专利名称：高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法，具 体地说，是以微生物酶法合成的低聚半乳糖粗品为原料，采用国产廉价易得的树脂为分离 介质，通过柱层析技术得到高纯度的低聚半乳糖产品；以聚丙烯酰胺凝胶为分离介质，制备 得到高纯度的低聚半乳糖单一组分产品。
背景技术：
低聚半乳糖(GOS)在体内不能被胃酸和胃酶降解，故不能被消化吸收，而是直接 进入小肠内被有益菌尤其是双歧杆菌利用，因此能有效促进体内双歧杆菌的生长繁殖，改 善脂质代谢，促进钙的吸收和维生素的合成，并具有分解致癌物质、提高人体免疫力等功 能。在自然界，动物的乳汁中含有微量的低聚半乳糖，母乳中含量较多，这正是母乳喂养的 婴幼儿具有较强的免疫力和防病能力的原因。低聚半乳糖作为功能性低聚糖大量地应用于 婴幼儿食品、低热量、低龋齿食品、糖尿病患者专用食品等，另外还应用于化妆品、医药、饲 料和口腔清洁等非食品行业。生产制备低聚半乳糖主要有3种方法从天然原料中提取，化 学合成法和微生物酶法合成。自然界中低聚半乳糖含量少，且无色、不带电荷，很难分离提 取。化学合成法需要使用大量的化学试剂，因此毒性大，易残留，在实际生产中不可行。而 微生物酶法合成低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶来源于安全无毒的霉菌和酵母，与其它方法 相比，该法原料充足、方便、易得，生产成本低，是制备低聚半乳糖的最佳方法。微生物酶法 合成低聚半乳糖是以高浓度乳糖做底物，在半乳糖苷酶的作用下，将乳糖水解的半乳 糖转移到乳糖基上，制得的低聚半乳糖是在乳糖的半乳糖基一侧结合1 4分子的半乳糖 的结合糖，属于葡萄糖和半乳糖组成的杂低聚糖。国内外对低聚半乳糖的制备技术研究得 较多，日本、欧洲一些国家已实现大规模工业化生产，国内也有少数几个厂家在研制生产， 但产量都不大。目前工业上低聚半乳糖都采用微生物酶法合成，由于酶源和反应条件的不 同，最终产品的纯度也不同，约为24 57%，溶液中还存在大量未反应的乳糖、少量产物葡 萄糖和极少量的半乳糖。如果产品不进行分离，一方面，未反应的乳糖得不到回收再利用； 另一方面，产品中大量存在的乳糖不但会引起乳糖不耐症，在特殊人群中的食用受到一定 的限制，而且很大程度上削弱了低聚半乳糖的生理功能及保健作用。虽然目前低聚半乳糖 的制备技术研究得较多，但产品的下游分离纯化技术却很少有人研究，目前还没有既经济 又有效的低聚半乳糖的分离纯化方法。目前低聚糖分离纯化的方法主要有酶法、微生物发酵法、纳滤膜分离法和柱层析技术。酶法是利用酶制剂将混合物中的某些组分专一性地除去，例如混合物中的葡萄糖 可以采用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶除去，乳糖可以采用纤维二糖脱氢酶氧化为乳糖酸除 去，但葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和纤维二糖脱氢酶的价格很高，使得分离纯化操作变得不 经济。微生物发酵法是利用了大多数功能性低聚糖的难发酵性，选择适当的微生物将非功 能性糖组分发酵除去，低聚糖混合物中的葡萄糖可以采用酿酒酵母选择性地发酵为酒精除 去，但乳糖很难发酵。纳滤技术是通过在膜两侧施加某种推动力(如压力差、浓度差等)，使得原料侧组分有选择性地透过膜，从而达到分离和提纯的目的，该技术可以除去大部分葡 萄糖，但乳糖的除去率较低，因而只能粗步分离低聚半乳糖混合物，分离后的产品仍然达不 到高纯度低聚糖(85%以上)的要求。另外，国内外市场对低聚糖单一组分的需求量也较 大，而目前还没有适宜的的低聚半乳糖单一组分的制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高纯度低聚半乳糖及其单一组 分的制备方法。解决目前低聚半乳糖混合物中乳糖含量较高，容易引起乳糖不耐症，从而影 响产品大规模应用的问题，该方法拟采用国产廉价易得的阳离子交换树脂分离低纯度的低 聚半乳糖原料，得到高纯度的低聚半乳糖产品，并采用凝胶层析技术得到高纯度的低聚半 乳糖单一组分。本发明的技术方案为高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法，包括以下步 骤(1)将005X7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂经酸洗、碱洗后，转为钙型，脱气 后装柱，为树脂柱，聚丙烯酰胺凝胶经溶胀，倾出其中的细小颗粒，脱气后装柱，为凝胶柱；(2)低聚半乳糖粗品经树脂柱分离，以蒸馏水为洗脱剂进行洗脱，得到纯度85% 以上的低聚半乳糖产品；(3)将步骤(2)所得低聚半乳糖产品浓缩后，采用凝胶柱一次分离，蒸馏水为洗脱 齐U，得到纯度85%以上的三糖、四糖和五糖单一组分。前述的制备方法，优选的技术方案是，还包括步骤(4)将步骤(3)所得单一组分 分别浓缩后经凝胶柱二次分离，蒸馏水为洗脱剂，得到纯度98%以上的三糖、四糖和五糖单
一组分。前述的制备方法，优选的技术方案是，所述步骤(2)树脂柱长度80-100cm，直径 Icm,进料量l-2mL，洗脱温度50_80°C，洗脱流速15_25mL/h。更优选的技术方案是，所述步 骤(2)树脂柱长度90cm，进料量lmL，洗脱温度70°C，洗脱流速20mL/h。前述的制备方法，优选的技术方案是，所述步骤(3)凝胶柱长度100-140cm，直径 1. 6cm,进料量2-4mL，洗脱温度40_70°C，洗脱流速15_25mL/h。更优选的技术方案是，所述 步骤(3)凝胶柱长度120cm，进料量3mL，洗脱温度50°C，洗脱流速20mL/h。前述的制备方法，优选的技术方案是，步骤(2)中所述低聚半乳糖粗品为微生物 酶法合成的低聚糖混合物，其中低聚半乳糖的纯度为24-57%。前述的制备方法，优选的技术方案是，树脂柱和凝胶柱的上柱样品中总糖质量浓 度为 200-700g/L。前述的制备方法，优选的技术方案是，所用005X7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换 树脂的粒度为150-180 μ m。前述的制备方法，优选的技术方案是，所用聚丙烯酰胺凝胶的粒度为45-90 μ m。本发明的优点主要体现在于(1)采用005X7树脂分离低聚半乳糖混合物，可以有效地除去葡萄糖，得到纯度85%以上的含少量乳糖的低聚半乳糖产品。(2)005X7树脂廉价易得，柱层析过程操作简单，成本低，耗时少(整个实验室操作只需要2. 4h)，产品收率高，树脂硬度大、耐压、颗粒之间空隙大，有利于工业上放大生产。(3)聚丙烯酰胺凝胶分离低聚半乳糖混合物，一次柱层析可以得到纯度85%以上的低聚半乳糖单一组分产品，二次柱层析可以得到纯度98%以上的低聚半乳糖单一组分， 达到了标准品的要求。
图1 :005X7树脂柱对低聚糖半乳糖粗品的分离效果。图2 =Bio-Gel P_2凝胶柱对85%低聚糖半乳糖的分离效果。
具体实施例方式下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不限于此。实施 例中所用原料皆可从市场购买。所用的强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂，购自南开大 学化工厂，型号为005X7。所用的聚丙烯酰胺凝胶，为美国Bio-Rad公司的产品，型号为 Bio-GelP-2。实施例1高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法，包括以下步骤(1)将005X7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂经酸洗、碱洗后，转为钙型，脱气 后装柱，为树脂柱，聚丙烯酰胺凝胶经溶胀，倾出其中的细小颗粒，脱气后装柱，为凝胶柱。 所用005X7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂的粒度为150-180μπι。所用聚丙烯酰胺凝 胶的粒度为45-90 μ m。(2)低聚半乳糖粗品经树脂柱分离，以蒸馏水为洗脱剂进行洗脱，得到纯度85% 以上的低聚半乳糖产品(树脂柱长度80cm，直径1cm，进料量lmL，洗脱温度80°C，洗脱流速 25mL/h)；(3)将步骤(2)所得低聚半乳糖产品浓缩后，采用凝胶柱一次分离，蒸馏水为洗脱 齐U，得到纯度85%以上的三糖、四糖和五糖单一组分(凝胶柱长度100cm，直径1.6cm，进料 量2mL，洗脱温度40°C，洗脱流速25mL/h)。实施例2高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法，与实施例1所不同的是，还包括 步骤(4)将步骤(3)所得单一组分分别浓缩后经凝胶柱二次分离，蒸馏水为洗脱剂，得到 纯度98%以上的三糖、四糖或五糖单一组分。实施例3高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法，与实施例1所不同的是，步 骤(2)中树脂柱长度100cm，进料量1. 5mL，洗脱温度50°C，洗脱流速15mL/h。步骤(3)中 凝胶柱长度140cm，进料量4mL，洗脱温度60°C，洗脱流速15mL/h。实施例4高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法，包括以下步骤(1)005X7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂经酸洗、碱洗后，转为钙型，脱气后 装柱。凝胶经溶胀、倾出其中的细小颗粒，脱气后装柱。所用005X7强酸性聚苯乙烯系阳 离子交换树脂的粒度为150-180 μ m。所用聚丙烯酰胺凝胶的粒度为45-90 μ m。 (2)低聚半乳糖粗品的组成为葡萄糖7.1%，乳糖40. 4%，低聚糖(包括三糖、四糖 和五糖)52. 5 %，配置溶液质量浓度为340g/L，采用005 X 7树脂柱对该混合物进行分离，蒸 馏水为洗脱剂，树脂柱长度90cm，进料量lmL，洗脱温度70°C，洗脱流速20mL/h，每2mL收集 一管，分离效果见附图1，由附图1可以看出，005X7树脂虽然对三糖、四糖和五糖之间的分离效果不明显，但对它们(低聚糖)与乳糖和葡萄糖之间的分离效果较好，收集16-19管的 组分得到高纯度的低聚糖产品，其纯度为88. 2%，收率为86. 7%。(3)将步骤(2)的产品浓缩至浓度340g/L，采用Bio-Gel P_2凝胶柱进行分离，蒸馏水为洗脱剂，凝胶柱长度120cm，进料量3mL，洗脱温度50°C，洗脱流速20mL/h，每3mL 收集一管，分离效果见附图2，由附图2可以看出，Bio-Gel P_2不但对乳糖和三糖的分离 效果较好，对三糖和四糖、四糖和五糖的分离效果也很好，分段分别收集各种组分，得到低 聚三糖、四糖和五糖的纯度分别为88. 7%、85. 和86. 3%，收率分别为86. 9%、79. 5%和 81. 3%。(4)将步骤(3)中的各种产品分别浓缩至质量浓度300g/L，采用Bio-Gel P_2凝胶柱进行分离，分离条件同步骤(3)，得到纯度98%以上的低聚三糖、四糖和五糖，收率分 别为95. 5%,74. 4%和96. 7%，达到了分析用标准品的纯度要求。
权利要求
高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法，其特征是，包括以下步骤(1)将005×7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂经酸洗、碱洗后，转为钙型，脱气后装柱，为树脂柱，聚丙烯酰胺凝胶经溶胀，倾出其中的细小颗粒，脱气后装柱，为凝胶柱；(2)低聚半乳糖粗品经树脂柱分离，以蒸馏水为洗脱剂进行洗脱，得到纯度85％以上的低聚半乳糖产品；(3)将步骤(2)所得低聚半乳糖产品浓缩后，采用凝胶柱一次分离，蒸馏水为洗脱剂，得到纯度85％以上的三糖、四糖和五糖单一组分。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征是，还包括步骤(4)将步骤(3)所得单一组分 分别浓缩后经凝胶柱二次分离，蒸馏水为洗脱剂，得到纯度98%以上的三糖、四糖和五糖单一组分。
3.权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，所述步骤(2)树脂柱长度80-100cm，直 径1cm，进料量l_2mL，洗脱温度50_80°C，洗脱流速15_25mL/h。
4.权利要求3所述的制备方法，其特征是，树脂柱长度90cm，进料量lmL，洗脱温度 70°C，洗脱流速20mL/h。
5.权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，所述步骤(3)凝胶柱长度100-140cm， 直径1. 6cm，进料量2-4mL，洗脱温度40_70°C，洗脱流速15_25mL/h。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征是，凝胶柱长度120cm，进料量3mL，洗脱温度 50°C，洗脱流速20mL/h。
7.权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述低聚半乳糖粗品为微 生物酶法合成的低聚糖混合物，其中低聚半乳糖的纯度为24-57%。
8.权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，树脂柱和凝胶柱的上柱样品中总糖质 量浓度为200-700g/L。
9.权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所用005X7强酸性聚苯乙烯系阳离 子交换树脂的粒度为150-180 μ m。
10.权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所用聚丙烯酰胺凝胶的粒度为 45-90 μ m0
全文摘要
本发明涉及一种高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法，采用005×7阳离子交换树脂分离低聚半乳糖粗品，可以有效地除去葡萄糖，得到纯度85％以上的含少量乳糖的低聚半乳糖产品。以此为原料，经过聚丙烯酰胺凝胶柱一次分离，可以得到纯度85％以上的低聚半乳糖单一组分，这些单一组分经过聚丙烯酰胺凝胶柱二次分离，可以得到纯度98％以上的低聚半乳糖单一组分标准品。
文档编号C07H3/06GK101817850SQ20101014963
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月19日 优先权日2010年4月19日
发明者冯咏梅, 常秀莲, 张瑞伦, 王文华 申请人:烟台大学