专利名称：一种抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术及细胞工程领域，涉及分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系及其分泌的单克隆抗体，以及所述单克隆抗体的纯化、标记及应用，特别是检测猪血清中非洲猪瘟病毒的应用。
背景技术：
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血。(William，Hess Adv.African swine fevera reassessment[J].Vet Sci Comp Med，1981，2539～69)世界动物组织(OIE)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999，21(2)117～119)。
本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。
非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病毒分类委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知的代表种。
非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒。其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为170kb～190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(Rafacl，Yancz，Javier M，et al.Analysis of the completeNucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus[J].Virology，1995，208249～279)。ASF病毒基因组有5个编码基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组含有151个ORF，可以编码150～200种蛋白质，已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多肽(曲连东，于康震，非洲猪瘟研究进展，中国兽医科技，1998，28(11)42～43)。
非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性，其中P54蛋白为具有较好抗原性的蛋白之一。
ASFV P54蛋白是由E183L基因编码的，约25kD的多肽，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网膜处。P54蛋白可以在体外培养，并能感染细胞。而且在感染细胞后在内质网膜处短暂表达。P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前体时起着十分重要的作用(RodriguezJM，Garcia Escudero African Swine Fever Virus Structural Protein p54 IsEssential for the Recruitment of Envelope Precursors to Assembly Sites.Journalof Virology，2004，78(8)4299～4313)。另外ASFV P54蛋白与8kD的轻链细胞质动力蛋白DLC8存在特殊的交叉反应，并在细胞内摄作用及病毒加工过程中起重要作用。感染病毒后复制早期，病毒可激活细胞凋亡蛋白酶而诱发细胞脱噬作用(Alonso C，J Miskin African Swine Fever Virus Protein p54Interacts with the Microtubular Motor Complex through Direct Binding toLight-Chain Dynein.Journal of Virology 2001，759819～9827)。为了分析结构蛋白P54在细胞脱噬中所起的作用，2004年Hernaez B和Diaz-Gil G将其在非洲绿猴肾细胞内短暂表达，实验表明可激活细胞凋亡蛋白酶，诱发细胞脱噬作用(Hernaez B，Diaz Gil G.The African swine fever virusdynein-binding protein p54 induces infected cell apoptosis.FEBS Letters2004，569(123)224～228)。
发明内容
本发明的目的是提供一种分泌特异性识别非洲猪瘟病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明的另一目的是提供上述细胞系分泌的抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体，所述单抗对非洲猪瘟结构蛋白P54抗原有较好的特异性。本发明的另一目的是提供上述抗体的纯化及辣根过氧化酶的酶标记物。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述细胞系的保藏号为CGMCCNO.3750。
所述的杂交瘤细胞系是通过杂交瘤技术以原核表达的重组可溶性蛋白P54作为免疫原建立的。
所述杂交瘤细胞系分泌的抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体。
所述的单克隆抗体纯化后经过碘酸钠法制备辣根过氧化物的酶标记物。
本发明的有益效果该发明所制备的杂交瘤细胞株ASFVP54Mab及其分泌的单克隆抗体能够识别ASFV天然抗原，所获得的单克隆抗体不仅在ASFV基础研究，而且在ASFV抗原抗体免疫反应的检测试剂中均具有很高的应用价值。
图1为重组P54蛋白纯化后SDS-PAGE图。
图2为重组P54蛋白纯化后western blotting图。
图3为采用本发明的ELISA试剂盒检测样本非洲猪瘟抗体实验图。
具体实施例方式 抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO.3750，保藏日2010-04-22，分类命名杂交瘤细胞株。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明 本发明的技术方案如下 一、建立细胞系 1.抗原制备 a)非洲猪瘟P54蛋白的表达 根据GenBank中非洲猪瘟(ASFV)P54基因序列，设计合成了1对引物，采用PCR方法从ASFV DNA中扩增出P54基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-P54，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。
设计的引物为 P54-1-5’-GCGGATCCCATTATTATCATCGTT-3’ P54-2-5’-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3’ 下划线部分为引入的酶切位点，P54-1为ASFV P54基因上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHI；P54-2为ASFV P54基因下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI。
b)非洲猪瘟P54蛋白的纯化。
诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声1s，间隔1s，共10min)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性(见附图1，2)。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，标准品浓度及其对应的OD值见表1。纯化后P54蛋白的OD值为1.583，与标准品比较后，其浓度为900μg/ml。
表1BCA法测定标准品蛋白含量 2.抗原免疫 以纯化的非洲猪瘟病毒P54蛋白为抗原，常规方法免疫6周龄BALB/c小鼠，首次基础免疫皮下注射抗原200μg，使用完全弗氏佐剂；每隔3周进行一次免疫，共三次，50μg/只/次，最后一次基础免疫后3周后脾内注射加强免疫，25μg/只，免疫完成。
3.杂交瘤细胞的制备 a)饲养细胞的制备 以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。融合前1天，将小鼠拉颈处死，体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml RPMI 1640培养液至腹腔，反复冲洗，回收冲洗液，1000r/min离心10分钟，弃上清。用含20％胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬沉淀，调整细胞浓度为2×105/ml。将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml，置37℃，6％CO2的培养箱中培养过夜。
b)免疫脾细胞的制备 取免疫完成后的BALB/c小鼠，通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，无菌条件下取出脾脏，至于平皿中，RPMI 1640培养液清洗1次。将脾脏移入另一盛有10ml RPMI 1640培养液的平皿中，使脾细胞进入培养液。用吸管吹打数次。过滤，收获脾细胞悬液，1000r/min离心10分钟，用RPMI 1640培养液离心洗涤2次，然后将细胞重悬，计数，用于细胞融合。
c)骨髓瘤细胞 于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养，融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管。1000r/min离心10分钟，弃去上清。加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。取骨髓瘤细胞悬液，计数，用于细胞融合。
d)细胞融合及HAT选择杂交瘤 将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶10比例混合，在50ml离心管内用RPMI1640培养液洗1次，1200r/min，离心10min，弃上清，用滴管小心吸出残留液体。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热。在45秒时加入预热至40℃的50％PEG(PH 8.0)1ml，作用90秒。加入20ml预热至37℃的RPMI 1640培养液，室温静置10分钟。1000r/min，离心5min，弃去上清。加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含饲养细胞的HAT培养基至80ml。分装96孔细胞培养板，每孔0.1ml，然后将培养板置37℃，6％CO2培养箱内培养。
24小时后用HAT培养基换出1/2培养基，48小时后完全换液。两周后用HT培养基换出HAT培养基，再维持两周后，改用RPMI 1640培养液。
4.杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞融合两周后，按照常规免疫酶技术进行杂交瘤细胞的筛选。筛选出能分泌抗非洲猪瘟病毒抗体的杂交瘤孔。
5.杂交瘤的克隆化和冻存 a)杂交瘤细胞的克隆 克隆化方案为有限稀释法，按照常规杂交瘤细胞克隆方法进行，同法克隆进行三次。
b)杂交瘤细胞的冻存 细胞冻存液50％小牛血清+40％RPMI 1640培养液+10％二甲基亚砜 将杂交瘤细胞离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107/ml，转移至冻存管中，每瓶1ml。置于-70℃冰箱中，次日转入液氮中。
将制备抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO.3750，保藏日2010-04-22，分类命名杂交瘤细胞株。
二、单克隆抗体制备 本发明中，大量生产单克隆抗体的方案为小鼠腹水法，步骤如下 本方案将上述获得的杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，得到大量的腹水单抗。
具体方法为BALB/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5ml。两周后，腹腔接种用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.2ml。间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡时，处死小鼠，无菌条件下将腹水吸出。室温静止30min，1000r/min，离心10min，收集上清，分装，-70℃冻存备用。
三、单克隆抗体纯化及辣根过氧化酶标记 1.单克隆抗体的纯化 上述获得的腹水单抗的纯化方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。
取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，用1mol/LHCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出12000r/min离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
2.单克隆抗体的辣根过氧化酶标记 纯化后的单克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下 称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；向其中再加入20μl 0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.01M碳酸盐缓冲液的单克隆抗体纯品5mg(10mg/ml)，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4，混匀，4℃放置2小时；所得产物对0.15M pH7.4PBS中4℃透析过夜。
透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。3000r/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH 7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH7.4的PBS缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。
四、标准ASFV阳性血清及标准ASFV阴性血清的制备 在ELISA检测过程中，不同的操作人员和不同的检测批次间会存在一定的误差，操作误差会导致检测样品OD值的误差。本发明研制了标准ASFV抗体阳性对照血清和标准ASFV抗体阴性对照血清，用于检测条件的优化和检测结果的判定。
a)标准阳性血清的制备 取健康成年家兔，体重2-3kg，剪去两后脚掌的部分兔毛，用碘酒消毒皮肤。第一次免疫，用注射器吸取弗式完全佐剂(FCA)乳化的抗原(纯化后重组P54)(以下称FCA-P54)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。间隔10-14天后，进行第二次免疫，与两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入弗式不完全佐剂(FIA-P54)，每个淋巴结0.1ml，其余注入淋巴结附近的皮下共1ml。间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5-1.0ml，分离血清，采用ELISA方法检测血清效价，抗体效价可达到1∶100以上。
采用心脏采血法采血，将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中。将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱3小时。待血液凝固血块收缩后，用滴管吸取血清，3000r/min离心15min，取上清，加入终浓度为0.01％的硫柳汞防腐，分装后，-20℃保存。
b)标准阴性血清的制备 取经检验合格的SPF兔，心脏采血，分离血清，加入万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml分装于无菌管中，-20℃保存。
五、试剂盒的建立 a)本发明试剂盒的检测原理 采用竞争法，将重组的非洲猪瘟病毒结构蛋白P54包被于微孔板中，然后用1％BSA将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的非洲猪瘟病毒抗体能与酶标板中包被的P54抗原反应，加入针对P54的酶标单克隆抗体后参与结合表位的竞争。随后，加入辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，OD值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的含量成反比。
b)本发明试剂盒的组成 a)酶标板的最佳制备方法 用pH9.60.05M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组P54蛋白稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的P54含量为0.2ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
b)工作试剂的配置 洗涤液(pH 7.4，0.15M PBS)KH2PO4 0.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。
血清稀释液牛血清白蛋白0.1g，加洗涤缓冲液至100ml 底物缓冲液(pH 5.0磷酸柠檬酸)0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml TMB(四甲基联苯胺)使用液TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％H2O2 32ul 终止液(2M H2SO4)蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml c)检测非洲猪瘟的竞争ELISA试剂盒的组建 组建检测非洲猪瘟的酶联免疫试剂盒，包含以下组分 96孔酶标板 辣根过氧化物酶标记的单抗 标准阳性对照 标准阴性对照 浓缩洗涤液 血清稀释液 TMB底物 终止液 产品说明书 六、样品中非洲猪瘟病毒抗体的检测 a)用上述制备的试剂盒进行检测 1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。
2)每孔加入稀释后酶标单克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
3)每孔加入TMB底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。
4)每孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。(实验图见附图3) b)检测结果分析 i.测中阴性对照血清(NC)的OD值至少是阳性对照血清(PC)的4倍时，检测被认为有效。(实验数据见表2) 表2采用本发明的ELISA试剂盒检测样本非洲猪瘟抗体数据 NC/PC≥4 阳性Cut Off＝NC-[(NC-PC)×0.5] 阴性Cut Off＝NC-[(NC-PC)×0.4] 其中NC＝阴性对照血清OD值 PC＝阳性对照血清OD值 对表2中数据计算，得出阳性Cut Off为0.800，阴性Cut Off为0.930。
ii.检测时使用复孔，最终使用OD值为两个的平均值。
当血清样本的OD值低于阳性Cut Off值时，该样本为ASFV抗体阳性。
当血清样本的OD值高于阴性Cut Off值是，该样本为ASFV抗体阴性。
当血清样本的OD值在两个Cut Off值之间时，被认为可疑，对于该样本应重新测试，或者采用其他检测方法确认。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述细胞系的保藏号为CGMCC NO.3750。
2.根据权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述的杂交瘤细胞系是通过杂交瘤技术以原核表达的重组可溶性蛋白P54作为免疫原建立的。
3.权利要求1所述杂交瘤细胞系分泌的抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体。
4.权利要求3所述的单克隆抗体纯化后经过碘酸钠法制备辣根过氧化物的酶标记物。
全文摘要
本发明公开了一种抗非洲猪瘟病毒结构蛋白P54单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其单克隆抗体的建立方法和应用，其主要技术特征为以原核表达制备重组的P54可溶性抗原，免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术经融合、筛选、克隆，获得能稳定分泌抗非洲猪瘟病毒P54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明也公开了用该细胞系制备单克隆抗体、抗体提纯方法及该抗体的辣根过氧化酶标记法。该单克隆抗体可用于猪血清中非洲猪瘟病毒抗体的检测。
文档编号C07K16/08GK101818129SQ20101015406
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者董志珍, 肖妍, 赵祥平, 侯艳梅, 王涛, 张瑞, 张立怀 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心