专利名称：：以聚乙二醇作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选96条件试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于蛋白质结晶筛选的96条件试剂盒，特别是以不同分子量的聚乙二醇(PEG)作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的96条件试剂盒。
背景技术：
：HamptonResearch公司公开的名为Index的96条件筛选试剂盒的具体组成如下表，包括三部分，沉淀剂、盐、缓冲液。沉淀剂主要包括铵盐、钠盐、镁盐、磷酸盐、甲酸盐、有机物、聚合物等，其浓度都较高，在2M左右；盐主要包括钠盐、镁盐、钙盐、硫酸盐、醋酸盐、酒石酸盐等，其浓度较低，在IM以下；缓冲液包括6种，浓度是0.1M，pH值范围从3到9。表1:IndexTM96条件成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>文献l“CyclingTemperatureStrategy:AMethodtoImprovetheEfficiencyofCrystallizationConditionScreeningofProteins,CrystalGrowth&Design,2008,8(12):4227-4232”公开了采用上述Index的96条件筛选试剂盒对溶菌酶、刀豆球蛋白、蛋白酶K、过氧化氢酶、α-糜蛋白酶原、竹与蛋白等几种蛋白进行了结晶条件筛选研究，统计出其成功率分别为29.2%,4.2%,58.3%U5.6%,26.0%,3.1%。但是Index的局限在于所用沉淀剂都是随机选取，无针对性，对蛋白质结晶的成功率还有待提高；而且所用试剂种类较多，成本较高。
发明内容为了克服现有的96条件筛选试剂盒在蛋白质结晶条件筛选中成功率低的不足，本发明提供一种以聚乙二醇作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选96条件试剂盒，可以提高蛋白质结晶条件筛选成功率。本发明解决其技术问题所采用的技术方案为一种以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特点是成分组成如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>所述沉淀是PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG3350、PEG400、PEG1000、PEG2000或PEG1500任一种。浓度为10%30%ν/ν。所述添加剂是硫酸铵、甲酸钠、氯化镁、丙二酸钠、2-甲基-2，4戊二醇、乙二醇、异丙醇、TacsimatePH7.0、甘氨酸、酒石酸钾钠或乙二胺四乙酸任一种。其浓度为0.1Μ。所述缓冲液是乙酸钠、柠檬酸钠、2，2_双二羟甲基苯胺或Ν-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸。浓度为0.1Μ。ρΗ值范围从4到8。本发明的有益效果是①本试剂盒所选沉淀剂是BMCD数据库中统计出的使用频率最高的前8种PEG，不是随机选取，所以会显著提高生物大分子结晶的成功率，比如刀豆球蛋白的成功率从4.2%提高到81.2%，溶菌酶的成功率从29.2%提高到46.9%，蛋白酶K的成功率从58.3%提高到66.7%，过氧化氢酶的成功率从15.6%提高到30.2%。②本试剂盒只用了8种PEG，11种添加剂，4种缓冲液，所用试剂种类较少，而且浓度相对较低，所以相对
背景技术：
试剂盒成本较低，有商业推广价值。具体实施例方式配制PEGGridScreen96筛选条件以Al(0.IM的PH4.6的三水醋酸钠、20%的PEG4000、0.IM硫酸铵)为例第一步配好浓度为0.1M，PH4.6的醋酸钠缓冲液；第二步称好PEG4000和硫酸铵(假如配制体积为50ml)至50ml烧杯中，加入配制好的醋酸钠缓冲液，使其溶解后置50ml容量瓶中定容；第三步将定容好的溶液用滤膜过滤到50ml的管中，Al条件配制完毕。同样的方法配制其他条件。下面用几种蛋白质的结晶实验来验证该试剂盒的效果。实施例1用上述配制的PEGGridScreen96条件对刀豆球蛋白(ConcanavalinA)进行条件筛选。第一步将美国Sigma公司的货号为L7647的刀豆球蛋白，溶于ρΗ为7.0，浓度为0.025mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N’_2_乙磺酸-Na缓冲液中，配制成浓度为20mg/ml的刀豆球蛋白溶液，用0.22μm的滤膜滤去杂质。第二步用上述96条件对刀豆球蛋白结晶条件进行筛选。第三步使用坐滴板，每深孔中加入90μ1的池液，使用自动移液系统将1μ1筛选结晶剂和μ1蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。第四步上述结晶溶液体系在20°C温控箱中放置7天后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现刀豆球蛋白晶体的条件数目。经过统计得到结果如下刀豆球蛋白结晶的成功率为81.2%，与文献1相比其成功率提高了77.0%，有大幅提高。实施例2用上述配制的PEGGridScreen96条件对溶菌酶(Iysozyme)进行条件蹄选。第一步将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶于PH为7.0，浓度为0.025mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N’_2_乙磺酸-Na缓冲液中，配制成浓度为40mg/ml的溶菌酶溶液，用0.22μm的滤膜滤去杂质。第二步用上述96条件对溶菌酶结晶条件进行筛选。第三步使用坐滴板，每深孔中加入90μ1的池液，使用自动移液系统将1μ1筛选结晶剂和μ1蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。第四步上述结晶溶液体系在20°C温控箱中放置7天后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现溶菌酶晶体的条件数目。经过统计得到结果如下溶菌酶结晶的成功率为46.9%，与文献1相比其成功率提高了17.7%，有显著提高。实施例3用上述配制的PEGGridScreen96条件对蛋白酶!((proteinaseK)进行条件筛选。第一步将美国Sigma公司的货号为P6556的蛋白酶K，溶于pH为7.0，浓度为0.025mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-Na缓冲液中，配制成浓度为30mg/ml的蛋白酶K溶液，用0.22μm的滤膜滤去杂质。第二步用上述96条件对蛋白酶K结晶条件进行筛选。第三步使用坐滴板，每深孔中加入90μ1的池液，使用自动移液系统将1μ1筛选结晶剂和μ1蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。第四步上述结晶溶液体系在20°C温控箱中放置7天后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现蛋白酶K晶体的条件数目。经过统计得到结果如下蛋白酶K结晶的成功率为66.7%，与文献1相比其成功率提高了8.4%，有显著提高。实施例4用上述配制的PEGGridScreen96条件对过氧化氢酶(Catalase)进行条件筛选。第一步将美国Sigma公司货号为C0615的过氧化氢酶，溶于pH为7.00，浓度为0.025mol/LN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-Na缓冲液中，配制成浓度为20mg/ml的过氧化氢酶溶液，用0.22μm的滤膜滤去杂质。第二步用上述96条件对过氧化氢酶结晶条件进行筛选。第三步使用坐滴板，每深孔中加入90μ1的池液，使用自动移液系统将1μ1筛选结晶剂和μ1蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。第四步上述结晶溶液体系在20°C温控箱中放置7天后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现过氧化氢酶晶体的条件数目。经过统计得到结果如下过氧化氢酶结晶的成功率为30.2%，与文献1相比其成功率提高了14.6%，有显著提高。除上述的实施例外，本发明方法也用于竹与蛋白、核糖核酸酶A、乳白蛋白、糜蛋白酶以及糜蛋白酶原等结晶条件的筛选，得到的蛋白质结晶筛选成功率也有显著提高。权利要求一种以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特征在于成分组成如下表序号缓冲液pH沉淀剂添加剂A10.1M乙酸钠pH4.620％PEG40000.1M硫酸铵A20.1M柠檬酸钠PH5.620％PEG40000.1M甲酸钠A30.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.520％PEG40000.1M氯化镁A40.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG40000.1M丙二酸钠A50.1M乙酸钠pH4.625％PEG400010％v/v2-甲基-2，4戊二醇A60.1M柠檬酸钠PH5.625％PEG400010％v/v乙二醇A70.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.525％PEG400010％v/v异丙醇A80.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG40000.1M丙二酸钠A90.1M乙酸钠pH4.630％PEG40000.1M甘氨酸A100.1M柠檬酸钠PH5.630％PEG40000.1M酒石酸钾钠A110.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.530％PEG40000.01M乙二胺四乙酸A120.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.530％PEG400010％v/vTacsimatePH7.0B10.1M乙酸钠pH4.610％PEG80000.1M硫酸铵B20.1M柠檬酸钠PH5.610％PEG80000.1M甲酸钠B30.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.510％PEG80000.1M氯化镁B40.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.510％PEG80000.1M丙二酸钠B50.1M乙酸钠pH4.615％PEG800010％v/v2-甲基-2，4戊二醇B60.1M柠檬酸钠PH5.615％PEG800010％v/v乙二醇B70.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.515％PEG800010％v/v异丙醇B80.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG80000.1M丙二酸钠B90.1M乙酸钠pH4.620％PEG80000.1M甘氨酸B100.1M柠檬酸钠PH5.620％PEG80000.1M酒石酸钾钠B110.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.520％PEG80000.01M乙二胺四乙酸B120.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG800010％v/vTacsimatePH7.0C10.1M乙酸钠pH4.610％PEG60000.1M硫酸铵C20.1M柠檬酸钠PH5.610％PEG60000.1M甲酸钠C30.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.510％PEG60000.1M氯化镁C40.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.510％PEG60000.1M丙二酸钠C50.1M乙酸钠pH4.615％PEG600010％v/v2-甲基-2，4戊二醇C60.1M柠檬酸钠PH5.615％PEG600010％v/v乙二醇C70.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.515％PEG600010％v/v异丙醇C80.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG60000.1M丙二酸钠C90.1M乙酸钠pH4.620％PEG60000.1M甘氨酸C100.1M柠檬酸钠PH5.620％PEG60000.1M酒石酸钾钠C110.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.520％PEG60000.01M乙二胺四乙酸C120.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG600010％v/vTacsimatePH7.0D10.1M乙酸钠pH4.620％PEG33500.1M硫酸铵D20.1M柠檬酸钠PH5.620％PEG33500.1M甲酸钠D30.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.520％PEG33500.1M氯化镁D40.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG33500.1M丙二酸钠D50.1M乙酸钠pH4.625％PEG335010％v/v2-甲基-2，4戊二醇D60.1M柠檬酸钠PH5.625％PEG335010％v/v乙二醇D70.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.525％PEG335010％v/v异丙醇D80.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG33500.1M丙二酸钠D90.1M乙酸钠pH4.630％PEG33500.1M甘氨酸D100.1M柠檬酸钠PH5.630％PEG33500.1M酒石酸钾钠D110.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.530％PEG33500.01M乙二胺四乙酸D120.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.530％PEG335010％v/vTacsimatePH7.0E10.1M乙酸钠pH4.615％PEG4000.1M硫酸铵E20.1M柠檬酸钠PH5.615％PEG4000.1M甲酸钠E30.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.515％PEG4000.1M氯化镁E40.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG4000.1M丙二酸钠E50.1M乙酸钠pH4.620％PEG40010％v/v2-甲基-2，4戊二醇E60.1M柠檬酸钠PH5.620％PEG40010％v/v乙二醇E70.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.520％PEG40010％v/v异丙醇E80.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG4000.1M丙二酸钠E90.1M乙酸钠pH4.625％PEG4000.1M甘氨酸E100.1M柠檬酸钠PH5.625％PEG4000.1M酒石酸钾钠E110.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.525％PEG4000.01M乙二胺四乙酸E120.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG40010％v/vTacsimatePH7.0F10.1M乙酸钠pH4.615％PEG10000.1M硫酸铵F20.1M柠檬酸钠PH5.615％PEG10000.1M甲酸钠F30.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.515％PEG10000.1M氯化镁F40.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG10000.1M丙二酸钠F50.1M乙酸钠pH4.620％PEG100010％v/v2-甲基-2，4戊二醇F60.1M柠檬酸钠PH5.620％PEG100010％v/v乙二醇F70.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.520％PEG100010％v/v异丙醇F80.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG10000.1M丙二酸钠F90.1M乙酸钠pH4.625％PEG10000.1M甘氨酸F100.1M柠檬酸钠PH5.625％PEG10000.1M酒石酸钾钠F110.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.525％PEG10000.01M乙二胺四乙酸F120.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG100010％v/vTacsimatePH7.0G10.1M乙酸钠pH4.610％PEG20000.1M硫酸铵G20.1M柠檬酸钠PH5.610％PEG20000.1M甲酸钠G30.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.510％PEG20000.1M氯化镁G40.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.510％PEG200010％v/vTacsimatePH7.0G50.1M乙酸钠pH4.615％PEG200010％v/v2-甲基-2，4戊二醇G60.1M柠檬酸钠PH5.615％PEG200010％v/v乙二醇G70.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.515％PEG200010％v/v异丙醇G80.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG200010％v/vTacsimatePH7.0G90.1M乙酸钠pH4.620％PEG20000.1M甘氨酸G100.1M柠檬酸钠PH5.620％PEG20000.1M酒石酸钾钠G110.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.520％PEG20000.01M乙二胺四乙酸G120.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG200010％v/vTacsimatePH7.0H10.1M乙酸钠pH4.615％PEG15000.1M硫酸铵H20.1M柠檬酸钠PH5.615％PEG15000.1M甲酸钠H30.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.515％PEG15000.1M氯化镁H40.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG150010％v/vTacsimatePH7.0H50.1M乙酸钠pH4.620％PEG150010％v/v2-甲基-2，4戊二醇H60.1M柠檬酸钠PH5.620％PEG150010％v/v乙二醇H70.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.520％PEG150010％v/v异丙醇H80.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG150010％v/vTacsimatePH7.0H90.1M乙酸钠pH4.625％PEG15000.1M甘氨酸H100.1M柠檬酸钠PH5.625％PEG15000.1M酒石酸钾钠H110.1M2，2-双二羟甲基苯胺PH6.525％PEG15000.01M乙二胺四乙酸H120.1MN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG150010％v/vTacsimatePH7.02.根据权利要求1所述的以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特征在于所述沉淀剂是PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG3350、PEG400、PEG1000、PEG2000或PEG1500任一种。3.根据权利要求1或2所述的以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特征在于所述沉淀剂浓度是10%30%v/v。4.根据权利要求1所述的以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特征在于所述添加剂是硫酸铵、甲酸钠、氯化镁、丙二酸钠、2-甲基-2，4戊二醇、乙二醇、异丙醇、TacsimatePH7.0、甘氨酸、酒石酸钾钠或乙二胺四乙酸任一种。5.根据权利要求1或4所述的以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特征在于所述添加剂浓度是0.1M。6.根据权利要求1所述的以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特征在于所述缓冲液是乙酸钠、柠檬酸钠、2，2-双二羟甲基苯胺或N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸。7.根据权利要求1或6所述的以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特征在于所述缓冲液浓度是0.1M。8.根据权利要求1、6或7所述的以聚乙二醇为基础的96条件生物大分子结晶筛选试剂盒，其特征在于所述缓冲液PH值是48。全文摘要本发明公开了一种以聚乙二醇作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选96条件试剂盒，其目的是解决现有的96条件筛选试剂盒在蛋白质结晶条件筛选中成功率低的技术问题。技术方案是采用的PEG是BMCD数据库中统计出的使用频率最高的前8种，不是随机选取，显著地提高了生物大分子结晶的成功率。如刀豆球蛋白的成功率由
背景技术：
的4.2％提高到81.2％，溶菌酶的成功率由
背景技术：
的29.2％提高到46.9％，蛋白酶K的成功率由
背景技术：
的58.3％提高到66.7％，过氧化氢酶的成功率由
背景技术：
的15.6％提高到30.2％。另外由于本试剂盒是以PEG为沉淀剂的，所用试剂种类较少，相对
背景技术：
试剂盒成本较低。文档编号C07K1/30GK101817869SQ20101014713公开日2010年9月1日申请日期2010年4月15日优先权日2010年4月15日发明者刘君,尹大川,张仙芳,郭云珠,鹿芹芹申请人:西北工业大学