专利名称：一种表达重组Cry1C基因的大肠杆菌工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种高效表达重组CrylC基因的大肠杆菌工程菌、其构建方法及诱导培养方法。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性的产孢细菌，该菌体能分泌一种特殊的抗虫晶 体蛋白——S-内毒素，δ-内毒素是目前主要的生物农药之一。苏云金芽孢杆菌的内毒素 按氨基酸序列相似性被分为两类，即Cry和Cyt δ -内毒素。其中，Cry毒素对多种有害昆 虫幼虫具有毒性如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，膜翅目，同翅目，直翅目，食毛目，线虫类，螨类 和原生动物等。此类毒素已经在商业化农业，森林管理和蚊虫控制中作为化学合成农药的 替代品被广泛应用。Cry毒素还能被转入转基因植物中，从而使植物具有抗虫特性。自从Schn印f在1981年从HD21Dipel中克隆出第一个Cry基因以来，已有433种 晶体蛋白基因被克隆。这些基因按照它们的氨基酸序列可以被分为49种，93个亚种，147 类，328小类。其中，CrylA类蛋白基因是目前世界上应用于转基因植物最为广泛的δ-内 毒素基因类型，从而使作物产生抗虫特性。但是，由于CrylA类毒素的广泛使用，致使有些有害昆虫幼虫逐渐对其产生抗性。 而CrylC毒素能有效的抵抗鳞翅目害虫，可作为CrylA毒素的替代物或与CrylA毒素融合 表达得到进一步的抗虫蛋白。为了解决CrylC蛋白无法在大肠杆菌中表达的问题，本发明通过设计PCR引物，对 CrylC基因5’端的前86个密码子进行修改，从而使其在大肠杆菌中高效表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能在大肠杆菌中高效表达的重组CrylC基因。本发明的另一目的在于提供一种含有所述重组CrylC基因的表达载体。本发明的目的还在于提供能够高效表达重组CrylC基因的大肠杆菌工程菌及其 构建方法。本发明的再一目的在于提供所述大肠杆菌工程菌的诱导培养方法。本发明的目的还在于提供由所述大肠杆菌工程菌表达的CrylC蛋白的纯化方法。为了实现本发明的目的，使CrylC蛋白在大肠杆菌中能够稳定高效表达，本发明 人通过设计PCR引物，对来源于转基因大米T1C-19的CrylC基因(其具有如Seq ID No: 1所示的核苷酸序列)的前86个密码子进行修改，将其中的稀有密码子替换为大肠杆菌偏 爱密码子(如图1所示)，得到重组CrylC基因，即CrylC-rcp基因，其具有如Seq ID No 2所示的核苷酸序列。所述PCR 弓丨物包括上游引物 5，-TGGAGGAGAACAATCAGAACCAGTGTATCCCGTACAATTGTC TGAGCAATCCGGAAGAAGTTCTGCTGGATGGCGAACGCATCTC-3，和下游引物 5，-TCATCACTTTTGTGCGCG TTCAAGGTCAGATTCTGC-3’。由于密码子的简并性，修改后的CrylC-rcp基因序列能够与原序列表达同样的蛋白。含有上述修改后的CrylC基因序列的表达载体，其出发载体为PET_28a(+)。为了获得构建原核表达载体质粒，本发明将上述修改密码子后的CrylC-rcp基因 序列，用PCR方法在5’端加上GGATCC以构成BamHI酶切位点，3’端加上CATATG以构成 Nde I酶切位点，然后经BamHI及Nde I消化后，即可直接克隆至PET_28a(+)质粒，得到 PET-28a(+)-CrylC-rcp质粒，用于该基因的大量复制及表达。本发明选择使用PET_28a(+)表达载体，这是因为pET系统是有史以来在大肠杆菌 (E. coli)中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受 噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。 T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达 目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。此外 PET-28a(+)设计了 6个组氨酸的纯化位点，组氨酸能够提供配位电子与某些金属离子(如 Ni2+)螯合，6个连续的组氨酸可以使蛋白有效吸附于含Ni2+的层析填料上，因而可以利用金 属螯合层析来纯化融合蛋白，从而极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，非常适合大规 模制备。本发明将上述PET_28a(+)-CrylC-rcp原核表达载体转入大肠杆菌，然后进行重 组克隆的筛选，从而获得大肠杆菌工程菌，其出发菌株优选为BL21 (DE3)。所述大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤1)用PCR方法修改CrylC基因序列的前86个密码子，获得CrylC-rcp基因；然后 在5，端加上GGATCC构成BamH I酶切位点，在3，端加上CATATG构成Nde I酶切位点；2)将上述修改后的CrylC基因插入到质粒载体中；3)然后将载体转入大肠杆菌，进行重组克隆筛选，获得大肠杆菌工程菌。为了获得CrylC重组蛋白的高效表达，所述工程菌在如下条件下诱导培养，工程 菌于37°C温度下培养至对数生长期，按3% 5% (体积百分数)接种于LB培养基，当0D_ =0. 6 1. 0时，加入IPTG至终浓度为0. 01 2mmol/L，在温度15 37°C、200rpm的条件 下诱导培养1 6h，离心获得菌体，每200mL培养物能获得3g菌体。优选的诱导培养条件为加入IPTG至终浓度为0. 05mmol/L,在温度37°C、200rpm 的条件下诱导培养4h，离心获得菌体，蛋白表达量达到52. 9% (g CrylC蛋白/g包涵体总 蛋白)。本发明的诱导培养条件中，IPTG的终浓度对目的蛋白表达量影响不大，在IPTG低 浓度(0.05mmol/L)诱导条件下，目的蛋白已经有大量表达，随着IPTG浓度的增加，蛋白表 达量增加不明显(如图3所示)；目的蛋白的诱导表达量随着诱导时间的增加而增加，当诱 导时间达到4h后目的蛋白的表达量趋于稳定(如图5所示)；诱导温度对目的蛋白的诱导 表达量也有一定影响，本发明研究了在较低温度(15°C、20°C )及较高温度(30°C、37°C )下 目的蛋白在菌体裂解液上清和包涵体中的表达情况，当诱导温度为15°C或20°C时，CrylC 目的蛋白有可溶形式表达；诱导温度为30°C或37°C时，目的蛋白几乎均以包涵体的形式存 在；从蛋白表达的总量上来讲37°C时得到的目的蛋白是最多的(如图4所示)。为了分离纯化CrylC重组蛋白，本发明还提供了由上述工程菌所表达的CrylC重 组蛋白的纯化方法，包括如下步骤
1)提取并溶解含有CrylC重组蛋白的包涵体；2)然后用His TrapTM FF凝胶柱进行亲和层析；3)梯度透析，复性CrylC重组蛋白。具体地说，本发明中CrylC的纯化方法包括如下步骤1)在菌体中加入裂解液及溶菌酶，超声破碎，提取并溶解含有CrylC重组蛋白的 包涵体；用洗涤液超声洗涤2次，然后用尿素洗涤液超声洗涤1次，得到包涵体蛋白；所述裂解液含有50mmol/L Tris-ClU0mmol/L EDTA、lOOmmol/LNaCl、调 pH 至 8· 0 ；所述洗涤液含有 50mmol/L Tris-Cl、lOmmol/LEDTA、100mmol/L NaCl.O. 5% (体积) Triton及lOmmol/L β -巯基乙醇，调pH至8. 0 ；所述尿素洗涤液含有lOOmmol/L Tris-Cl 及lmol/L尿素，调pH至8.0。2)然后将上述包涵体蛋白溶于结合缓冲液，与His TrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤 缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；所述结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、0. 5mol/LNaCl、8mol/L尿 素、调pH至8. 0 ；所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、0. 5mol/L NaCl, 8mol/L尿素、调pH至8. 0 ；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、0. 5mol/ LNaCl、8mol/L 尿素、调 pH 至 8. 0 ；3)然后用尿素缓冲液对上述目的蛋白进行梯度透析，每种浓度的尿素缓冲液均在 8h内透析3次，复性CrylC重组蛋白；所述尿素缓冲液的pH = 8. 0，其成分为50mmol/L Tris-Cl及尿素，所述尿素的浓 度依次为 8、6、4、2、1、0. 5、0mol/L。本发明的纯化方法，通过使用洗涤缓冲液洗涤细胞碎片杂质，能使CrylC重组蛋 白纯度达到86. 7%。另外，通常使用的亲和层析具有特异性高，纯化效率高，产物纯度高等 优点，但价格昂贵、成本较高；本发明采用金属M2+螯合亲和层析，其利用表达的融合蛋白 上6个组氨酸所提供的配位电子与Ni2+螯合，6个连续的组氨酸序列可以使重组蛋白很好地 吸附于含金属Ni2+的层析填料上，从而利用金属螯合层析来纯化融合蛋白，极大的简化了 重组蛋白的下游纯化工作，纯度达95%以上，且纯化效率高，成本低，非常适合大规模制备。由于尿素能够使包涵体蛋白变性、可溶，而在短时间内大幅降低尿素浓度会使包 涵体蛋白出现大量沉淀，因此使用尿素缓冲液梯度透析，可以使CrylC重组蛋白慢慢回复 天然结构及活性(如图6所示)。本发明克服了 CrylC蛋白在大肠杆菌中无法表达的技术难题，经研究表明，靠近 5’端的密码子对蛋白表达具有决定性影响，因此本发明人通过修改5’端的密码子，使得 CrylC蛋白在大肠杆菌中高效表达。与此相对，本发明人尝试使用了常规表达方法，但是未 见外源蛋白表达；另外还应用了 BL21(DE3)-CodonPluS进行表达，但是表达情况并无明显 改善。但是如果用GST标签克隆表达载体便能表达出大量蛋白。这可能是由于GST标签载 体的标签较大，这也从另一方面证实了靠近5’端的密码子对CrylC蛋白表达具有决定性影 响的观点。本发明通过设计PCR引物，对CrylC基因5’端的前86个密码子进行了修改，将其 中的稀有密码子替换为大肠杆菌偏爱密码子，从而使其在大肠杆菌中高效表达。本发明由 大肠杆菌工程菌表达的CrylC蛋白与水稻中的CrylC蛋白具有相同的免疫原性(图7)。
本发明的优点在于
1、本发明通过PCR方法修改CrylC基因，用大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密 码子，使得在表达同样蛋白的同时，能够由大肠杆菌高效表达，其蛋白表达量达52. 9% (g CryC蛋白/g包涵体总蛋白)；而使用常规表达方法则未见外源蛋白表达；用 BL21 (DE3)-CodonPlus进行表达，也没有明显改善。2、使用PET_28a(+)作为表达载体，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控 制，表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性， 诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上，能够实现CrylC 基因的高效表达。3、本发明利用表达的融合蛋白上6个组氨酸能提供配位电子与某些金属离子螯 合的特点，采用金属M2+螯合亲和层析来纯化融合蛋白，极大地简化了重组蛋白的后续纯 化工作，纯度高达95 %以上，且纯化效率高、成本低，适合大规模制备。
图1为本发明对CrylC基因的前86个密码子进行替换的示意图，上排为原CrylC 核苷酸序列、下排为修改后的CrylC核苷酸序列。图2为本发明的PCR方法修改基因序列、重组质粒的酶切鉴定电泳图，其中，M为 DL2000Marker ；Al A3分别为修改后引物PCR产物、阳性对照、阴性对照；Bl B2分别为 重组质粒双酶切产物、目的基因PCR产物对照。图3为本发明不同浓度IPTG对CrylC重组蛋白表达影响的SDS-PAGE分析，其中， M为低分子量标准蛋白；1为空载表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)包涵体总蛋白；2 8依次为 IPTG 浓度 0. 01,0. 05,0. 1,0. 2,0. 5,1. 0,2. Ommol/L 的重组表达菌 BL21 (DE3)-pET28a(+) / CrylC诱导表达包涵体总蛋白。图4为本发明不同诱导温度对CrylC重组蛋白表达影响的SDS-PAGE分析，其中，M 为低分子量标准蛋白；1为空载表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)诱导后包涵体总蛋白；2 5 依次为诱导温度15、20、30、37 °C下重组表达菌BL21 (DE3) -pET28a (+) /Cry IC诱导表达包涵 体总蛋白。图5为本发明不同诱导时间对CrylC重组蛋白表达影响的SDS-PAGE分析，其中，M 为低分子量标准蛋白；1为空载表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)包涵体总蛋白；2 7依次为 诱导时间l、2、3、4、5、6h的重组表达菌BL21(DE3)-pET28a(+)/CrylC诱导表达包涵体总蛋白。图6为本发明CrylC蛋白纯化复性电泳图，其中，M为低分子量标准蛋白；1为透析 复性后CrylC蛋白；2为His TrapTM FF凝胶柱纯化后CrylC蛋白；3为洗涤后的包涵体蛋 白；4为未处理包涵体蛋白。图7为水稻CrylC蛋白与本发明原核表达CrylC蛋白的WesternBlot其中M 低分子量标准蛋白；1 水稻CrylC蛋白；2 本发明原核表达CrylC蛋白。图8为本发明CrylC蛋白的HPLC-MS/MS图谱。
具体实施例方式实施例11、用PCR方法修改CrylC基因用修改后的上游引物5，-TGGAGGAGAACAATCAGAACCAGTGTATCCCGTACAATTGTCTGAGC AATCCGGAAGAAGTTCTGCTGGATGGCGAACGCATCTC-3，及下游引物 5，-TCATCACTTTTGTGCGCGTTC AAGGTCAGATTCTGC-3，；从转基因大米T1C-19基因组中扩增并修改CrylC基因(转基因大 米T1C-19由华中农业大学张启发院士实验室提供)，5’端的稀有密码子被替换(如图1 所示)。用琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带后通过T4DNA连接酶于4°C连接过夜 至pGEM-T载体，然后转化至大肠杆菌DH5 α ；转化株先经过蓝白斑筛选，然后再用PCR扩增 (扩增的程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个 循环；72°C再延伸IOmin)及测序鉴定，修改后的基因命名为CrylC_rcp基因。2、构建表达载体通过带有酶切位点的上游引物5，GCGGATCCTCATCACTTTTGTGCGC-3’ (下划线部分 为 BamH I 酶切位点)和下游引物 5’ -GGAATTCCATATGGAGGAGAACAATCAGAACC-3‘(下划线部 分为Nde I酶切位点)，用PCR方法扩增CrylC-rcp基因，PCR产物经BamH I和Nde I消化 后插入pET_28a(+)的BamH I和Nde I位点，将此质粒转入大肠杆菌DH5 α，提取转化株质 粒经BamH I和Nde I酶切、测序鉴定后，转入大肠杆菌BL21 (DE3)。3、表达重组蛋白将6mL的过夜培养物(上述含有表达载体的大肠杆菌BL21 (DE3)用LB培养基培 养约12h)加入200mL的含有100 μ g/mL卡那霉素的LB培养基(Luria-Bertani，含胰 化蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl)中，在37°C温度下振荡培养，当OD6tltl = 0. 8时，加入 IPTG诱导液至终浓度为0. 05mmol/L，在37°C温度下诱导培养4h ；最后在12000r/min离心 IOmin收集菌体，并通过SDS-PAGE进行分析。4、提取并溶解包涵体取3g菌体加入 20mL裂解液(50mmol/L Tris-Cl, lOmmol/LEDTA, 100mmol/L NaCl, ρΗ = 8. 0)中，加入溶菌酶至lmg/mL，在37°C孵育30min，每隔IOmin搅动一次；然后在冰 浴条件下超声破碎，功率200 300W，每次超声10s，间隔10s，共超声30次；然后在4°C温 度下，在12000r/min离心20 30min沉淀包涵体，弃上清；加入30mL洗涤液(50mmol/L Tris-Cl, 10mmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl,0. 5% (体积)Triton，lOmmol/L β-巯基乙醇， ρΗ = 8. 0)超声波洗涤，即用功率200 300W超声波破碎，每次超声10s，间隔10s，共超声 10次；然后在4°C温度下，在12000r/min离心20min沉淀包涵体，弃上清；重复超声波洗涤 两次，然后加入20mL尿素洗涤液(lOOmmol/LTris-Cl，lmol/L尿素，ρΗ = 8. 0)超声波洗涤 一次，得到纯度较高的包涵体蛋白；最后用无菌水洗涤包涵体两次，冻干，-80°C保存。5、纯化包涵体蛋白将上述包涵体蛋白溶解于结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠，40mmol/L咪唑，0.5mol/ L NaCl，8mol/L尿素，ρΗ = 8.0)中，备用。His TrapTM FF凝胶柱用IOmL双蒸水洗涤后 用IOmL结合缓冲液平衡，然后使目的蛋白与凝胶柱结合，没有结合的蛋白用洗涤缓冲液 (20mmol/L 磷酸钠，100mmol/L 咪唑，0. 5mol/L NaCl，8mol/L 尿素，ρΗ = 8. 0)除去，最后用 洗脱缓冲液(20mmol/L 磷酸钠，500mmol/L 咪唑，0. 5mol/L NaCl，8mol/L 尿素，ρΗ = 8. 0)洗脱，得到目的蛋白，纯度达95.6%。6、复性重组蛋白纯化后的CrylC 蛋白用透析缓冲液(50mmol/L Tris_Cl，pH = 8. 0，8mol/L，6mol/ L，4mol/L, 2mol/L, lmol/L, 0. 5mol/L, Omol/L尿素)在4°C温度下梯度透析，每种尿素浓度 均在8h内透析3次；重新折叠后的CrylC蛋白在50mmol/L Tris-Cl (pH = 8. 0)缓冲液中， 以12000r/min离心15min去除不溶蛋白。7、鉴定蛋白SDS-PAGE电泳后的凝胶，经电转仪将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，在室温下，将 膜置于5% (质量体积比，g/mL)脱脂牛奶中封闭2h;然后在兔抗CrylC多克隆抗体中孵育 2h,用TBST洗涤6次后再用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG孵育2h，再用TBST洗涤6次后通 过BCIP-NBT显色。将电泳后的目的条带切下，用胰蛋白酶进行胶内酶解，得到多肽混合物；然后经过 连有HPLC的2D-LTQ-MS/MS检测，MS/MS图谱通过软件分析，最后将数据在NCBI上比对得 出最后结果，结果如图8所示。实验例1本发明中不同IPTG终浓度、不同诱导温度及不同诱导时间对CrylC重 组蛋白表达的影响1、不同浓度的IPTG诱导剂对CrylC重组蛋白表达的影响当菌液的0D_ = 0. 8时，向7个无菌小三角瓶中等量分装一定体积的菌液，然后 依次向各瓶中加入IPTG至终浓度分别为0. 01,0. 05,0. 1,0. 2,0. 5,1. 0,2. Ommol/L，空载对 照(即将pET-28a(+)质粒直接转入BL21(DE3)菌株中)加入IPTG至终浓度为lmmol/L，于 37°C温度下诱导表达4h，结果如图3所示。2、诱导温度对CrylC重组蛋白表达的影响当菌液的0D_ = 0.8时，向4个无菌三角瓶中等量分装一定体积的菌液，加入 IPTG至终浓度为0. 05mmol/L，分别于15、20、30、37°C温度下诱导表达4h，结果如图4所示。3、诱导时间对CrylC重组蛋白表达的影响当菌液的0D, = 0.8时，将菌液装入无菌三角瓶中，加入IPTG至终浓度为 0. 05mmol/L，于37°C诱导培养6h，每隔lh取样检测，结果如图5所示。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及实验例对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
权利要求
一种重组CrylC基因，其具有如Seq ID No2所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因序列的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，其出发载体为PET-28a(+)。
4.含有权利要求2或3所述载体的宿主，其特征在于，其为大肠杆菌工程菌。
5.如权利要求4所述的宿主，其特征在于，其出发菌株为BL21(DE3)。
6.一种构建权利要求4或5所述工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤1)用PCR方法修改CrylC基因序列的前86个密码子；然后在5’端加上GGATCC构成 BamH I酶切位点，在3，端加上CATATG构成Nde I酶切位点；2)将上述修改后的CrylC基因插入到质粒载体中；3)然后将载体转入大肠杆菌，进行重组克隆筛选，获得大肠杆菌工程菌。
7.权利要求4或5所述工程菌的诱导培养方法，包括如下步骤工程菌于37°C温度下 培养至对数生长期后，按3% 5% (体积百分数)接种于LB培养基，当0D6(KI = 0. 6 1. 0 时，加入IPTG至终浓度为0. 01 2mmol/L，在温度15 37°C、200rpm的条件下诱导培养 1 6h，离心获得菌体。
8.如权利要求7所述的诱导培养方法，其特征在于，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/ L，诱导培养温度37°C，诱导培养时间4h。
9.一种权利要求4或5所述工程菌表达的CrylC蛋白的纯化方法，包括如下步骤1)提取并溶解含有CrylC重组蛋白的包涵体；2)然后用HisTrapTM FF凝胶柱进行亲和层析；3)然后通过梯度透析，复性CrylC重组蛋白。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤1)在菌体中加入裂解液及溶菌酶，超声破碎，提取并溶解含有CrylC重组蛋白的包涵 体；用洗涤液超声洗涤2次，然后用尿素洗涤液超声洗涤1次，得到包涵体蛋白；所述裂解液含有 50mmol/L Tris-Cl、10mmol/L EDTA、lOOmmol/LNaCl、调 pH 至 8. 0 ；所 述洗涤液含有50mmol/L Tris-Cl、lOmmol/LEDTA、100mmol/L NaCl.0. 5% (体积)Triton及 lOmmol/L ^ -巯基乙醇，调pH至8. 0 ；所述尿素洗涤液含有lOOmmol/L Tris-Cl及lmol/L 尿素，调pH至8.0。2)然后将上述包涵体蛋白溶于结合缓冲液中，与HisTrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓 冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；所述结合缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、0. 5mol/LNaCl、8mol/L尿素、调 pH至8. 0 ；所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、0. 5mol/L NaCl、8mol/L 尿素、调pH至8. 0 ；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、0. 5mol/LNaCl、 8mol/L 尿素、调 pH 至 8. 0 ；3)然后用尿素缓冲液对上述目的蛋白进行梯度透析，每种浓度的尿素缓冲液均在8h 内透析3次，复性CrylC重组蛋白；所述尿素缓冲液的PH = 8. 0，其成分为50mmol/L Tris-Cl及尿素；所述尿素的浓度依 次为 8、6、4、2、1、0. 5、0mol/L。
全文摘要
本发明提供了一种重组CrylC基因、含有该基因序列的表达载体，以及能够高效表达重组CrylC基因的大肠杆菌工程菌；另外，本发明还提供了所述大肠杆菌工程菌的诱导培养方法，以及由所述大肠杆菌工程菌表达的CrylC重组蛋白的纯化方法。本发明通过PCR方法，将CrylC基因的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，使其能够由大肠杆菌高效表达；本发明采用金属Ni2+螯合亲和层析来纯化融合蛋白，极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，纯度高达95％以上，且纯化效率高、成本低，适合大规模制备。
文档编号C07K1/14GK101831441SQ20101013506
公开日2010年9月15日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者元延芳, 曹思硕, 李欣, 罗云波, 许文涛, 贺晓云, 黄昆仑 申请人:中国农业大学