专利名称：蛋白质定位标记方法
技术领域：
本发明属于蛋白质标记和修饰技术领域。
背景技术：
点位突变是过去30年来蛋白质研究领域中最重要的技术突破。研究者可以利用 这项技术将蛋白质中任何一个位点的氨基酸随意地变换成其它19种氨基酸中的一个。这 项技术已成为蛋白质科学中主要的研究工具，在蛋白质的基础研究、蛋白工程与蛋白药物 研发中得到广泛应用。 现行的点位突变技术的局限性在于氨基酸的变换只能在由遗传密码决定的20种 天然氨基酸之间进行。数目众多的非天然氨基酸和带特殊标记的氨基酸则无法植入到蛋白 质中指定的位点，其中最重要的一类是磷酸化的氨基酸。利用化学合成方法，这些特殊的氨 基酸则可以合成到多肽中特定的位点。但是，用化学合成方法制备ioo残基以上的多肽是 非常困难的。 由于现在没有定点标记的磷酸化蛋白及其它特殊修饰的蛋白，人们只能用相应的 多肽替代。多肽只是蛋白中的一个小片段，完全丧失了蛋白质行使其特殊功能的基础及空 间构象。因此磷酸化的多肽和其它特殊修饰的多肽在物理性质、稳定性、特异性及其它方面 都和与其对应的蛋白存在重大区别。 利用蛋白拼接技术可以将一段蛋白和一段多肽通过形成肽键连接起来。如果要对 蛋白的一个位点进行标记，可以首先合成一条带有标记的多肽，这条多肽的序列和蛋白标 记位点的那一段的序列一致。然后，这条带有特殊标记的多肽和目标蛋白其余的片段通过 蛋白拼接反应连接起来获得完整的目标蛋白。蛋白片段可以通过蛋白表达的方法获得。这 个在指定位置带有特殊标记的完整的目标蛋白将进一步被折迭复性成具有天然构象的活 性蛋白。 定点标记的蛋白分子具有普通蛋白无法获得的性质和功能，会在药物研发、疾病 治疗以及科学研究等各领域得到广泛应用。其中特别重要的一类是定点标记的磷酸化蛋 白。蛋白的磷酸化在细胞代谢调控中起着重要作用。细胞生长、凋亡及信号传递的一显重 要调控线路是通过相应蛋白特殊位点的磷酸化和去磷酸化来实现的。许多重要疾病如糖尿 病、自身免疫系统疾病，特别是肿瘤都是由于蛋白磷酸化失控而引起的。由于目前尚没有方 法可以在体外获得定点标记的磷酸化蛋白，磷酸化蛋白的研究受到很大限制，在疾病治疗 中的应用无法开展。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，之目的在于提供蛋白定点标记方法，即通过定点标 记技术将非自然氨基酸和带有标记的氨基酸，如D-型氨基酸、稳定同位素标记的氨基酸、 萤光标记基团等，磷酸化氨基酸植入到蛋白的任何一个指定的特定位点。
为实现本发明目的，采用如下技术方案
蛋白质定位标记方法，其特征在于包括
1、蛋白质定位标记方法，其特征在于包括
(l).N-S酯酰基重组 将目标蛋白的片段与内含肽形成的融合蛋白与几丁质亲和树脂结合，蛋白质内含 肽N末端剪切点的半胱氨酸(Cys)残基侧链的N-S发生转酯酰基反应，形成一个线性中间 产物；所述目标蛋白可以为动物蛋白或者植物蛋白、或者其它微生物蛋白。
(2).巯基小分子参与的转酯作用 转酯作用需要具有亲核残基的参与，含有巯基的小分子和目标蛋白结合生成 c-末端含有硫酯基团的蛋白，并与亲和树脂上的融合蛋白的其余部分分离；
(3).多肽参与的转酯作用 加入含有N末端半胱氨酸(Cys)残基侧链的多肽分子，形成了一个含有多肽和目
标蛋白的线性酯类中间体； (4).S-N酯酰基重组 N末端多肽半胱氨酸(Cys)残基侧链发生S-N转酯酰基反应以肽键连接形成目标 蛋白质。 上述含有N-末端Cys的多肽可由化学合成方法加上，或者用特异的蛋白水解酶酶
切细胞表达的蛋白分子获得。 上述巯基小分子优选为巯乙基磺酸钠。 由于多肽化学合成方法不能合成长的多肽分子，大分子量的多肽可用蛋白质表达 方式获得，而化学合成的方法可以得到带特异地修饰的多肽片段。利用蛋白拼接技术，可以 将上诉一段蛋白和一段多肽通过形成肽键连接起来。另外，用于蛋白拼接的两条多肽，其中 一条N-末端必须是半胱氨酸(Cys)，另一条C-末端必须含有硫酯基团(-NR)。含有N_末 端半胱氨酸(Cys)的多肽可由化学合成方法加上。C-末端硫酯基团的蛋白质由蛋白质内 含肽介异的蛋白质剪接方法获得。带有C-末端的硫酯基团的蛋白质与带N-末端半胱氨酸 (Cys)的多肽分子形成天然肽键，从将两端分子连接起来形成稳定的蛋白分子。
本发明相比现有技术，具有如下技术效果 由于现在市场上没有定点标记的磷酸化蛋白及其它特殊修饰的蛋白，人们只能用 相应的多肽替代。多肽只是蛋白中的一个小片段，完全丧失了蛋白质行使其特殊功能的基 础空间构象。因此磷酸化的多肽在物理性质、稳定性、特异性及其它方面都和真正的磷酸 化蛋白存在重大区别。生成的蛋白质具有和生物体内蛋白质分子完全一样的序列、标记位 点和空间构象，是取代磷酸化的多肽及其它特殊修饰多肽的下一代产品。
说明书附图
图1为本发明拼接合成步骤的示意图。
图2为聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定结果图。
第1步，N — S酯酰基的重组 将目标蛋白的片段与内含肽形成的融合蛋白与一个亲和树脂结合，蛋白质内含肽 N末端剪切点的半胱氨酸(Cys)残基侧链的N-S发生转酯酰基反应，形成了一个线性中间产 物_酯类. 第2步，巯基小分子参与的转酯作用
转酯作用需要具有亲核残基的参与，含有巯基的小分子和目标蛋白结合，生成
c-末端含有硫酯基团的蛋白并与亲和树脂上的融合蛋白的其余部分分离。 第3步，多肽参与的转酯作用 加入含有N末端半胱氨酸(Cys)残基侧链的多肽分子，形成了一个含有多肽和目
标蛋白的线性酯类中间产物。 第4步，S — N酯酰基的重组 N末端多肽半胱氨酸(Cys)残基侧链发生S-N转酯酰基反应，形成稳定的肽键。由 此，形成了一个完整的目标蛋白质。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来对本发明进行进一步说明，但并不将本发明局限于这些具 体实施方式。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的 所有备选方案、改进方案和等效方案。 首先合成N-末端为半胱氨酸(Cys)和C_末端含有六个连续组氨酸的多肽，用化
学合成的方法可以得到带特异地修饰的多肽片段。 第1步，N — S酯酰基的重组 将目标蛋白的基因插入含有内含子的pTWINl(New England Biolabs， Inc.， Beverly,Mass.)(纽英伦生物技术有限公司)载体。将载有该质粒的BL21细胞在LB液体 培养基中(含有100微克/毫升氨苄青霉素)，37。C条件下生长到0. D. 6。。 = 0. 5-0. 6，然后 加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)(0. 5mmol/L)进行诱导合成蛋白质。诱导可在16。C下培 养过夜或在3(TC条件下培养3小时。 细胞通过离心(3000g，30分钟)沉淀，然后悬浮在缓冲液A(20mmol/LTris-HCl， pH 7. 5，含有500mmol/L NaCl)中。用超声破碎细胞，离心(23000g， 30分钟)，去除细胞碎 片。取上清加入用缓冲液(IO毫升柱床体积)平衡后的几丁质树脂柱(chitin resin)，不
接合的蛋白质用io倍体积的缓冲液清洗去除。 第2步，巯基小分子参与的转酯作用力卩缓冲液B(20mmol/L Tris-HCl， pH 8，含有500mmol/L NaCl禾P 100mmol/L 2-mercaptoethane-sulfonic acid(MESNA))(中文名称巯乙基磺酸钠)到几丁质树脂柱 可快速激活由巯基试剂诱导的裂解反应。切割反应后，该蛋白从柱中洗脱，接着在4t:过夜 后，该蛋白自动生成一个带有C末端硫酯的蛋白。
第3、4步，多肽参与的转酯作用和S — N酯酰基的重组 将带有C末端硫酯的蛋白质和上述多肽直接混合，可以将上述一段蛋白和一段多
肽通过形成肽键连接起来。 蛋白确认 采用上诉蛋白拼接方法制得的带有六个组氨酸标签的融合蛋白(绿色荧光蛋白， 分子量26.9kDa)，可与Ni-NTA(镍-氮三乙酸)特异地结合。结合在纯化介质上的蛋白在 低PH缓冲液或咪唑溶液甚至组氨酸溶液中都可洗脱下来。如果拼接成功，带有六个组氨酸 标签的绿色荧光蛋白就能与Ni-NTA(镍-氮三乙酸)纯化介质结合。洗脱下来的蛋白可用 常规SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)鉴定。
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出液。
SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)鉴定结果见图2。 中
品1 :蛋白质标准。
品2 :绿色荧光蛋白(GFP，分子量26. 9kDa)。 品3 :绿色荧光蛋白，上样流出液。
品4:绿色荧光蛋白，洗脱液。
品5 :蛋白拼接技术方法制得的带有六个组氨酸标签的绿色荧光蛋白，上样流 样品6 :蛋白拼接技术方法制得的带有六个组氨酸标签的绿色荧光蛋白，洗脱液。
图样样样样样
权利要求
蛋白质定位标记方法，其特征在于包括步骤如下(1).N-S酯酰基重组将目标蛋白的片段与内含肽形成的融合蛋白与几丁质亲和树脂结合，蛋白质内含肽N末端剪切点的半胱氨酸(Cys)残基侧链的N-S发生转酯酰基反应，形成一个线性中间产物；(2).巯基小分子参与的转酯作用转酯作用需要具有亲核残基的参与，含有巯基的小分子和目标蛋白结合生成C-末端含有硫酯基团的蛋白，并与亲和树脂上的融合蛋白的其余部分分离；(3).多肽参与的转酯作用加入含有N末端半胱氨酸(Cys)残基侧链的多肽分子，形成了一个含有多肽和目标蛋白的线性酯类中间体；(4).S-N酯酰基重组N末端多肽半胱氨酸(Cys)残基侧链发生S-N转酯酰基反应以肽键连接形成目标蛋白质。
2. 如权利要求l所述的蛋白质定位标记方法，其特征在于所述含有N-末端Cys的多肽 可由化学合成方法加上，或者用特异的蛋白水解酶酶切细胞表达的蛋白分子获得。
3. 如权利要求1所述的蛋白质定位标记方法，其特征在于所述巯基小分子为巯乙基磺 酸钠。
4. 蛋白质定位标记方法，其特征在于包括步骤如下(1) .N— S酯酰基的重组将目标蛋白的基因插入含有内含子的pTWINl，将载有该质粒的BL21细胞在含有100 微克/毫升氨苄青霉素液体培养基中，37t:条件下生长到0. D. 6。。 = 0. 5-0. 6，然后加入 0. 5mmol/L异丙基硫代半乳糖苷进行诱导合成蛋白质，在16。C下培养过夜或在3(TC条件下 培养3小时。细胞以3000g、30分钟离心沉淀，然后悬浮在缓冲液A，所述缓冲液A包含20mmol/L Tris-HCl和500mmol/L NaCl溶液，用超声破碎细胞，以23000g， 、30分钟离心去除细胞碎 片，取上清加入用缓冲平衡后的几丁质树脂柱，不接合的蛋白质用10倍体积的缓冲液清洗 去除；(2) .巯基小分子参与的转酯作用加缓冲液B到几丁质树脂柱可快速激活由巯基试剂诱导的裂解反应，所述缓冲液B包 含20mmol/L Tris-HCl，pH 8，含有500mmol/L NaCl禾P 100mmol/L巯乙基磺酸钠，切割反应 后，蛋白从柱中洗脱，接着在4t:过夜后，该蛋白自动生成一个带有C末端硫酯的蛋白；(3) 多肽参与的转酯作用；禾口(4) S —N酯酰基的重组将带有C末端硫酯的蛋白质和上述多肽直接混合，可以将上述一段蛋白和一段多肽通 过形成肽键连接起来。
全文摘要
本发明涉及蛋白质定位标记方法，包括N-S酯酰基重组、巯基小分子参与的转酯作用、多肽参与的转酯作用、S-N酯酰基重组，用于蛋白拼接的两条蛋白和多肽，其中一条N-末端必须是Cys，另一条C-末端必须含有硫酯基团(-NR)，本发明方法将一段蛋白和多肽通过形成肽键连接起来形成新的蛋白分子，该蛋白具有和生物体内蛋白质分子完全一样的序列、标记位点和空间构象，是取代酸化的多肽及其它特殊修饰多肽的下一代产品，解决了现有技术尚没有方法可以在体外获得定点标记的磷酸化蛋白致使磷酸化蛋白的研究受到很大限制的缺陷。
文档编号C07K1/107GK101775065SQ20101011091
公开日2010年7月14日 申请日期2010年2月11日 优先权日2010年2月11日
发明者汪弋 申请人:杭州药都生物技术有限公司