专利名称：产脂肪酸工程菌及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产脂肪酸工程菌及其制备方法和应用。
背景技术：
脂肪酸是一种重要的基础化工原料，来源于石油，动物油或者植物油等。作为不可再生资源，石油在全球的储备量有限并且面临过渡开采的危险。为了保护环境、节约能源， 可再生资源逐渐得到重视和利用。从动植物油中提取的各种脂肪酸，已经广泛应用于食品， 医药，化工等多个领域。通过生物技术改造，许多的微生物菌株也应用于脂肪酸生产，包括细菌、酵母、霉菌和藻类等。细菌包括嗜酸乳杆菌、浑浊红球菌等。酵母中的研究主要集中在一些假丝酵母和红酵母中。霉菌中代表菌株多属于孢霉、毛霉或曲霉。藻类多见于微藻属及紫球藻属。
发明内容
本发明的目的是提供一种产脂肪酸工程菌及其制备方法和应用。本发明提供了 DNA片段P，自上游至下游依次包括同源臂1\、DNA片段M和同源臂T2 ；所述同源臂T1和同源臂T2能与asrll31蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述 asrll31蛋白；所述DNA片段M为标记基因；所述asrll31蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所示。所述asrll31蛋白的编码基因的核苷酸序列可如序列表的序列4所示。所述标记基因片段可为抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因。所述DNA片段P的核苷酸序列具体可如序列表的序列5所示。含有所述DNA片段P的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为将所述DNA片段P插入PRL277质粒的多克隆位点得到的重组质粒III。所述重组菌具体可为将所述重组质粒111、质粒？扎443和质粒？扎528导入大肠杆菌HBlOl得到的重组菌。本发明提供的制备产脂肪酸工程菌的方法，是灭活淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120中asrll31蛋白，得到产脂肪酸工程菌；所述asrll31蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所示。可将任一所述DNA片段P导入所述淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120，通过 DNA片段P和淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120的同源重组实现所述灭活。具体可将所述重组菌与淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120共培养实现所述灭活。以上任一所述方法制备得到的产脂肪酸工程菌也属于本发明的保护范围。淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120，是一种通常用来研究蓝细菌光和作用及固氮作用的模式菌株，这种蓝细菌是光合自养生长，细胞内具有按规律排布的细胞内膜(类囊体膜)，这些内膜系统富含膜脂及藻胆蛋白。本发明中将淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120中的一个钙结合蛋白灭活，得到了工程菌Δ 1131。工程菌Δ 1131细胞内的游离钙离子浓度升高，类囊体膜增多并充斥整个细胞，内膜组分多于野生菌，生长速度快于野生菌，总脂肪酸含量高于野生菌，很多重要脂肪酸含量也高于野生菌。工程菌Δ 1131的优点如下1、相比于目前通常应用的产脂肪酸菌株，培养条件简单。工程菌Δ 1131能够进行光合自养，只需要光照和无机盐培养基，不产毒及有害气体。培养细菌和酵母所用培养基多为有机培养基，部分霉菌会产生孢子有害人体健康，微藻的培养难度较高并易被污染。2、生长较为快速，代时约为20小时，相对于其它藻类(微藻代时44 91小时，紫球藻代时3 5天)有明显优势。目前研究较多的微藻在液体培养时达到较低浓度就会饱和停止增长，而工程菌Δ 1131则能一直维持生长并收获较多菌体。3、产生的脂肪酸占生物量的比例较高，高于22.5%。根据文献报道，在脂肪酸含量很高的2个微藻藻种中也是达到了 22. 3%,由于该菌株生长更加快速且培养方便，同样时间内能获得更多的总脂肪酸。4、棕榈酸、棕榈油酸、亚麻酸、亚麻油酸均有一定的含量，这是一些对人体有益的物质，肉豆寇酸也比较重要，但是含量较低。工程菌Δ 1131的肉豆寇酸含量是野生菌的两倍以上，亚麻油酸，棕榈油酸和油酸的含量也比野生菌高，而棕榈酸和亚麻酸的含量相当。 亚麻油酸是一种人体所需的重要物质，棕榈油酸和油酸是工业和食用原料，肉豆寇酸是香料，都具有比较广泛的应用前景。5、在能够生产大量脂肪酸的同时还能收获藻胆蛋白，由于类囊体膜的增加同时能使藻胆蛋白的含量增多，这类蛋白这也是食品与化妆品工业上的优质天然色素并能应用于合成新型荧光探针。提取藻胆蛋白的方法在细胞破碎后加入水溶液洗涤破碎产物， 10000rpm/min高速离心10分钟，此时将沉淀物应用于脂肪酸萃取，上清水溶液为带有蓝紫色荧光的藻胆蛋白水溶液，通过硫酸铵饱和沉淀方法得到粗提的藻胆蛋白沉淀，经过冷冻干燥即可获得粗提的藻但蛋白粉末。6、该突变体能长时间的维持表型。
图1为工程菌Δ 1131-Α的southern鉴定图。图2为工程菌Δ 1131-Α和野生菌的生长曲线。图3为工程菌和野生菌的丝状体(普通显微镜；图中标尺10 μ m) ；A 野生菌；B 工程菌Δ 1131-Α。图4为现有菌株(紫球藻)的细胞图片。图5为工程菌Δ1131-Α和野生菌生长72小时的细胞(透射电镜；图中标尺 2μ ) ；A 野生菌；B 工程菌 Δ1131-Α。图6为长时间培养后(生长240小时)，工程菌Δ1131-Α的细胞图片(透射电镜； 图中标尺500nm)。图7为总脂肪酸甲酯化后的气相色谱图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。质粒pRL277 北京大学；参考文献Conjugal transfer of DNA tocyanobacteria. Elhai J, Wolk CP. Methods Enzymol. 1988 ; 167 :747_540质粒pRL443 北京大学；参考文献Conjugal transfer of DNA tocyanobacteria. Elhai J, Wolk CP. Methods Enzymol. 1988 ; 167 :747_540质粒pRL528 北京大学；参考文献Conjugal transfer of DNA tocyanobacteria. Elhai J, Wolk CP. Methods Enzymol. 1988 ; 167 :747_540淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120(野生菌，WT)购自美国ATCC (美国标准菌种收藏所；American Type Culture Collection)菌种库，编号 27893。pBS载体购自Stratagene公司，产品目录号ST212207。大肠杆菌HBlOl 购自takara公司，产品目录号D9051。微量元素溶液A5 2. 86g硼酸、1. 81g氯化锰·4Η20、0. 222g硫酸锌、0. 39g钼酸钠、 0. 079g硫酸铜· 5Η20、49· 4g硝酸钴· 6H20，加蒸馏水至1升。Bgll液体培养基1. 5g硝酸钠、0. 04g磷酸氢二钾、0. 075g硫酸镁· 7H20、0. 036g 氯化钙· 7H20、0. 02g碳酸钠、0. 006g柠檬酸、0. 006g柠檬酸铁、1毫升微量元素溶液A5，加
蒸馏水至1升。Bgll固体培养基在Bgll液体培养基中加入琼脂，使其终浓度为1. 2% (质量百分含量)。抗性筛选培养基Bgll培养基(液体/固体)中分别加入各种抗生素母液，使氨苄青霉素的终浓度为100 μ g/mL、卡那霉素的终浓度为50μ g/mL、甲磺隆的终浓度为50 μ g/ mL、氯霉素的终浓度为25 μ g/mL、四环素的终浓度为12. 5 μ g/mL ；氨苄青霉素母液溶剂为无菌双蒸水，溶质为氨苄青霉素，氨苄青霉素浓度为100mg/mL ；卡那霉素母液溶剂为无菌双蒸水，溶质为卡那霉素，卡那霉素的浓度为50mg/mL Kan ；甲磺隆母液氯霉素母液溶剂为无水乙醇，溶质为氯霉素，氯霉素的浓度为25mg/mL ；甲磺隆母液溶剂为无菌双蒸水，溶质为甲磺隆，甲磺隆的浓度为50mg/mL ；四环素母液溶剂为无水乙醇，溶质为四环素，四环素的浓度为12. 5mg/mL。蔗醣抗性筛选培养基在抗性筛选培养基中加入蔗糖，蔗糖的终浓度为50mg/mL ； 是抗性筛选双交换纯和重组子的培养基，利用质粒PRL277上含有的蔗醣致死基因进行筛选，剔除单交换重组子。实施例1、工程菌的制备一、重组质粒的构建l、asrll31基因的上游片段的制备以淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120的基因组DNA为模板，用特异性引物对甲(由引物1和引物2组成)进行PCR扩增，得到asrll31基因的上游片段。引物 1 (上游引物)5，-GAACCTCGAGTACAACAACGGGAAACCGC-3，；引物 2 (下游引物)5，-GCTGGTCGACAGATTAAGAATACTAAAGG-3，；
引物1引入XhoI酶切位点；引物2引入SalI酶切位点。2、asrll31基因的下游片段的制备以淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120的基因组DNA为模板，用特异性引物对乙(由引物3和引物4组成)进行PCR扩增，得到asrll31基因的下游片段。 引物 3 (上游引物)5，-ATCGGTCGACGTGCAACCACAAGCGTCG-3，；引物 4 (下游引物)5，-CTGCGGATCCTCATAATTAAACACCTCTGG-3，；弓丨物3引入Ml I酶切位点，引物4引入BamHI酶切位点。3、在pBS载体的BioI和Mil酶切位点之间插入步骤1制备的asrll31基因的上游片段，SalI和BamHI酶切位点之间插入步骤2制备的asrll31基因的下游片段，得到重组质粒I。4、在重组质粒I的MlI酶切位点之间插入卡那霉素抗性基因(见序列表的序列 1)，得到重组质粒II。5、用XhoI和BamHI酶切重组质粒II，回收约7300bp的DNA片段P。DNA片段P的核苷酸序列如序列表的序列5所示，自5’端第1至观71位核苷酸为asrll31基因的上游片段，第观72至4204位核苷酸为卡那霉素抗性基因，第4205至7140位核苷酸为asrll31 基因的下游片段。6、将步骤5得到的DNA片段插入穿梭载体pRL277的BioI和BglII酶切位点 (BglII与BamHI为同尾酶)之间，得到重组质粒III。二、工程菌Δ 1131-Α的制备1、将结合质粒pRL443和辅助质粒pRL528转化入大肠杆菌HBlOl，得到含有抗性基因Amp (氨苄青霉素)、Sm(甲磺隆)、Cm(氯霉素)和Tc (四环素)的重组菌甲。2、将重组质粒III转入重组菌甲中，得到重组菌乙，用LB培养基洗涤3次。3、将淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120用Bgll液体培养基洗涤3次。4、将步骤2的重组菌乙和步骤3的淡水丝状蓝细菌离心后置于悬浮培养基(将LB 培养基和Bgll培养基等体积混合得到的培养基)，充分混合，于室温低光照培养条件下静置4小时。5、在Bgll固体培养基上覆盖无菌硝酸纤维素膜，然后将菌体混合物涂布无菌硝酸纤维素膜上，光照培养直至长出新生的蓝细菌菌落。6、把菌落转移至蔗醣抗性筛选培养基，筛选抗生素阳性菌株。7、将抗生素阳性菌株进行southern鉴定(探针如序列表的序列2所示；探针匹配的是asrll31基因下游的约SOObp片段，由预期灭活基因和要替换的卡那基因的大小来进行区别是否已完全由卡那基因替换预期灭活基因)鉴定结果表明，有16个菌株已经完全看不到野生菌的特异条带(即该突变体已经纯合，不含有asrll31基因)，得到16个纯合重组子，将其中一株命名为工程菌Δ 1131-Α。工程菌Δ 1131-Α的southern鉴定图见图1。三、工程菌Δ 1131-Β的制备制备方法同步骤二。得到16个纯合重组子，将其中一株命名为工程菌Δ 1131-Β。四、工程菌Δ 1131-C的制备制备方法同步骤二。
得到16个纯合重组子，将其中一株命名为工程菌Δ 1131-C。五、对照菌的制备用pRL277代替重组质粒III，制备方法同步骤二。实施例2、工程菌的生长与表型观察培养条件在含有硝酸钠(1. 5g/L)的Bgll培养基中培养；室温^)_25°C )；光照强度约为35yE/m2/S ；通气培养时通入1 % C02。分别采用上述培养条件培养工程菌 Δ1131-Α、工程菌Δ1131-Β、工程菌A1131-C和野生菌。分别制作三个工程菌和野生菌的生长曲线并根据生长曲线计算代时(根据生长曲线测定的光密度数值取Lg值对时间作图，在Lg值呈现直线的区域即认为是达到对数生长期，此阶段生长曲线的斜率的倒数计为代时)(取三次重复实验的平均值)。工程菌 Δ 1131-Α、工程菌Δ 1131-Β和工程菌Δ 1131-C的代时均约为19. 92小时，野生菌的代时约为20小时。工程菌Δ1131-Α和野生菌的生长曲线见图2。通过普通显微镜观察三个工程菌和野生菌的丝状体。发现三个工程菌形态相似， 工程菌的细胞均明显大于野生菌。工程菌Δ1131-Α和野生菌的丝状体图片见图3。通过透射电镜观察三个工程菌和野生菌的细胞并与一株现有菌株进行比较。现有菌株为一种经常用来生产脂肪酸的红藻菌株(紫球藻)，是真核藻类，细胞图片见图4 (引用自 “http://www. bio. mtu. edu/the_wal 1/phycodisc/RHODOPHYTA/")。发现三个工程菌形态相似，与野生菌的细胞内膜有明显区别。工程菌细胞内部被内膜充斥，而且细胞明显变大， 长时间培养后细胞内部的结构更加致密，内膜增厚变得无规则排列。野生菌细胞内部有明显的空腔。现有菌株细胞内部的内膜很多，工程菌的细胞内膜的丰富度类似现有菌株(突变体菌株为原核藻类)。工程菌Δ1131-Α和野生菌的细胞图片见图5。长时间培养后，工程菌Δ 1131-Α的细胞图片见图6。实施例3、产脂肪酸能力鉴定实施例中设置四个重复实验，结果取平均值。一、培养分别将工程菌Δ 1131-Α、工程菌Δ 1131_Β、工程菌Δ 1131-C、野生菌和对照菌接种于500毫升含有硝酸钠(1.5g/L)的Bgll液体培养基，接种后OD值均为0.5;培养条件 室温Q0-25°C )；光照强度约为35 μ E/m2/S ；通气培养时通入C02。培养7天后收获。二、称重将收获的菌体进行称重(以干重计)。工程菌Δ1131-Α约为0.52g，工程菌 Δ 1131-Β约为0. 54g,工程菌Δ 1131-C约为0. 5g，野生菌约为0. 4g，对照菌约为0. 38g。 三个工程菌的生长速率略快于野生菌和对照菌，工程菌的菌体产量约为野生菌菌体产量的 1. 3 倍。三、总脂肪酸含量测定分别提取工程菌Δ 1131-Α、工程菌Δ 1131_Β、工程菌Δ 1131-C、野生菌和对照菌的脂肪酸，提取方法如下1、将回收的菌体在液氮中研磨后转入事先称好的离心管中，算出菌体实际质量 (0. 4g)；2、每Ig菌体加入IOml萃取缓冲液(水乙醇乙醚吡啶氨水=
715 15 5 1 0. 018 ；体积比)；3、60°C放置15分钟，取出后在室温平衡一会，5000rpm/min离心5分钟；4、将上清转入干净的离心管中。5、沉淀中继续加入萃取缓冲液用玻璃棒混勻，重复步骤3和4两次。6、将所有上清在50°C旋转蒸干，即为总脂肪酸，称取总脂肪酸的质量。工程菌Δ 1131-Α的总脂肪酸质量为90mg，工程菌Δ 1131-Β的总脂肪酸质量为 75mg，工程菌Δ 1131-C的总脂肪酸质量为90mg，野生菌约为57mg，对照菌的总脂肪酸质量约为58mg。对于等质量的菌体，工程菌的总脂肪酸质量约为野生菌的1. 3-1. 6倍。四、各个脂肪酸含量的测定将步骤三得到的各菌的总脂肪酸分别甲酯化后进行气相色谱分析，甲酯化的步骤如下1、在步骤三得到的总脂肪酸中加入4mL 2%甲醇硫酸(由甲醇和硫酸组成，甲醇的质量百分含量为2% )，85°C放置5小时，然后将该反应体系平衡到室温；2、向反应体系中加入1/2体积的0. 15M氯化钠水溶液，振荡混勻；3、加入等体积的正己烷，剧烈振荡混勻后，静置5分钟；4、3000rpm/min 离心 3 分钟；5、将上层正己烷层小心吸出，转入新的离心管中；6、重复步骤3至5两次；7、将3次收集的正己烷合并，氮气吹干后重新溶于正己烷中，用气相色谱分析。工程菌Δ 1131-Α与野生菌对比的气相色谱图见图7。三个工程菌、野生菌和对照菌的各特征峰的位置重合，说明工程菌、对照菌和野生菌中的各种脂肪酸种类一致。在三个工程菌、野生菌和对照菌中棕榈酸、棕榈油酸、亚麻酸均有一定的含量，肉豆寇酸也有一定含量，但是含量较低；工程菌的肉豆寇酸含量是野生型的两倍以上，亚麻油酸、棕榈油酸和油酸的含量也比野生菌高，棕榈酸和亚麻酸的含量与野生菌相当。各个脂肪酸含量的测定结果见表1。表1各个脂肪酸含量的测定结果
权利要求
1.DNA片段P，自上游至下游依次包括同源臂I\、DNA片段M和同源臂T2 ；所述同源臂T1 和同源臂1~2能与asrll31蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述asrll31蛋白；所述DNA 片段M为标记基因片段；所述asrll31蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所示。
2.如权利要求1所述的DNA片段P，其特征在于所述asrll31蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表的序列4所示；所述标记基因片段为抗生素抗性基因片段。
3.如权利要求2所述的DNA片段P，其特征在于所述DNA片段P的核苷酸序列如序列表的序列5所示。
4.含有权利要求1-3中任一所述DNA片段P的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将所述DNA片段P插入pRL277质粒的多克隆位点得到的重组质粒III。
6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将重组质粒III、质粒 PRL443和质粒pRL5^导入大肠杆菌HBlOl得到的重组菌；所述重组质粒III为将所述DNA 片段P插入PRL277质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
7.制备产脂肪酸工程菌的方法，是灭活淡水丝状蓝细菌Anabaenasp. PCC 7120中的 asrll31蛋白，得到产脂肪酸工程菌；所述asrll31蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述灭活是将权利要求1至3中任一所述 DNA片段P导入淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120，通过DNA片段P和淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120的同源重组实现的。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述同源重组是通过将权利要求6所述重组菌与淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120共培养实现的。
10.权利要求7至9中任一所述方法制备得到的产脂肪酸工程菌。
全文摘要
本发明公开了产脂肪酸工程菌及其制备方法和应用。本发明提供的制备产脂肪酸工程菌的方法，是灭活淡水丝状蓝细菌Anabaena sp.PCC 7120中asr1131蛋白，得到产脂肪酸工程菌；所述asr1131蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所示。用所述方法制备得到的工程菌，细胞内的游离钙离子浓度升高，类囊体膜增多并充斥整个细胞，内膜组分多于野生菌，生长速度快于野生菌，总脂肪酸含量高于野生菌，很多重要脂肪酸含量也高于野生菌。
文档编号C07K14/195GK102191241SQ201010119259
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者张蔚, 赵进东 申请人:北京大学