专利名称：一种胸腺素α1的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及胸腺素α 1的纯化方法。
背景技术：
胸腺素α 1 (Thymosin α 1)是由胸腺素组分5 (TF_5)中分离纯化得到一种小分子 生物活性多肽，由28种氨基酸排列而成，分子量3108. 37，其含量约占TF-5的0. 6%，具有 较高的免疫增强活性。胸腺肽α 作用机制主要是作用于T淋巴细胞分化、发育及成熟的 各个阶段，从而调节细胞免疫功能，增强机体防病和抗病能力，是一种市场应用前景好的多 肽药物。
发明内容
本发明提出了一条适于产业化纯化胸腺素α 1的工艺方法，使用反相高效液相色 谱法纯化胸腺素α 1，纯度高且收率好，达到产业化要求。为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下步骤为1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸的水溶液为A相，乙腈为B相， 梯度-60%，将粗肽溶液进行梯度洗脱；所述“三氟乙酸的水溶液”的浓度为0. 01% -1%，优选为0. 05% -0. 3%。所述“粗 肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未经过精制处理的胸腺素α 1粗肽或者纯 度不能满足药用的胸腺素α 。“粗肽溶液”是指粗肽溶于纯净水所得到的溶液，纯净水符 合注射用水标准，优选超纯水。优选“乙腈”的纯度级别优选色谱纯。步骤1)下文也表述 为纯化。2)转盐采用反相高效液相色谱法将三氟乙酸盐转成无盐。所述“反相高效液相色谱”的固定相为八烷基硅烷键合硅胶。所述“转盐”指用含 5%乙腈的水冲洗，再用50%乙腈洗脱将胸腺素α 1三氟乙酸盐转成无盐的胸腺素α 1。纯化规模包括以下规格色谱柱5cmX25cm(柱子直径X长度)、15cmX25cm、 30cmX 25cm。
具体实施例方式实施例一1.样品处理粗肽用超纯水溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。2.纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为5cmX25cm。流动相A相:0. 05%三氟乙酸水溶液，B相乙腈，流速:50_80ml/min。 检测波长:230歷。梯度:B% 10% -60% (洗脱时间50min)。进样量为1. 5_2g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1. 5_2g。 线性梯度洗脱50min，收集目的峰，将收集的胸腺素α 1溶液于水温不超过35°C下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/mL后备用。3、转盐色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为5cmX25cm。将色谱柱用50%以上的乙腈水溶液冲洗干净后上样，上样量1. 5_2g，用含5% 乙腈的水冲洗15-30min，最后用50%乙腈洗脱，收集目的峰，将收集的胸腺素α 1溶液于水 温不超过35°C下减压旋蒸浓缩至约150-200mg/mL后转至合适大小容器。冷冻干燥后即可 得到纯度大于98%的胸腺素α 1。实施例二1.样品处理粗肽用超纯水溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。2.纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长 度为15cmX25cm。流动相A相0. 3%三氟乙酸水溶液；B相乙腈，流速:450_550ml/min。 检测波长230nm。梯度B% 10% -60% (洗脱时间50min)。进样量为10_15g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为10_15g。 线性梯度洗脱50min，收集目的峰，将收集的胸腺素α 1溶液于水温不超过35°C下减压旋蒸 浓缩至约10-20mg/mL后备用。3、转盐色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为 15cmX25cm。将色谱柱用50%以上的乙腈水溶液冲洗干净后上样，上样量10_15g，用含5% 乙腈的水冲洗15-30min，最后用50%乙腈洗脱，收集目的峰，将收集的胸腺素α 1溶液于水 温不超过35°C下减压旋蒸浓缩至约150-200mg/mL后转至合适大小容器。冷冻干燥后即可 得到纯度大于98%的胸腺素α 1。实施例三1.样品处理粗肽用超纯水溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。2.纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长 度为:30cmX25cm。流动相A相0. 三氟乙酸水溶液；B相乙腈，流速:1900_2200ml/ min。检测波长230nm。梯度B% 10% -60% (洗脱时间50min)。进样量为55_75g。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为55_75g。 线性梯度洗脱50min，收集目的峰，将收集的胸腺素α 1溶液于水温不超过35°C下减压旋蒸 浓缩至约10-20mg/mL后备用。3、转盐色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为 30cmX25cm。将色谱柱用50%以上的乙腈水溶液冲洗干净后上样，上样量55_75g，用含5% 乙腈的水冲洗15_30mi n，最后用50%乙腈洗脱，收集目的峰，将收集的胸腺素α 1溶液于 水温不超过35°C下减压旋蒸浓缩至约150-200mg/mL后转至合适大小容器。冷冻干燥后即 可得到纯度大于98%的符合标准要求的胸腺素α 。综上所述，用以上方法纯化胸腺素α 1操作简单可行、精品纯度高于98%、收率理 想、纯化成本较低，达到产业化要求。
权利要求
一种胸腺素α1的纯化方法，包括以下步骤1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸的水溶液为A相，乙腈为B相，梯度B％10％-60％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；2)转盐采用反相高效液相色谱法将三氟乙酸盐转成无盐。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤1)的A相的三氟乙酸水溶液的三氟乙 酸浓度为0. 05% -0.3%。
3.根据权利要求1至2任意一项所述方法，其特征在于步骤2)的反相高效液相色谱 的固定相为八烷基硅烷键合硅胶。
4.根据权利要求1至2任意一项所述方法，其特征在于步骤2)用含5%乙腈的水冲 洗，再用50%乙腈洗脱将胸腺素a 1三氟乙酸盐转成无盐的胸腺素a 1。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于步骤2)用含5%乙腈的水冲洗，再用50% 乙腈洗脱将胸腺素a 1三氟乙酸盐转成无盐的胸腺素a 1。
全文摘要
本发明提出了一条适于产业化纯化胸腺素α1的工艺方法，包括以下步骤以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸的水溶液为A相，乙腈为B相，梯度B％10％-60％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；转盐采用反相高效液相色谱法将三氟乙酸盐转成无盐。本发明采用一步反相高效液相色谱法纯化，一步反相高效液相色谱法转盐，使得纯化胸腺素α1纯度高且收率好，达到产业化要求。
文档编号C07K1/20GK101798335SQ20101013899
公开日2010年8月11日 申请日期2010年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者戴柱, 袁建成, 覃亮政, 马亚平 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司