专利名称：一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白及其应用的制作方法
一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白及其应用
技术领域：
本发明涉及一种预防和治疗感染性炎症的药物，更具体地讲，涉及一种髓样细胞 表达激发受体-1的重组融合蛋白。
背景技术：
髓样细胞表达的激发受体(TREM)是免疫球蛋白超家族中的一个受体家族。 TREM-I于2001年在NATURE上首次报道，加深了人们对炎症反应的启动和发展过程的认识。 TREM-I能识别细菌、真菌这些病原体的表面受体，主要分布在外周血中性粒细胞和单核细 胞亚群，还选择性地表达在肺泡、肠液及其它体液的吞噬细胞上。TREM-I属跨膜糖蛋白，具 有胞外单链免疫球蛋白可变区(IgV)，含阳离子化赖氨酸残基的跨膜区和较短胞浆内尾段 的保守结构。TREM-IIgV能特异性与其配体或单克隆抗体结合，产生活化效应，跨膜区的赖 氨酸残基，可与接头蛋白DAP12跨膜区内的带负电荷的天冬氨酸相耦联，并通过DAP12胞浆 区中的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)来传递活化信号，转录编码促炎因子和细胞表面 分子的基因，最终导致细胞大量分泌促炎因子。文献报道，当革兰阳性菌、阴性菌或真菌所致的急性炎症和肉芽肿性炎症中，以及 内毒素(LPQ或其他微生物导致的感染性休克中，感染组织中渗出的中性粒细胞和单核细 胞表面的TREM-I表达明显升高。相反，对于那些非感染引起的免疫复合物炎症反应，如鳞 癣、溃疡性结肠炎和脉管炎等，则不会出现TREM-I的表达增加。在体外，用活细菌或其胞壁 成分与中性粒细胞和单核细胞共同培养，可诱导免疫细胞表面的TREM-I表达上调。生物学 实验证实，假手术组外周血中单核细胞和中性粒细胞、腹膜和脾脏的巨嗜细胞的TREM-I表 达没有明显改变。而脓毒血症组，所有效应细胞的TREM-I均出现特征性高表达(升高3到4 倍)。在脓毒性休克的病人，也证实了单核细胞TREM-I表达的不断增高。THE NEW ENGLAND 医学杂志上报道了 148例接受了机械通气或可疑社区获得性肺炎的病人，通过Western的 方法，快速检测患者支气管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-I (sTREM-1)，有助于确诊或排除细 菌性或真菌性肺炎，支气管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-I可作为独立诊断肺炎的金标准。小鼠体内TREM-I作用机制的研究证明，TREM-I扩大了细菌及真菌所致感染的炎 症反应效应，与下游细胞因子之间形成一个正反馈的自分泌调节回路，影响机体的天然免 疫，促使炎症反应增强放大。TREM-I介导的信号转导通路在炎症反应的级联放大和脓毒症 的发生中起着关键性的作用。国外学者们的大量基础研究，使TREM-I在炎症反应中的表达和诊断价值日益得 到重视，成为炎症反应的分子治疗靶点。小鼠脓毒性休克模型的实验表明，阻断TREM-I的 信号转导通路，可以明显降低小鼠的死亡率。根据TREM属于IgSF，TREM-I与IgG具有一定 的同源性，有构想TREM-I与IgG融合蛋白综合具有此两种免疫球蛋白的特性，这种融合蛋 白能与免疫细胞表面的TREM-I竞争性结合TREM-I配体，从而起到抑制活化信号的诱骗受 体的作用，是目前TREM研究的热点。美国专利US 6420526 “186个分泌蛋白质”要求保护未指明而且未加例证的分离的TREM-I片段，其包含人TREM-I至少30个连续的氨基酸，没有提供与这些片段相关的生 物学数据。申请号200510104693. X公布了一种“治疗性肽和方法”，提供了一种多肽，其序 列为天然TREM-I蛋白序列中的一个或多个部分序列，该肽段在生物化学研究所定购并人 工合成。没有提供TREM-I重组融合蛋白的序列和制备工艺，没有提供TREM-I重组融合蛋 白治疗感染性炎症疾病的实施例。感染性疾病是医学和兽医界最常见的疾病之一，各种革兰阳性菌、阴性菌或真菌 所致病种不胜枚举，现多采用以抗生素治疗为主的综合治疗方案。天然免疫应答是机体抗 感染的第一道防线，切断病原体和受体的识别，阻断炎症反应的信号转导通路，在解决感染 性炎症疾病方面有巨大潜力。
发明内容本发明的目的是提供一种小鼠或人的髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白。本发明的第二个目的在于提供一种髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的制 备方法。本发明的第三个目的在于提供一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在 制备治疗动物或人感染性炎症疾病药物中的应用。为实现上述目的，本发明公开以下技术方案一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，具有与天然TREM-I相似的结构， 通过酶切位点连接TREM-I胞外区段和IgGFc段，所述融合蛋白具备两种免疫球蛋白的特 性，能与免疫细胞表面的TREM-I竞争性结合TREM-I配体。小鼠髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO=I所示。人髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 3所示。此重组融合蛋白的基因序列包括TREM-I胞外区段和人IgGFc段的功能区段，并由 酶切位点连接。此酶切位点可为任意一种或多种酶切位点或保护性碱基。在TREM-I胞外 区段或人IgGFc区段中增加或删减序列，能实现该区段功能，能实现本发明的目的，得到与 本发明公开的序列大致相似的基因序列的，都应视为本发明的保护范围。髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白的制备方法，包括(1)克隆小鼠 TREM-I胞外区域和人IgG Fc段，将IgG Fc段基因插入TREM-I胞外区域基因的下游位点得 到融合片段；(2)将所述融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建重组原核表达质 粒；C3)构建的重组原核表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导表达，对蛋白表达产物进行 纯化，应用SUMO蛋白酶，其特征在于步骤O)中所述表达载体为pet-28a-HiS-Sum0 ；步骤(3)中所述蛋白表达时，IPTG 37°C诱导4_6小时，优选4小时。步骤(3)中所述蛋白表达的条件为(1)将新抽的质粒转入BL21(DE3)中，37°C培 养过夜；(2)挑取单克隆，37°C LB培养10小时；(3)转入到500ml LB培养基中，22°C培养 3-4小时，菌体浓度达到0. 6后加入IPTG，终浓度为10 μ Μ,培养4小时;步骤(3)中所述蛋白产物纯化，酶切去除SUMO蛋白酶的条件为温度4-10°C，时 间12-16小时；优选4°C酶切12小时。髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗动物感染性炎症疾病药物 中的应用。
髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗人感染性炎症疾病药物中 的应用。本发明的积极效果本发明人提供的利用基因工程技术构建表达的TREM-I重组融合蛋白，相对于人 工合成肽段，具有可增加蛋白质分子在血液中半衰期，便于纯化检测，兼具TREM-I与IgG 融合蛋白两种免疫球蛋白的特性，生物功能多样等特点。可溶性TREM-1/IgG结构与天然 TREM-I结构相似，能与免疫细胞表面的TREM-I竞争性结合TREM-I配体，从而起到抑制活化 信号的诱骗受体的作用，阻断TREM-I介导的炎症信号转导通路。本发明公开的蛋白基因易于修饰和改造、稳定性好、制备简单、疗效显著，对感染 性炎症疾病具有很高的预防和治疗作用。
图1为小鼠TREM-1/IgG重组质粒的构建策略图；图2为人TREM-1/IgG重组质粒的构建策略图；图3为目的片段基因克隆质粒酶切鉴定图其中M为标准参照物，图3-1，-2，_3 分别为质粒PMD18-T/人TREM，pMD18-T/小鼠TREM，pMD18_T/人IgGFc酶切鉴定图；图3_1 中M为DNA分子量标准，1为质粒pMD18-T/人TREM，2为EcoRV/BamH I双酶切质粒；图3_2 中M为DNA分子量标准，1为EcoR I/BamH I双酶切质粒；图3_3中M为DNA分子量标准，1 为质粒pMD18-T/人IgG Fe，2为BamH I/Xho I双酶切质粒；图4中，图4-1为重组质粒pet28a/人TREM-IgG酶切鉴定图；图4_2为重组质粒 pet28a/小鼠TREM-IgG酶切鉴定图；其中M为DNA分子量标准，1为BglIlAho I双酶切质 粒；图5为表达产物小鼠TREM-1/IgG融合蛋白的SDS-PAGE分析M为蛋白质分子量标 准，1为空载体pet-^a-His-sumo表达的蛋白，2为可溶部分纯化后的小鼠TREM-1/IgG融 合蛋白(含载体上sumo)，3为将sumo tag酶切后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白；图6为表达产物人TREM-1/IgG融合蛋白的SDS-PAGE分析M为蛋白质分子量标 准；图6-1中1，2，3分别为对照菌液上清，未诱导菌液上清，IPTG37度诱导4小时菌液上清； 图6-2中1，2，3分别为诱导菌液上清，穿柱液和纯化洗脱后的人TREM-1/IgG融合蛋白；图7为表达产物小鼠TREM-1/IgG融合蛋白的flfestern Blot检测1为可溶部分 纯化后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白(含载体上sumo)，2为空载体petj8a-HiS-Sum0表达 的蛋白，3为将sumo tag酶切后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白；图8为肺脏组织病理改变；图9为胰腺组织病理改变。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案做详细说明。一、制备方法实施例1、小鼠髓样细胞表达激发受体-1 (TREM-I)重组融合蛋白制备方法利用分子克隆和基因重组技术，从重症感染性小鼠的外周血中，克隆小鼠TREM-I胞外区域，从健康志愿者的外周血中，克隆人IgG Fc段，再分别采用酶切和PCR方法将IgG Fc段基因插入TREM-I胞外区域基因的下游位点，然后将融合片段插入原核表达载体的相 应位点上，构建重组原核表达质粒。将上述构建的重组表达质粒分别转化受体菌，经IPTG 诱导表达，对表达产物进行纯化，SDS-PAGE分析表达产物，并对其进行体外活性测定和模型 动物感染性炎症治疗。(1)基因克隆健康雄性昆明种小鼠，清洁级，体重20 22g，由第二军医大学动物 中心提供。造模前禁食12h，自由饮水。按照4g/kg的剂量，腹腔注射20% L-精氨酸，间隔 一小时，重复注射一次。造模后24h经心脏采血，抽取新鲜抗凝血Iml ；取健康志愿者的外周 新鲜抗凝血各5ml ；上述两个新鲜抗凝血，均在室温4小时内抽提总mRNA，在反转录酶的作 用下，合成cDNA，经PCR分别扩增，获得小鼠TREM-I胞外区和人IgG-Fc段，并经这两个基因 分别克隆入PMD-18T载体，经酶切鉴定阳性克隆，并经测序鉴定重组T载体质粒(pMD-18T/ 小鼠 TREM 和 pMD-18T/ 人 IgG-Fc)。(2)表达载体构建利用限制性内切酶位点EcoRI和BioI，双酶切原核表达 载体pGEX4T-l ；pMD-18T/小鼠TREM胞外区质粒经EcoRI/BamHI双酶切；pMD_18T/人 IgG-Fc质粒经BamHIAhoI双酶切；酶切后的三片段由T4DNA1 igase酶连接，连接产物 应用CaC12法转化感受态细胞，抽提鉴定重组质粒pGEX4T-l/小鼠TREMl_IgG。选择自 构建载体pet-^a-His-sumo为表达载体，选择同尾酶BglII (AGATCT)，使用上游引物 BglII+ :tcagagatcatggaagtcaaagctgccatt，其序列表如SEQ ID NO :5所示；下游引物T7- tgctagttattgctcagcgg，其序列表如 SEQ ID N0:6 所示。从 pGEX4T_l/小鼠 TREMl-IgG 质 粒上PCR扩增目的片段，Bglll+Xhol双酶切以后接入到pet28a-HiS-Sum0，构建表达重组蛋 白的原核表达质粒peU8a/小鼠TREM-IgG。经测序鉴定无误。(3)蛋白表达纯化该克隆转入BL21以后，IPTG 37°C诱导4_6小时，尤其是诱导4 小时，可以很好地表达，40%左右为包涵体部分，经优化表达条件，可溶部分超过20mg/L LB 培养基。通过以下方法优化表达条件将新抽的质粒转入BL21(DE3)中，37°C培养过夜；挑 取单克隆，37°C LB培养10小时；转入到500ml LB培养基中，22°C培养3_4小时，菌体浓度 达到0. 6后加入IPTG(终浓度10 μ Μ)培养4小时；收菌，超声破菌，电泳比较全细胞以及上 清的目标蛋白的含量。纯化方法如下1L培养菌体，超声破菌于40ml PBS中以后，离心取上清，使用 His-affinity-resin Iml层析柱纯化；上样完全以后，使用上样缓冲液充分冲洗上样柱 (40倍柱体积)，再使用20mM咪唑洗柱(20倍柱体积)，40mM咪唑洗柱(10倍柱体积)； 使用200mM咪唑洗脱样品，收集洗脱峰，电泳观察纯度；集中纯度符合要求的样品，使用 Millipore超滤管浓缩样品，切换缓冲液到PBS中；使用Bradford方法测定蛋白浓度；初步 纯化后的融合蛋白为小鼠TREMl-IgG (含载体上SUMO蛋白)，应用SUMO蛋白酶，4°C _10°C酶 切12-16小时可以特异性地去除SUM0，尤其是在4°C酶切12小时，从而得到不含任何标签 的重组蛋白。包涵体部分，可使用以下方法纯化菌体沉淀使用8M尿素溶解，高速离心，取 上清，用PBS稀释4倍，将稀释后的上清高速离心，去除沉淀，然后使用His-affinity-Resin 纯化，所有纯化Buffer中均包含2M尿素。纯化后的样品经复性，浓缩PBS透析过夜，离心 弃取沉淀，上清部分超滤管浓缩定蛋白浓度。(4)蛋白表达鉴定=SDS-PAGE分析表达产物，对纯化后的表达产物行WesternBlot和ELISA检测，证实为目的蛋白。2、人髓样细胞表达激发受体-1 (TREM-I)重组融合蛋白制备方法利用分子克隆和基因重组技术，从重症感染性小鼠的外周血中，克隆小鼠TREM-I 胞外区域，从健康志愿者的外周血中，克隆人IgG Fc段，再分别采用酶切和PCR方法将IgG Fc段基因插入TREM-I胞外区域基因的下游位点，然后将融合片段插入原核表达载体的相 应位点上，构建重组原核表达质粒。将上述构建的重组表达质粒分别转化受体菌，经IPTG 诱导表达，对表达产物进行纯化，SDS-PAGE分析表达产物，并对其进行体外活性测定和模型 动物感染性炎症治疗。人髓样细胞表达激发受体-I(TREM-I)重组融合蛋白制备方法的步骤，同小鼠样 细胞表达激发受体-1 (TREM-I)重组融合蛋白制备方法。二、在制备治疗感染性炎症疾病药物中的应用实施例60只昆明种小鼠，每只经腹腔注射精氨酸构建重症急性胰腺炎(SAP)模型后，随 机将其分为6组，一组和二组为TREM-I治疗组，造模后6小时经尾静脉注射TREM-I重组融 合蛋白，给药浓度为8mg/Kg，三组和四组为阳性对照组，采用目前临床上治疗SAP的药物乌 司他丁，给药浓度为10万U/Kg，五组和六组为SAP对照组，以生理盐水静脉注射。一、三、五 组分别在造模后M小时处死，二、四、六组分别在造模后72小时处死。检测外周血中炎症 因子的表达，病理分析胰腺和肺脏的损伤情况(见图8、图9)，评估TREM-I重组融合蛋白的 治疗效果。结果显示，TREM-I治疗组和乌司他丁治疗组的总体死亡率显著低于SAP对照组 (P < 0. 05)；炎症因子(MIP-1和超敏CRP)显著低于SAP对照组(P < 0. 05)。病理分析提示SAP对照组肺泡腔出血水肿，间质明显增宽，大量炎性细胞浸润， TREM-I治疗组和乌司他丁治疗组出血水肿好转，炎症细胞浸润明显减轻；SAP对照组胰腺 组织大片坏死，胰腺组织小叶结构不清，出血坏死明显，大量中性粒细胞细胞浸润，TREM-I 治疗组和乌司他丁治疗组出血坏死程度明显减轻，小叶结构清楚，少量炎性细胞浸润。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。Untitled3. ST25. txt
SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白及其应用
<130>、
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<170>PatentIn version 3.3
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<213>小鼠和人
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权利要求
1.一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，具有与天然TREM-I相似的结构，其 特征在于通过酶切位点连接TREM-I胞外区段和IgGFc段，所述融合蛋白具备两种免疫球 蛋白的特性，能与免疫细胞表面的TREM-I竞争性结合TREM-I配体。
2.根据权利要求1所述髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，其特征在于小鼠 髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ IDNO 1所示。
3.根据权利要求1所述髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，其特征在于人髓 样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:3所示。
4.一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白的制备方法，包括(1)克隆小鼠 TREM-I胞外区域和人IgG Fc段，将IgG Fc段基因插入TREM-I胞外区域基因的下游位点得 到融合片段；(2)将所述融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建重组原核表达质 粒；C3)构建的重组原核表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导表达，对蛋白表达产物进行 纯化，应用SUMO蛋白酶，其特征在于步骤O)中所述表达载体为pet-28a-HiS-Sum0。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述蛋白表达时，IPTG 37度诱导4-6小时，优选4小时。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述蛋白表达的条件为 (1)将新抽的质粒转入BL21中，37°C培养过夜；(2)挑取单克隆，37°C LB培养10小时；(3) 转入到500ml LB培养基中，22°C培养3_4小时，菌体浓度达到0. 6后加入IPTG，终浓度为 10 μ M，培养4小时。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述蛋白产物纯化，酶切 去除SUMO蛋白酶的条件为温度4-10°C，时间12-16小时。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于酶切去除SUMO蛋白酶的条件为温 度4°C，时间12小时。
9.权利要求1或2所述的髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗动物 感染性炎症疾病药物中的应用。
10.权利要求1或3所述的髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗人感 染性炎症疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)重组融合蛋白及其在制备治疗感染性炎症疾病药物中的应用，利用分子克隆和基因重组技术，从重症感染性休克患者和重症感染小鼠的外周血中，分别克隆人TREM-1胞外区域和小鼠TREM-1胞外区域，再分别采用酶切和PCR方法将人IgG Fc段基因插入TREM-1胞外区域基因的下游位点，然后将融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建了重组原核表达质粒。小鼠和人的TREM-1重组融合蛋白的基因序列分别如SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示。本发明公开的蛋白基因易于修饰和改造、稳定性好、疗效显著，对感染性炎症疾病具有很高的预防和治疗作用。
文档编号C07K16/46GK102127168SQ20101002295
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月19日 优先权日2010年1月19日
发明者刘岩, 李兆申, 路筝 申请人:中国人民解放军第二军医大学