的高单体比例和极少的聚集。因此，在一个方面中，本发明基于以下重要发现当用于二硫连接的缀合物的聚乙二醇间隔物由2和8个之间的乙烯氧基团组成并且连接的药物数目在3至8 范围内时，其给予抗体-药物缀合物最高的生物学效价或效能并且还给予希望的高单体含量。在一个优选方面中，描述了经由二硫基(-S-S-)连接的细胞毒性药物，其具有带有能够与细胞结合剂反应的官能团的短聚乙二醇间隔物((CH2CH2O)n = 1_14)。在这方面中具体考虑的是式(3)的修饰的细胞毒性化合物或式(3’ )的特定化合物Z-XH-CH2-CH2O-) n-Y-D (3)D-Y-(-CHg-CH2O-) n_X, _Z (3，)
其中Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、非芳族杂环基或芳族杂环基团；I是O或I;以及η是I至14的整数。优选地，η是2至8的整数。在另一个优选方面中，描述了经由二硫基(-S-S-)连接的细胞结合剂和药物的缀合物，其具有带有窄范围的3-8个药物负载的聚乙二醇间隔物((CH2CH2O)η =卜14)，其显示对癌细胞相对高效力的生物学活性并且具有高缀合产率和高单体比以及极少的蛋白质聚集的希望的生化性质。在这方面中具体考虑的是式(4)的细胞结合剂药物缀合物或式(4’ )的特定化合物CB- (XK-^H2-CH2O-V-Y-D) ln (4)[D_Y_ (-CH2-CH2O-) n_X, ]m-CB (4，)其中CB表示细胞结合剂；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；I 是O或 I;m是3至8的整数；以及η是I至14的整数。优选地，m是3至6的整数。此外，优选地，η是2至8的整数。在本发明中，药物是亲脂性分子，当其与细胞结合剂(如抗体)缀合时经常由于蛋白质聚集或沉淀而引起产率的损失。增加每个细胞结合剂的药物的数目通常导致更严重的蛋白质聚集和沉淀，并且进而导致差的单体百分率和低的产率。与具有常规的连接体的典型缀合物性质相比，PEG连接体引起细胞结合剂与药物的缀合物在可用于治疗应用的Img/ ml或更高的高浓度下的单体百分率(> 90%单体)和产率(> 70% )的希望的改善。此外，这些缀合物在40°C下延期储存是稳定的。在本发明中，公开了具有带有反应性基团的硫醚部分的新型的美登木素生物碱， 如由式(5)表示的那些化合物D，-Y’ -V-Q-W-Z，(5)其中V是优选具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选地是具有1-5个碳原子的直链烷基，并且更优选地，V是一碳烷基(CH2)；W是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有2-8个碳原子，更优选地，W是环己基；D’表示带有巯基的美登木素生物碱，并且更优选地，其选自DM1、DM3和DM4 ；Y’表示硫醚键；Q表示任选的芳族或杂环部分，并且优选Q不存在；Z’表示选自(但不限于)以下的胺反应性基团或硫羟反应性基团N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-轻基磺基琥拍酰亚胺酯(N-hydroxysulfosuccinimide ester)、对硝基苯酯或邻硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；马来酰亚胺或齒代乙酰胺，更优选地，Z 是N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺。在另一个实施方案中，带有硫醚部分的反应性美登木素生物碱衍生物由带有巯基的美登木素生物碱(如DMl和DM4)和异双功能交联剂制备。反应顺序由式(6)所示D’ + Y " -V-Q-W-Zj — D，-Y，-V-Q-W-Z，(6)其中V是优选具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选是具有1-5个碳原子的直链烷基，并且更优选地，V是一碳烷基(CH2)；W是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有2-8个碳原子，更优选地，W是环己基；Y"表示选自马来酰亚胺或卤代乙酰胺的硫羟反应性基团，优选是马来酰亚胺；D’表示带有巯基的美登木素生物碱，并且更优选地，其选自DM1、DM3和DM4 ；Y’表示硫醚键；Q表示任选的芳族或杂环部分，并且优选Q不存在；V表示选自但不限于以下的胺反应性基团或硫羟反应性基团N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯酯或邻硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；马来酰亚胺或卤代乙酰胺，更优选地，Z是N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺。Y’表示硫醚键。本发明还提供一种用于制备经由不可裂解的键连接的美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性缀合物的方法，所述方法包括使细胞结合剂与式Z’ -W-Q-V-Y’ -D’化合物反应以提供式CB_(Z" -W-Q-V-Y’ -D’ )m的细胞结合剂缀合物，其中W是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有2-8个碳原子，更优选地，W是环己基；Q表示任选的芳族或杂环部分，并且优选Q不存在；V是优选具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选是具有1-5个碳原子的直链烷基，并且更优选地，V是一碳烷基(CH2)；Y’表示硫醚键；D’表示带有巯基的美登木素生物碱，并且更优选地，其选自DM1、DM3和DM4 ；CB表示选自以下的细胞结合剂抗体、单链抗体、抗体片段、肽、生长因子、激素、维生素或锚蛋白重复蛋白(DARPins),所述细胞结合剂优选是抗体或抗体片段或Darpin ；V表示选自但不限于以下的胺反应性基团或硫羟反应性基团N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯酯或邻硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；马来酰亚胺或卤代乙酰胺，更优选地，Z是N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺；Z "表示硫醚键或酰胺键；所述方法可通过使细胞结合剂(如抗体)在缓冲水溶液(任选含有最多20% 有机溶剂)中的溶液与在有机溶剂或有机溶剂和缓冲水溶液或水的混合物中的式
V-W-Q-V-Y’ -D ’化合物混合并使反应进行5min至72小时来进行。所述缀合物可通过色谱法、渗析法、切向流过滤法或这些的组合进一步纯化在所有方面中，“脂肪族基团”定义为烷基、烯基或炔基。烷基是可为直链或支链的脂肪族烃基，优选在链或环中具有I至20个碳原子，优选具有3至10个碳原子。更优选的烷基在链中具有I至12个碳原子。“支链”表示连接至直链烷基链的一个或多个低级烷基 (如甲基、乙基或丙基)。不例性烧基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戍基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、环戊基和环己基。烯基是含有碳-碳双键的脂肪族烃基并且其可以是直链或支链的，优选在链中具有2至15个碳原子。更优选的烯基在链中具有2至12个碳原子；并且更优选在链中具有约2至4个碳原子。示例性烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基。炔基是含有碳-碳三键的脂肪族烃基并且其可以是直链或支链的，优选在链中具有2至15个碳原子。更优选的炔基在链中具有2至12个碳原子；并且更优选在链中具有 2至4个碳原子。示例性炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2- 丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸炔基。如本文所用，术语“芳基”表示由具有6至14个碳原子(优选具有6至10个碳原子)的芳族单环或多环烃环系统组成的取代或未取代的芳基。示例性芳基包括苯基和萘基。取代基包括(但不限于)烧基、齒素、硝基、氣基、轻基和烧氧基。卤素包括氟、氯、溴和碘原子。氟和氯原子是优选的。如本文所用，术语“杂环基团”是指饱和的、部分不饱和的或不饱和的、非芳香族稳定的3至14元(优选5至10元)单、双或多环，其中环的至少一元是杂原子，或具有至少一个杂原子的芳香族(优选5至10元)单、二或多环。通常杂原子包括(但不限于)氧、 氮、硫、硒和磷原子。优选的杂原子是氧、氮和硫。优选的杂环基团包括(但不限于)吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、环氧乙烷基、四氢!咲喃基、~■氧戍环基、四氧批喃基、~■卩惡烧基、_■氧戍环基、喊唳基、喊嚷基、吗琳基、批喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢噻喃基、二噻烷基、硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢嘧啶基、二氢硫代吡喃基、氮杂环庚烷基、吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基和异噁唑基、吡啶基-N-氧化物以及与苯基缩合所得的稠合系统。由X和Y表不的脂族基、芳基和杂环基团还可具有带电荷的取代基。带电荷的取代基可以是选自(但不限于)羧酸根、磺酸根和磷酸根的带负电荷的取代基，或选自叔氨基或季氨基的带正电的取代基。如本文所用，表达“连接至细胞结合剂”是指经由合适的连接基团或其前体与细胞结合剂连接的包含至少一种药物衍生物的缀合物分子。优选的连接基团是硫羟键或二硫键或其前体。如本文所用，给定基团的“前体”是指可通过任何去保护、化学修饰或偶联反应产生该基团的任何基团。例如，前体可以是适当保护的官能团，示例为硫酯或硫醚为硫羟的前体。如本文所用，术语“反应性官能团”是指胺、硫羟或羟基反应性官能团。换言之，反应性官能团可与存在于细胞结合剂上的胺、巯基(硫羟)或羟基反应。例如，对于胺反应性官能团，所述官能团可以是反应性羧酸酯(包括N-琥珀酰亚胺基酯、N-磺基琥珀酰亚胺基酯、N-苯邻二甲酰亚胺基酯、N-磺基苯邻二甲酰亚胺基酯、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基酯、 2,4- 二硝基苯基酯、3-磺基-4-硝基苯基酯、3-羧基-4-硝基苯基酯、四氟苯基酯)、反应性磺酸衍生物或反应性硫酯以得到酰胺键；对于硫羟反应性官能团，所述官能团可以是马来酰亚胺、卤代乙酰胺或乙烯基砜以得到硫醚键；以及，对于羟基反应性官能团，所述官能团可以是反应性羧酸酯以得到酯键。A.具有亲水性连接体的修饰的药物和修饰的细胞结合剂连接体是能够以稳定的共价方式将药物(如美登木素生物碱)连接至细胞结合剂的任何化学部分。在药物或细胞结合剂保持活性的条件下，连接体可易于进行酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解，或对它们基本上有抗性。图1、2和3示例性地提供本发明的缀合物的结构示意图。在药物和细胞结合剂之间形成连接体的包含亲水性PEG链的合适的交联剂在本领域是熟知的或可商购的(例如来自Quanta Biodesign, Powell, Ohio)。也可使用本领域技术人员已知的标准合成化学技术由本身可商购的PEG来合成合适的含有PEG的交联剂。通过本文所述的方法，药物可与双功能的含有PEG的交联剂反应以得到式(I)的化合物 Z-Xi-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D。例如，含有硫羟的美登木素生物碱药物可与具有PEG间隔物的双马来酰亚胺交联剂反应以得到经由硫醚键与PEG间隔物结合的美登木素生物碱药物(参见例如图13)。随后这个具有PEG间隔物和末端马来酰亚胺基团的修饰的美登木素生物碱可与细胞结合剂反应(例如如图14所示)以提供本发明的式(2)的细胞结合剂-药物缀合物。或者，细胞结合剂可首先在带有胺反应性基团(如N-羟基琥珀酰亚胺酯)的双功能的含有PEG的交联剂的一端进行反应，以得到通过酰胺键与连接体共价结合的修饰的细胞结合剂(参见例如图15)。在下一步中，美登木素生物碱与PEG间隔物的另一端上的马来酰亚胺取代基进行反应，以得到本发明的细胞结合剂-药物缀合物。图16和17通过举例示出PEG交联剂的合成及其通过硫代乙酰胺键与美登木素生物碱的反应。随后将马来酰亚胺取代基并入PEG以使经由硫醚键与细胞结合剂的反应能够进行。或者，如图18所示，首先通过硫醚键将细胞结合剂连接至PEG交联剂。随后使修饰的细胞结合剂与美登木素生物碱药物反应以得到缀合物。同双功能PEG交联剂的合成示于例如在图19中，其中PEG间隔物的两端均含有碘代乙酰胺基部分，碘代乙酰胺基部分能够使细胞毒性药物和细胞结合剂经由硫醚键连接以得到含有亲水性PEG间隔物的缀合物。提供本发明的缀合物的缀合过程示于例如在图20和21中。本领域技术人员将认识到可容易地通过本文所述的方法合成带有各种反应性基团的其它含有PEG的交联剂。例如，带有羟基的药物(如19-去甲基美登木素生物碱(美国专利第4，361，650号))可在碱(如碳酸钾)存在下与碘代乙酰基PEG连接体(图5) 反应以经由醚键连接美登木素生物碱。类似地，含有胺的美登木素生物碱(如美国专利第 7，301,019号所述合成)可在碱(如吡啶或三乙胺)存在下与碘代乙酰基PEG(在图5中示出)反应以提供经由胺键连接至PEG的美登木素生物碱。为了经由酰胺键将药物连接至 PEG，可使羧基PEG(在图5中示出)在缩合剂(如二环己基碳二亚胺)存在下与含有胺的美登木素生物碱反应以提供酰胺结合的PEG-美登木素生物碱。为了经由氨基甲酸酯键将药物连接至PEG间隔物，首先使PEG与双光气反应以提供PEG氯甲酸酯，其随后可在碱(如三乙胺)存在下与含有胺的美登木素生物碱反应以得到氨基甲酸酯连接的PEG-美登木素生物碱。合适的连接体的实例包括具有用于与细胞结合剂反应的N-琥珀酰亚胺基酯或 N-磺基琥珀酰亚胺基酯部分以及用于与药物反应的基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基部分的连接体。PEG间隔物可通过本文所述的方法并入本领域已知的任何交联剂。可与PEG间隔物合并的包含基于马来酰亚胺基部分的交联剂包括(但不限于)N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-I-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其是SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC))、κ -马来酰亚胺基i^一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、Y-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、 ε -马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、Ν-( α -马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6- ( β -马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、Ν-琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(对-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。包含基于卤代乙酰基部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、Ν-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、Ν-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。在本发明的方法中还可使用不含硫原子的其它交联剂。此类连接体可衍生自基于二羧酸的部分。合适的基于二羧酸的部分包括(但不限于)以下通式所示的α，ω-二羧酸HOOC-A ’ ρ_Ε ’ q- (CH2CH2O) nG ’ r_C00H其中A’是具有2至20个碳原子的任选的直链或支链烷基、烯基或炔基，E’是具有3至10个碳原子的任选的环烷基或环烯基，G’是带有6至10个碳原子的任选取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂环基团，其中杂原子选自N、O或S，并且其中P、q和r各为O或1，条件是P、q和r不同时为零，η是I至2000的整数。本文中公开的许多连接体详细描述于美国专利公布第20050169933号。在本发明的另一个方面中，通过使双功能交联剂与细胞结合剂反应来修饰细胞结合剂，从而产生连接体分子与细胞结合剂的共价连接。如本文所用，“双功能交联剂”是将细胞结合剂共价连接至药物(如本文所述的药物)的任何化学部分。在本发明的优选方面中，连接部分的一部分由药物提供。在这方面，药物包含用于将细胞结合剂连接至药物的较大连接体分子的一部分的连接部分。例如，为了形成美登木素生物碱DM1，在美登素的C-3 羟基的侧链被修饰为具有游离的巯基(SH)。美登素的这种硫羟化形式可与修饰的细胞结合剂反应以形成缀合物。因此，最终连接体是由两个部分组装，其中之一是由交联剂提供，而另一个是由DMl的侧链提供。在本发明的另一个方面中，药物通过二硫键连接至细胞结合剂。连接体分子包含可与细胞结合剂反应的反应性化学基团。用于与细胞结合剂反应的优选反应性化学基团是 N-琥珀酰亚胺基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯。此外连接体分子包含反应性化学基团，优选是可与药物反应形式二硫键的二硫代吡啶基。特别优选的连接体分子包括例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见，例如Carlsson等人，Biochem. J. 173 723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(STOB)(参见，例如美国专利第4，563，304号)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(参见，例如 CAS登记号341498-08-6)和其它反应性交联剂(如描述于美国专利第6，913，748号中的那些)，所述美国专利以引用方式整体并入本文。或者，如在美国专利第6，441，163B1号中公开的，可首先修饰药物以引入适于与细胞结合剂反应的反应性酯。这些含有活化的连接体部分的药物与细胞结合剂的反应提供另一种制造细胞结合剂药物缀合物的方法。为了连接siRNA’ s，可通过常用于修饰寡核苷酸的方法将siRNAs连接至本发明的交联剂(参见，例如美国专利公布20050107325和 20070213292)。因此3’ -亚磷酰胺形式或5’ -亚磷酰胺形式的siRNA与带有羟基官能团的交联剂的一端反应以在siRNA和交联剂之间得到酯键。类似地，siRNA亚磷酰胺与带有末端氨基的交联剂的反应使交联剂与siRNA通过胺连接。B.细胞结合剂本发明中使用的细胞结合剂是与癌细胞上的靶抗原特异性结合的蛋白质(例如免疫球蛋白蛋白质和非免疫球蛋白蛋白质)。这些细胞结合剂包括以下-抗体，包括-表面重塑抗体(美国专利第5,639, 641号)；-人源化或完全人抗体(人源化或完全人抗体选自(但不限于)huMy9_6、huB4、 huC242、huN901、DS6、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗、帕妥珠单抗和利妥昔单抗(参见，例如美国专利第5，639，641号、第5，665，357号和第 7，342，110号；美国临时专利申请第60/424，332号、国际专利申请WO 02/16，401、美国专利公布第20060045877号、美国专利公布第20060127407号、美国专利公布第20050118183 号;Pedersen等人,(1994) J MoI. Biol. 235,959-973 ;Roguska等人,(1994)Proceedings of the National Academy of Sciences,第 91 卷，969-973 ;Colomer 等人，Cancer Invest., 19 :49-56(2001) ;Heider 等人，Eur. J. Cancer，31A :2385-2391 (1995) ;Welt 等人，J Clin. Oncol, 12 :1193-1203(1994)和 Maloney 等人，Blood，90 :2188-2195(1997));以及-抗体的表位结合片段，如sFv、Fab、Fab，和 F(ab，) 2 (Parham, J Tmmunol. 131 2895-2902(1983) ；Spring 等人，J Immunol. 113 :470-478(1974) ；Nisonoff 等人，Arch.Biochem. Biophys. 89 :230-244(1960))。其它细胞结合剂包括其它细胞结合蛋白和多肽，其示例为但不限于-锚蛋白重复蛋白(DARPins;Zahnd 等人，J Biol. Chem.，281，46，35167-35175， (2006) ；Binz, H.K., Amstutz, P. &Pluckthun, A. (2005)Nature Biotechnology,23, 1257-1268)或锚蛋白样重复蛋白或合成肽，其描述于例如美国专利公布第20070238667 号；美国专利第 7, 101，675 号；W0/2007/147213 和 W0/2007/062466 中)；-干扰素(例如α、β、Y)-淋巴因子(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6)；-激素(如胰岛素、TRH(促甲状腺素释放激素)、MSH(促黑素细胞激素)、甾体激素(如雄激素和雌激素))；以及-生长因子和集落-刺激因子如EGF、TGF-α、IGF-I,G-CSF, M-CSF和 GM-CSF(Burgess, Immunology Today 5:155-158(1984))。细胞结合剂是抗体时，其与是多肽并且可能是跨膜分子(例如受体)或配体(如生长因子)的抗原结合。示例性抗原包括分子(如肾素)；生长激素(包括人生长激素和牛生长激素)；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白； α -I-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体素； 胰闻血糖素；凝血因子(如因子vmc、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子(von Willebrands factor));抗凝血因子,如蛋白质C ;心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物(如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA));蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和;脑啡肽酶；RANTES(对通常T细胞表达和分泌活化的调节)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白(如人血清白蛋白)；苗勒抑制物质 (Muellerian-inhibiting substance);松弛素A链；松弛素B链;前松弛素；鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质(如β内酰胺酶)；DNase ;IgE ;细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 (CTLA)，如CTLA-4;抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子受体； 蛋白质A或D ;类风湿因子；神经营养因子(如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT4、NT-5或NT-6))，或神经生长因子(如NGF- β );血小板衍生生长因子O3DGF);成纤维细胞生长因子(如aFGF和bFGF);表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)，如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β I、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4 或 TGF- β 5 ； 胰岛素样生长因子-I和-II (IGF-1和IGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白、EpCAM、⑶3、FLT3、PSMA, PSCA, MUC1、MUC16、STEAP, CEA、TENB2、EphA 受体、EphB受体、叶酸受体、F0LR1、间皮素、cripto、av06、整联蛋白、VEGF, VEGFR、运铁蛋白受体、IRTAl、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5 ;CD 蛋白，如 CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、 CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、 CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、 CD152;促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP);干扰素，如干扰素-α、-β和-γ ;集落刺激因子(CSF)(例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF);白细胞介素(IL)， 例如IL-I至IL-10 ;超氧化物歧化酶；Τ细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原， 例如HIV包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如⑶I IaXDl lb、CDl Ic、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ;肿瘤相关抗原，如 HER2、HER3 或 HER4 受体；以及任何以上列出的多肽的片段、抗体拟似物Adnectins (US申请20070082365)，或公开于美国公布第20080171040号或美国公布第20080305044号的结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体，所述美国公布以弓I用方式整体并入本文。此外，与骨髓细胞结合的GM-CSF可用作来自急性骨髓性白血病的患病细胞的细胞结合剂。与活化的T细胞结合的IL-2可用于预防移植体移植排斥，用于治疗和预防移植物抗寄主疾病以及用于治疗急性T细胞白血病。与黑素细胞结合的MSH可用于治疗黑素瘤。 叶酸可用于靶向在卵巢肿瘤和其它肿瘤上表达的叶酸受体。表皮生长因子可用于靶向鳞状细胞癌(如肺及头和颈鳞状细胞癌)。促生长素抑制素可用于靶向成神经细胞瘤和其它肿瘤类型。可分别用雌激素(或雌激素类似物)或雄激素(或雄激素类似物)作为细胞结合剂成功地靶向乳腺癌和睾丸癌。本发明包括的用于抗体的优选抗原包括⑶蛋白，如⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶6、⑶8、 CD11、CD14、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、 CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、 CD138和CD152 ；ErbB受体家族的成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，如 LFA-I、Macl、pi50. 95、VLA_4、ICAM-I、VCAM、EpCAM、α 4/β 7 整联蛋白和 α ν/β 3 整联蛋白，包括其α或β亚类(例如抗⑶I la、抗⑶18或抗⑶I Ib抗体)；生长因子，如 VEGF ;组织因子(TF) JGF-β ；α干扰素(a-IFN);白细胞介素，如IL-8 ;IgE ;血型抗原 Apo2、死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体;CTLA_4 ;蛋白质C等。本文中最优选的靶标是 IGF-IR、CanAg, EphA2、MUCl、MUCl 6、VEGF、TF、CD19、CD20、CD22、CD27、 CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD138、CA6、Her2/neu、EpCAM、CRIPTO (在大部分人乳腺癌细胞中高水平产生的蛋白质)、darpins、αν/β3整联蛋白、αν/β5整联蛋白、α ν/β 6 整联蛋白、TGF-β、CD1 Ia、CD18、Apo2和C242或公开于美国公布第20080171040号或美国公布第20080305044号的与一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体，所述美国公布以引用方式整体并入本文。本发明包括的用于抗体的优选抗原还包括⑶蛋白，如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、⑶20、 CD27、CD34、CD37、CD38、CD46、CD56、CD70 和 CD 138 ；ErbB 受体家族的成员，如 EGF 受体、 HER2、HER3 或 HER4 受体；细胞粘附分子如 LFA-I、Macl、pl50. 95、VLA-4, ICAM-I, VCAM、 EpCAM、α4/β7整联蛋白和αν/β3·联蛋白，包括其α或β亚类(例如抗⑶11a、抗⑶18 或抗⑶IIb抗体)；生长因子，如VEGF ;组织因子(TF) JGF-β ；α干扰素(a-IFN);白细胞介素，如IL-8 ；IgE ;血型抗原Apo2、死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4 ;蛋白质C等。本文中最优选的靶标是IGF-IR、CanAg、EGF-R、EGF-RvIII、EphA2、 MUC1、MUC16、VEGF、TF、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、 CD138、CA6、Her2/neu、CRIPT0 (在大部分人乳腺癌细胞中高水平产生的蛋白质)、α ν/ β 3整联蛋白、αν/β5 整联蛋白、TGF-β、CD1 la、CD18、Apo2、EpCAM 和 C242。单克隆抗体技术允许以单克隆抗体形式生产特异性细胞结合剂。本领域特别熟知的是用于制造通过用研究中的抗原(如完整靶细胞、从靶细胞分离的抗原、全病毒、减毒全病毒和病毒蛋白质(如病毒外壳蛋白))免疫小鼠、大鼠、仓鼠或任何其它哺乳动物生产单克隆抗体的技术。也可使用敏化人细胞。另一种制造单克隆抗体的方法是使用sFv (单链可变区)，特别是人sFv的噬菌体库(参见，例如Griffiths等人，美国专利第5，885，793号； McCafferty 等人，WO 92/01047 ；Liming 等人，WO 99/06587)。适当的细胞结合剂的选择是取决于要靶向的特定细胞群体的选择事项，但一般来讲，单克隆抗体和其表位结合片段是优选的(如果有适当的可用)。例如，单克隆抗体My9是鼠IgG2a抗体，其对急性骨髓性白血病(AML)细胞上发现的CD33抗原有特异性(Roy等人，Blood 77 :2404-2412(1991))并且可用于治疗AML患者。类似地，单克隆抗体抗B4是鼠IgGi，其与B细胞上的⑶19抗原结合(Nadler等人，J Immunol. 131 :244-250 (1983))，并且如果靶细胞是B细胞或在诸如非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴母细胞白血病中表达该抗原的患病细胞，则可以使用所述抗体。抗体N901是鼠单克隆 IgGi抗体，其与在小细胞肺癌细胞和其它神经内分泌起源的肿瘤细胞上发现的CD56结合 (Roy 等人，J Nat. Cancer Inst. 88 :1136-1145 (1996)) ;huC242 是与 CanAg 抗原结合的抗体；曲妥珠单抗是与HER2/neu结合的抗体；以及抗EGF受体抗体与EGF受体结合。C.药物在本发明中使用的药物是能够连接至细胞结合剂的细胞毒性药物。合适的药物的实例包括美登木素生物碱、DNA结合药物(如CC-1065和其类似物)、加利车霉素、阿霉素及其类似物、长春花生物碱、念珠藻环肽(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、阿里他汀(auristatin)及其类似物、tubulysin、埃博霉素(epothilones)、紫杉烧和siRNA。优选的美登木素生物碱是描述于美国专利第5，208, 020号；第5，416, 064号；第 6，333，410 号；第6，441，163 号；第 6，716，821 号；第1 39，151 号和第 7，276，497 号的那些。 优选的CC-1065类似物是描述于美国专利第5，475，092号；第5，595，499号；第5，846，545 号；第6，534，660号 ’第6，586，618号；第6，756，397号和第7，049，316号的那些。优选的阿霉素及其类似物是描述于美国专利第6，630, 579号的那些。优选的紫杉烷是描述于美国专利第 6，340，701 号；第 6，372，738 号；第 6. 436，931 号；第 6，596，757 号；第 6，706，708 号；第7，008，942号；第7，217，819号和第7，276，499号的那些。加利车霉素描述于美国专利第5，714，586号和第5739，116号。长春花生物碱化合物、多拉司他汀化合物和念珠藻环肽化合物在W001/24763中详细描述。阿里他汀包括阿里他汀E、阿里他汀EB(AEB)、阿里他汀EFP(AEFP)、单甲基阿里他汀 E(MMAE)并且描述于美国专利第 5，635，483 号、Int. J. Oncol. 15 :367-72(1999)； Molecular Cancer Therapeutics,第 3 卷，第 8 期，921-932 页(2004);美国申请第 11/134826号，美国专利公布第20060074008号、第2006022925号。Tubulysin化合物描述于美国专利公布第20050249740号。念珠藻环肽化合物描述于美国专利第6，680, 311号和第6，747，021号。埃博霉素描述于美国专利第6，956，036号和第6，989，450号。SiRNA在以下编号的美国专利公布中详细描述20070275465、20070213292、 20070185050、20070161595、20070054279、20060287260、20060035254、20060008822、 20050288244,20050176667ο类似物和衍生物细胞毒剂领域的技术人员将容易理解本文中描述的每一种细胞毒剂可以以所得化合物仍然保持起始化合物的特异性和/或活性的方式进行修饰。本领域技术人员还将理解许多这些化合物可用来代替本文所述的细胞毒剂。因此，本发明的细胞毒剂包括本文所述的化合物的类似物和衍生物。细胞结合剂可通过前述的方法(美国专利第6，013，748号；第6，441，1631号和第 6，716，821号；美国专利公布第20050169933号和W02006/034488 A2)与细胞毒性药物缀
口 OD.治疗用途本发明的细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)还可与化学治疗剂组合使用。此类化学治疗剂描述于美国专利第7，303, 749号。本发明的细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)可以体外、体内和/或离体施用，以治疗患者和/或调节选择的细胞群体的生长，所述细胞群体包括例如，肺癌、血癌、 血浆癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌和淋巴器官癌；自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和多发性硬化；移植排斥，如肾移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主病；病毒感染，如CMV感染、HIV感染和AIDS ；以及寄生虫感染，如贾第虫病、阿米巴病、血吸虫病等。 优选地，体外、体内和/或离体施用本发明的免疫缀合物和化学治疗剂以治疗患者的癌症和/或调节癌细胞的生长，所述癌细胞包括例如，血癌、血浆癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌和淋巴器官癌；更优选的是肺癌、结肠癌、前列腺癌(colon prostrate)、血浆癌、血癌或结肠癌。在最优选的方面中，所述癌症是多发性骨髓瘤。“调节选择的细胞群体的生长”包括抑制选择的细胞群体(例如多发性骨髓瘤细胞群体，如M0LP-8细胞、0PM2细胞、细胞等)的增殖防止分裂产生更多细胞；例如与未经治疗的细胞相比降低细胞分裂的增长速度；杀灭选择的细胞群体；和/或防止选择的细胞群体(如癌细胞)转移。选择的细胞群体的生长可以体外、体内或离体调节。在本发明的方法中，可以体外、体内或离体施用细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)。细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)可以与合适的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂(其是众所周知的)一起使用并且可以由本领域技术人员按照临床表现根据确定。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括(I)PH值约6. 5的 Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，其可含有约lmg/mL至25mg/mL人血清白蛋白，0)0. 9%盐水 (0.9% w/ν NaCl)，以及(3)5% (w/v)葡萄糖。本文所述的化合物和组合物可以适当的形式施用，优选肠胃外施用，更优选静脉注射施用。对于肠胃外施用，所述化合物或组合物可以是含水或无水无菌溶液、混悬液或乳浊液。丙二醇、植物油和可注射的有机酯(如油酸乙酯)可以用作溶剂或媒介物。所述组合物还可以含有佐剂、乳化剂或分散剂。所述组合物还可以是可溶解或分散在无菌水或任何其它可注射的无菌介质的无菌固体组合物形式。本文所述的细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)的“治疗有效量”是指用于调节选择的细胞群体的生长和/或治疗患者疾病的给药方案，并且根据多种因素选择， 这些因素包括患者的年龄、体重、性别、饮食和医疗条件、疾病的严重程度、施用途径和药理学考虑因素(如使用的特定化合物的活性、效能、药代动力学和毒理学曲线)。“治疗有效量”还可以通过参考标准医学书(如Physicians Desk Reference 2004)确定。患者优选是动物，更优选是哺乳动物，最优选是人。患者可以是男性或女性，并且可以是婴儿、儿童或成人。细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)的合适的给药方案的实例如下。可以每天施用缀合物持续约5天，或者每天单次静脉注射(i. v.)进行约5天，或者持续输液约 5天。或者，可每周一次施用缀合物持续6周或更长。作为另一种选择，可每两周或三周施用一次缀合物。单次剂量在约50至约400mL生理盐水中给予，其中可向生理盐水中添加约5至约IOmL人血清白蛋白。持续输液以每M小时期间在约250至约500mL生理盐水中给予，其中可向生理盐水中添加约25至约50mL人血清白蛋白。剂量将是约IOpg至约 1000mg/kg每人，静脉注射(约IOOng至约100mg/kg的范围)。在治疗之后的约一至约四周，患者可以接受第二疗程。关于施用途径、赋形剂、稀释剂、剂量和时间的具体临床方案可由本领域技术人员按照临床表现根据来确定。所述化合物和缀合物(例如免疫缀合物)还可以用于制造对治疗或减轻病症(如以细胞的异常生长为特征的病症(例如癌症))的严重程度有用的药物。本发明还提供药物试剂盒，其包含一个或多个装有本发明的药物化合物和/或组合物一种或多种成分(包括一种或多种免疫缀合物和一种或多种化学治疗剂)。此类试剂盒还可包括(例如)其它化合物和/或组合物，用于施用化合物和/或组合物的装置和由管制药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的书面说明书。癌症治疗及其剂量、施用途径和推荐的用法在本领域是已知的并且已描述于文献(如Wiysician，s Desk Reference (PDR))中。PDR公开了在各种癌症治疗中使用的药剂的剂量。治疗有效的这些上述化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定癌症、疾病的程度和本领域医师熟知的其它因素并且可以由医师决定。例如，2006版的 Physician's Desk Reference公开了泰索帝(Taxotere，参见四47页)是微管蛋白解聚的抑制剂；阿霉素(参见786页)、盐酸阿霉素脂质体(Doxi 1，参见3302页)和奥沙利钼(参见四08页)是DNA相互作用剂，伊立替康(Irinotecal，参见沈02页)是拓扑异构酶I抑制剂，爱必妥(Erbitux，参见937页)和特罗凯(Tarceva，参见M70页)与表皮生长因子受体相互作用。PDR的内容以引用方式整体明确地并入本文。本领域技术人员可以使用一种或多种以下参数查阅PDR以确定可以根据本发明的教导使用的化学治疗剂和缀合物的给药方案和剂量。这些参数包括1.综合索引a)通过制造商b)产品(通过公司名称或商标药物名称)c)分类索引(例如“抗组胺剂”、“DNA烷化剂”、紫杉烷等)d)总索引/化学索引(无商标的普通药物的名称)2.药物的彩色图像3.产品信息，与FDA标签一致a)化学信息b)功能/作用c)适应症和禁忌症
d)试验研究、副作用、警告上述参考文献、专利申请和专利每一篇的内容(非限制性地包括说明书、权利要求书和摘要以及其任何图、表或附图)均以全文引用方式整体明确地并入本文。E.具有带有反应性基团的硫醚部分的美登木素生物碱的合成具有带有反应性基团的不可裂解的硫醚部分的新型的美登木素生物碱是式(5) D’ -Y’ -V-Q-W-Z'的化合物。用于与细胞结合剂反应的化学基团Z’包括但不限于N-琥珀酰亚胺基酯、N-磺基琥珀酰亚胺基酯、五氟苯酯、四氟磺基苯基和硝基苯酯。在本文中描述了制备这些化合物的方法。带有巯基的美登木素生物碱经由不可裂解的硫醚键与带有反应性基团的异双功能交联剂共价连接并且在与细胞结合剂缀合之前分离。不可裂解的连接体是能够以稳定、共价方式将细胞毒性药物连接至细胞结合剂的任何化学部分。不可裂解的连接体实质上对酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解有抗性。不可裂解的连接体的实例包括具有用于与美登木素生物碱反应的N-琥珀酰亚胺基酯或N-磺基琥珀酰亚胺基酯部分和基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分的连接体。包含基于马来酰亚胺基的部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其是SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC))、 κ -马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ -马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε -马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N- ( α -马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-( β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、Ν-琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(对-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯 (PMPI)。包含基于卤代乙酰基的部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和 N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。可在本发明中用以制造带有可共价连接至细胞结合剂的硫醚部分的反应性美登木素生物碱衍生物的美登木素生物碱在本领域是熟知的并且可根据已知方法从天然来源分离或根据已知方法合成制备。具有带有反应性基团的硫醚部分的美登木素生物碱的合成可参考图1-4所述，其中制备了带有反应性基团的带有硫醚的美登木素生物碱。本发明的代表性化合物由含有硫羟的美登木素生物碱制备DM1，称为N2’-去乙酰基-N2’ - (3-巯基-1-氧代丙基)-美登素，由结构式⑴表示；和DM4，称为N2’ -去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素，由以下所示的结构式(2)表示
权利要求
1.一种式⑴或⑴的化合物Z-X,-(-CH2-CH2-O-)n_Yp-D (I)D-Yp- (-CH2-CH2-O-) n-Xi-Z (V)其中Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；I为O或I ;P为O或I ;以及 η为I至2000的整数。
2.—种式(2)或(2’)的细胞结合剂细胞毒性药物缀合物CB- [X，- (-CH2-CH2-O) n-Yp-D] m (2)[D-Yp-C-CH2-CH2-O-V-XJln-CB (T)其中CB表示细胞结合剂；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；I为O或I ;P为O或I ;以及 m为2至15的整数；以及 η为I至2000的整数。
3.一种式(3)或(3’)化合物Z-XK-CH2-CH2O-V-Y-D (3)D-Y- (-CH2-CH2O-) n-Xi-Z (3，)其中Z表示可与细胞结合剂形成酰胺或硫醚键的反应性官能团；D表示药物；X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、非芳族杂环基或芳族杂环基团；I为O或I ;以及 η为I至14的整数。
4.一种式(4)或(4’ )的细胞结合剂细胞毒性药物缀合物
5.根据权利要求2或4所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗体、单链抗体、优先与靶细胞结合的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、与靶细胞特异性结合的片段、抗体模拟物adnectins、DARPins、淋巴因子、细胞因子、激素、生长因子、酶或营养转运分子。
6.根据权利要求2或4所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是表面重塑单克隆抗体、表面重塑单链单克隆抗体或优先与靶细胞结合的表面重塑单克隆抗体片段。
7.根据权利要求2或4所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是人源化单克隆抗体、人源化单链单克隆抗体或优先与靶细胞结合的人源化单克隆抗体片段。
8.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述抗体是嵌合抗体、嵌合抗体片段、结构域抗体或其结构域抗体片段。
9.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述抗体是MY9、抗B4、EpCAM,⑶2、⑶3、⑶4、 CD5、CD6、CDlI、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD79、 CD105、CD138、EphA 受体、EphB 受体、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、间皮素、cripto、α νβ 3 整联蛋白、ανβ5整联蛋白、ανβ6整联蛋白或C242。
10.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述抗体是选自My9-6、B4、C242、N901、DS6、 EphA2受体、⑶38、IGF-IR, CNTO 95、B-B4、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗或利妥昔单抗的人源化抗体、人抗体或表面重塑抗体。
11.根据权利要求2或4所述的缀合物，其中所述细胞结合剂与选自以下的靶细胞结合肿瘤细胞；病毒感染的细胞、微生物感染的细胞、寄生虫感染的细胞、自身免疫细胞、活化细胞、骨髓细胞、活化T-细胞、B细胞或黑素细胞；表达16 -11 、0&1^846 1 、1^(1、1^(16、 VEGF、TF、MY9、抗 B4, EpCAM, CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CDlI、CDlla、CD18、CD19、CD20、CD22、 CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、CD79、CD 105、CD 138、EphA 受体、FphB 受体、EGFRvIII、HER2/neu、HER3、间皮素、cripto、ανβ3 整联蛋白、ανβ5 整联蛋白、ανβ6 整联蛋白、Αρο2和C242抗原的一种或多种的细胞；或表达胰岛素生长因子受体、表皮生长因子受体和叶酸受体的细胞。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述肿瘤细胞选自乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状细胞癌细胞、小细胞肺癌细胞和睾丸癌细胞。
13.一种药物组合物，其包含有效量的根据权利要求2或4所述的药物-细胞结合剂缀合物、其药学上可接受的盐或溶剂化物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.一种用于治疗对用所述方法的治疗敏感的疾病的方法，所述方法包括对有需要的患者肠胃外施用有效剂量的根据权利要求2或4所述的缀合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥、 移植物抗宿主疾病、病毒感染和寄生虫感染。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤选自肺癌、血癌、血浆癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌和淋巴器官癌的一种或多种。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤表达以下的一种或多种IGF-IR、 FOLRl、CanAg, EGFR、EphA2、MUC1、MUC16、VEGF、TF、MY9、抗 B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、 CD6、CD11、CDlla、CD18、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、 CD70、CD79、CD105、CD138、EphA, EphB, EGFRvIII、HER2/neu，HER3、间皮素、cripto、ανβ3 整联蛋白、ανβ5整联蛋白、ανβ6整联蛋白、Αρο2和C242抗原。
18.一种具有带有由式(5)所示的反应性基团的硫醚部分的美登木素生物碱D， -Y， -V-Q-W-Z， (5)其中D’表示带有巯基的美登木素生物碱；V是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；W是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；Y’表示硫醚键；Q表示任选的芳族或杂环部分；以及V表示胺或巯基反应性基团。
19.根据权利要求18所述的美登木素生物碱，其中所述带有巯基的美登木素生物碱是 #’-去乙酰基-#’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DMl)或Ν2’-去乙酰基-Ν2’-(4-巯基-4-甲基-I-氧代戊基)美登素(DM4)。
20.根据权利要求18所述的美登木素生物碱，其由以下结构式表示
21.根据权利要求18所述的美登木素生物碱，其由以下结构式表示
22.根据权利要求18所述的美登木素生物碱，其由以下结构式7a或7b表示
23.一种用于制备根据权利要求18所述的美登木素生物碱的方法，其包括使含有硫羟的美登木素生物碱与异双功能交联剂反应，所述反应由以下化学方程式表示
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述带有巯基的美登木素生物碱是N2’-去乙酰基-N2’ -(3-巯基-I-氧代丙基)_美登素(DMl)或N2’ -去乙酰基-N2’ -(4-巯基-4-甲基_1_氧代戍基)美登素(DM4)。
25.根据权利要求23所述的方法，其中Y"是马来酰亚胺或卤代乙酰胺。
26.一种用于制备经由不可裂解的键连接的美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性缀合物的方法，所述方法包括使细胞结合剂与式Z’ -W-Q-V-Y’ -D’化合物反应以提供式 CB-(Z" -W-Q-V-Y’ -D’ )m的细胞结合剂缀合物，其中，V表示胺或巯基反应性基团；W是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；Q表示任选的芳族或杂环部分；V是具有I至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；Y’表示硫醚键；D’表示带有巯基的美登木素生物碱；CB表示细胞结合剂；Z"表示硫醚键或酰胺键；以及m是2至8的整数。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述带有巯基的美登木素生物碱是N2’-去乙酰基-N2’ -(3-巯基-I-氧代丙基)_美登素(DMl)或N2’ -去乙酰基-N2’ -(4-巯基-4-甲基_1_氧代戍基)美登素(DM4)。
28.根据权利要求26所述的方法，其中CB是抗体、单链抗体或抗体的抗原结合片段。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中式CB-(Z"-W-Q-V-Y’ _D，)m的所述细胞结合剂缀合物是纯化的。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂和式V-W-Q-V-Y’ -D’的所述化合物通过使所述细胞结合剂在任选含有最多20%有机溶剂的缓冲水溶液中的溶液与式V -W-Q-V-Y’ -D’的化合物在有机溶剂或有机溶剂和缓冲水溶液或水的混合物中的溶液混合并使反应进行5分钟至72小时来反应。
31.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过色谱法、渗析法、 切向流过滤法或所述方法的组合来纯化。
32.—种由以下结构式表示的化合物
33. 一种由以下结构式表示的化合物
全文摘要
用于将药物与细胞结合剂结合的连接体通过并入聚乙二醇间隔物而被修饰为亲水性连接体。所述细胞结合剂-药物缀合物在各种癌细胞类型中的效价或效能意外地增加若干倍，所述癌细胞类型包括在细胞表面表达低数量抗原的癌细胞或对治疗有抗性的癌细胞。本发明还提供了一种用于制备美登木素生物碱的方法，所述美登木素生物碱带有硫醚部分和允许将所述美登木素生物碱在基本上单个步骤中连接至细胞结合剂的反应性基团。
文档编号C07D267/22GK102596922SQ200980162373
公开日2012年7月18日 申请日期2009年10月6日 优先权日2009年10月6日
发明者R·V·J·查理, R·辛, S·D·威尔豪姆 申请人:免疫基因公司