专利名称：阿曼托双黄酮及其衍生物在预防及治疗辐射损伤中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及阿曼托双黄酮及其衍生物在预防及治疗辐射损伤中的用途。
背景技术：
电离辐射是一种严重危害人体健康的有害因素，机体受到大剂量电离辐射会引起 骨髓造血功能障碍、胃肠道损伤或脑损伤为基本病变的急性放射综合症，目前用于临床的 辐射防护药物主要为雌激素类、氨巯基类和细胞因子类。这些药物的综合疗效还未被认可， 或虽被认可但由于副作用太大，不能用于临床，因此开发高效、低毒或无毒的辐射防护药物 具有重大的社会和经济效益。据报道在姜科、银杏科、卷柏科等植物中普遍存在着阿曼托双黄酮；对卷柏科卷柏 属植物进行含量测定，卷柏中阿曼托双黄酮含量较高，现有技术中对其应用进行了广泛的 研究。阿曼托双黄酮连续给药10天可显著降低B16F-10黑素瘤细胞尾静脉注射C57BL/6 小鼠21天后肺肿瘤的数量，减弱肿瘤的侵入、增殖和在血管中的发生；在荷瘤小鼠模型中， 阿曼托双黄酮可调节免疫应答，通过提高IL-2和IFN- γ的产生来促进淋巴细胞的增值，提 高自然杀伤细胞的活性和增加抗体依赖性细胞毒性，抑制血清中唾液酸和Y-谷氨酰转肽 酶的产生；另外据报道双黄酮类化合物(如阿曼托双黄酮、扁柏双黄酮、贝壳杉双黄酮、银 杏双黄酮等)具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等作用。
发明内容
本发明的目的在于提供阿曼托双黄酮及其衍生物在预防及治疗辐射损伤的药物 中的新用途。本实验室用聚酰胺柱将卷柏醇提总部位分为水部位、50%乙醇部位、80%乙醇部 位、95%乙醇部位；并采用6tlCtlY射线SGy —次全身照射BALB/c小鼠动物模型筛选卷柏水 提总部位、醇提总部位、水部位、50%乙醇部位、80%乙醇部位、95%乙醇部位抗辐射活性， 其中醇提总部位和80%乙醇部位可显著提高辐射后BALB/c小鼠平均生存天数；继而对 80%乙醇部位进行化学成分分析，以阿曼托双黄酮含量最高；通过细胞、动物水平的反复验 证，证明阿曼托双黄酮可以抑制6tlCtl γ射线照射导致的V79细胞活力丧失，并能提高6tlCtl γ 射线6Gy —次全身照射BALB/c小鼠的活存率，从而完成了本发明。本发明中所述“阿曼托双黄酮”包括阿曼托双黄酮及阿曼托双黄酮衍生物。阿曼 托双黄酮可以是植物中提取的单体化合物，也可以是化学合成的阿曼托双黄酮，还可以是 含阿曼托双黄酮的提取物。阿曼托双黄酮衍生物主要指以阿曼托双黄酮为母核，对其进行的化学修饰，包括 将阿曼托双黄酮母核中酚羟基进行醚化和酯化，醚化选择甲基；酯化选择己酰基等。阿曼托双黄酮可与药学上可接受的载体按本领域已知方法制备成各种药物组合 物，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等各种固体、液体制剂或贴剂等；或和其他中药单体组合制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于预防及治疗辐射损伤。本发明具有以下优点1、发现了阿曼托双黄酮的新的医疗用途。2、阿曼托双黄酮作为常用中药卷柏的已知提取物，来源广，原料易得，用药剂量 小，安全性大，药用前景广阔。3、阿曼托双黄酮可提高6tlCtl γ射线6Gy全身照射BALB/c小鼠的活存率，这特点有 助于将其开发成辐射防护药物，用于预防和治疗辐射损伤，改善患者生存质量。
图1阿曼托双黄酮对V79细胞增殖的影响图2阿曼托双黄酮对6tlCtl γ射线导致的V79细胞活力丧失的保护作用图3阿曼托双黄酮预防给药对6tlCtl γ射线6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率 的影响。
具体实施例方式通过以下实施例来阐述本发明所述药物阿曼托双黄酮体外及体内抗辐射作用进 行评价，但并不限于以下途径。这些生物实验中主要包括1.化合物阿曼托双黄酮细胞毒 性检测；2.化合物阿曼托双黄酮对6tlCtl γ射线导致的V79细胞活力丧失的影响；3.化合物 阿曼托双黄酮对6tlCtl Y射线6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率的影响。[实施例一]阿曼托双黄酮细胞毒性检测材料与方法1.V79细胞培养V79细胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml链霉素的DMEM 培养基中，于37°C，5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后， 将V79细胞接种96孔板，5X IO3细胞/孔，37°C，5% C02孵育12小时，细胞汇合后进行给 药实验，共同孵育24h后，待细胞长至7(T80% 6tlCtl γ射线照射处理。2.阿曼托双黄酮对V79细胞增值的影响V79细胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml的DMEM培养基 中，于37°C，5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将V79 细胞接种96孔板，5X 103细胞/孔，37°C，5% C02孵育12小时，细胞汇合后，将化合物 阿曼托双黄酮以终浓度 2. 5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml 分别给药， 每浓度3孔，同时设无药物细胞对照和空白对照，37°C，5% C02培养，48小时观察结果。每 孔加入CCK-8工作液10ul，避光，37°C，5%C02培养2小时，在酶标仪(BIO-RAD Model 680) 上测定450nm处吸光值Α。同时在倒置显微镜下每日观察细胞形态。3.阿曼托双黄酮作用结果的处理与统计阿曼托双黄酮对V79细胞增值的影响以不同组别吸光度值相对无药物细胞对照 组的百分比表示
= (A450 给药 _A450 空白)/ (A450 对照——A450 空白)*100结果用Origin Pro 7. 5进行统计分析，与无药物对照组相比·.#，P < 0. 05 ·’##，P < 0. 01。结果化合物阿曼托双黄酮以2倍稀释为浓度梯度的6个浓度处理V79细胞过程中，每 日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有明显的变化。实 验独立重复三次，CCK-8检测结果见图1。阿曼托双黄酮在2. 5^20ug/ml对细胞均没有毒性。[实施例二]阿曼托双黄酮对6tlCtl γ射线导致的V79细胞活力丧失的保护作用材料与方法1.V79细胞培养方法见实施例一2.阿曼托双黄酮对6tlCtl γ射线导致的V79细胞活力丧失影响的检测V79细胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml的DMEM培养基 中，于37°C，5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将V79 细胞接种96孔板，5X 103细胞/孔，37°C，5% C02孵育12小时，细胞汇合后，将化合物阿曼 托双黄酮以终浓度0. 2ug/ml、lug/ml、5ug/ml分别给药，共同孵育24小时后6tlCtl γ射线4Gy 照射，剂量率为2. 3^2. 5Gy/min,同时设无药物细胞对照和空白对照，37°C，5% C02培养，分 别在24小时、48小时、72小时三个时间点观察结果。每孔加入CCK-8工作液10ul，避光， 37°C，5% C02培养2小时，在酶标仪上(BI0-RAD Model 680)测定450nm处吸光值Α。同时 在倒置显微镜下每日观察细胞形态。3.阿曼托双黄酮作用结果的处理与统计阿曼托双黄酮对6tlCtl Y射线导致V79细胞活力丧失的影响以不同组别吸光度值相 对无药物细胞对照组的百分比表示= (A450 给药-A450 空白)/ (A450 对照-A4S0 空白)*100结果用Origin Pro 7. 5进行统计分析，与无药物对照组相比·.#，P < 0. 05 ·’##，P < 0. 01 ；与 4Gy 组相比*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01。结果实验独立重复三次，CCK-8检测结果见图2。阿曼托双黄酮在0. 2^5ug/ml对6tlCtl γ 射线导致V79细胞活力丧失呈剂量依赖的抑制作用。[实施例三]阿曼托双黄酮对6tlCtlγ射线6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率的 影响材料与方法1. BALB/c 小鼠饲养选用18 22g雄性BALB/c小鼠50只，由军事医学科学院动物实验中心提供。小鼠 饲养环境温度21°C 士2°C，相对湿度50% 士 10%，12小时灯光12小时黑暗。2.阿曼托双黄酮对6tlCtl γ射线6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率的影响药物制备精密称取E523粉末1. 5mg,加生理盐水3ml，配置成0. 5mg/ml溶液；阿 曼托双黄酮粉末3mg、6mg、12mg，分别加生理盐水6ml，配置成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml的溶液，超声2小时助溶，形成混悬液备用。动物分组及处理BALB/c小鼠50只随机分为五组，每组10只，模型组灌胃等体积 生理盐水，阳性药E523组按5mg/kg剂量灌胃，阿曼托双黄酮低剂量组按5mg/kg剂量灌胃， 阿曼托双黄酮中剂量组按10mg/kg剂量灌胃，阿曼托双黄酮高剂量组按20mg/kg剂量灌胃。 E523组照射6tlCtl γ射线6Gy前24小时灌胃一次，其余各组均灌胃两次，分别在照射前24小 时和照射前1小时。30天活存状况观察=6tlCtlY射线6Gy照射后BALB/c小鼠体重减轻，皮毛干枯，精神 萎靡，行动迟缓，团缩拱背，视力障碍。各给药组，与模型组相比，小鼠的上述体征均有所改
口 ο3.阿曼托双黄酮作用结果的处理与统计阿曼托双黄酮预防给药对6tlCtl γ射线6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率的影 响。结果用Origin Pro 7. 5进行统计分析。结果不同药物不同剂量处理的6Gy照射的BALB/c小鼠30天活存率的结果见表1。阿 曼托双黄酮预防性给药能够剂量依赖的提高6tlCtl Y射线6Gy —次全身照射BALB/c小鼠的 活存率。表1阿曼托双黄酮预防性给药对6tlCtl γ射线6Gy照射的BALB/c小鼠活存率的影 响
-mm-mm-平均存活大数wmm 保护指数
_(mg/kg)_(χ士s)_(%)_
模型组019.00±7.72 30——
阳性药 E523 组530.00±0100林1.58
阿曼托双黄酮低剂量组 525.90±6.62 701.36
阿曼托双黄酮中剂量组 1028.50±4.74 90*1.50
阿曼托双黄酮高剂量组 2026.80±6.76 801.41与模型组比较*，P< 0. 05 ；**，P < 0. 01。
权利要求
一种抗辐射作用的化合物，其名称为阿曼托双黄酮，结构为FSA00000012495000011.tif
2.一种抗辐射作用的药物组合物，含药用载体，特征为其活性成分为阿曼托双黄酮 及其衍生物。
3.根据权利要求2的药物组合物，其特征为阿曼托双黄酮衍生物中，对阿曼托双黄酮 母核所做的结构修饰。
4.根据权利要求3的药物组合物，其特征为阿曼托双黄酮衍生物中，将阿曼托双黄酮 母核中酚羟基进行醚化和酯化。
5.根据权利要求4的药物组合物，其特征为阿曼托双黄酮衍生物中，醚化选择甲基； 酯化选择己酰基。
6.权力要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物可被配制成片剂、颗粒剂、胶囊 剂等固体制剂；注射剂、口服液等液体制剂或贴剂。
7.阿曼托双黄酮及其衍生物在制备预防及治疗辐射损伤的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及阿曼托双黄酮及其衍生物在预防及治疗辐射损伤中的新用途。实验证明阿曼托双黄酮在小于20ug/ml浓度范围内对V79细胞无毒性；在0.2-5ug/ml对60Coγ射线导致V79细胞活力丧失呈剂量依赖的抑制作用；在5-20mg/kg可剂量依赖的提高60Coγ射线6Gy照射BALB/c小鼠的活存率，说明阿曼托双黄酮可用于预防及治疗辐射损伤。
文档编号C07D311/30GK101830877SQ20101010668
公开日2010年9月15日 申请日期2010年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者冯卫生, 周喆, 朱艳慧, 王升启, 郑晓珂 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所