合成编码文库的方法

专利名称：合成编码文库的方法
合成编码文库的方法本申请是申请日为2004年12月17日、申请号为200480037850. 3、发明名称为“合 成编码文库的方法”的发明专利申请的分案申请。相关申请本申请要求2003年12月17日提交的美国临时专利申请系列号60/530854、2004 年1月30日提交的美国临时专利申请系列号60/540681、2004年3月15日提交的美国 临时专利申请系列号60/553，715和2004年7月16日提交的美国临时专利申请系列号 60/588，672的优先权，这些专利的全部内容均在此弓|入作为参考。
背景技术：
探索鉴定具有有用生物活性的化合物的更有效方法，导致发展了筛选大量不同化 合物的方法，这些化合物存在于被称为组合文库的集合中。这样的文库可含有105种或更 多不同的化合物。有许多方法用于产生组合文库，并且已经报道了肽、拟肽和有机小分子的 组合合成。组合方法应用于药物发现的两个主要挑战是非常复杂的文库的合成和在所用筛 选中有活性的分子的鉴定。通常知道文库的复杂程度越高，即文库中存在的不同结构的数 量越多，该文库含有具有目标活性的分子的可能性就越大。因此，文库合成中使用的化学方 法必须能够在合理时间范围内生成大量化合物。但是对于给定的克式浓度和总浓度来说， 提高文库内不同成员的数目降低了任何特定文库成员的浓度。这使得从高复杂性文库中鉴 定活性分子变得复杂。克服这些障碍的一种方法是发展编码文库，特别是其中每个化合物均包含可扩增 标签的文库。这样的文库包括DNA-编码文库，其中用于识别文库成员的DNA标签能够用分 子生物学技术如聚合酶链反应扩增。但是，这些方法在产生很大文库中的应用尚未得到证 明，显然，为了实现该方法用于药物发现的可能性，需要改进产生这种文库的方法。发明概述本发明提供一种合成包含编码寡核苷酸标签的分子文库的方法。该方法使用“分 离-组合”策略，其中将含有起始物的溶液分成(“分离”)多个部分，该起始物包括连接有 一编码寡核苷酸的第一结构单元(buildingblock)。在每个部分中，起始物与独特的第二 结构单元和标识该第二结构单元的独特的第二寡核苷酸反应。这些反应可以同时或相继进 行，如果是相继进行，则任一反应都可以在另一反应之前。将每个部分中产生的二聚体分 子合并(“组合”)，然后再分为多个部分。这些部分中的每一个然后与独特(每部分特异 性)的第三结构单元和编码(标识)该结构单元的独特的第三寡核苷酸反应。产物文库中 存在的独特分子的数目是以下数值的函数(1)在合成的每一步使用的不同结构单元的数 目，和(2)组合和分离步骤的重复次数。在一个实施方案中，本发明提供一种合成分子的方法，该分子包含或由与编码寡 核苷酸可操作连接的功能部分组成。该方法包括下列步骤(1)提供由包含n个结构单元 的功能部分组成的起始化合物，其中n是1或大于1的整数，其中该功能部分含有至少一个 反应基团，并且其中该功能部分与起始寡核苷酸可操作连接；(2)将该起始化合物与包含至少一个互补反应基团的结构单元反应，其中该至少一个互补反应基团与步骤(1)的反应 基团互补，反应条件适合所述反应基团与互补反应基团反应形成共价键；(3)将起始寡核 苷酸与标识步骤(b)的结构单元的引入寡核苷酸反应，反应条件适合所述引入寡核苷酸与 起始寡核苷酸连接，并存在催化所述起始寡核苷酸与引入寡核苷酸连接的酶，从而产生包 含功能部分或由该功能部分组成的分子，该功能部分含有n+1个结构单元，并且与编码寡 核苷酸可操作连接。如果步骤(3)的功能部分包含反应基团，则步骤1-3可以重复一次或 多次，从而形成循环1至i，其中i是2或大于2的整数，循环s的步骤⑶的产物成为循环 s+1的起始化合物，其中s是i_l或更小的整数。在一个实施方案中，本发明提供一种合成化合物文库的方法，其中化合物包含功 能部分，该功能部分包含两个或更多的结构单元，并且与标识该功能部分结构的寡核苷酸 可操作连接。该方法包括下列步骤(1)提供包含m种起始化合物的溶液，其中m是1或大 于1的整数，其中起始化合物由包含n个结构单元的功能部分组成，其中n是1或大于1的 整数，该功能部分与识别该n个结构单元的起始寡核苷酸可操作连接；(2)将步骤(1)的溶 液分成r个部分，其中r是2或大于2的整数；(3)每个部分中的起始化合物与r个结构单 元之一反应，从而产生r个部分，包含由与起始寡核苷酸可操作连接的功能部分组成的化 合物，该功能部分包含n+1个结构单元；(4)每个部分中的起始寡核苷酸与一组r个不同引 入寡核苷酸之一反应，反应条件适合所述引入寡核苷酸与起始寡核苷酸进行酶连接，并存 在催化所述引入寡核苷酸与起始寡核苷酸连接的酶，从而产生r个等份，包含由与延长的 寡核苷酸可操作连接的功能部分组成的分子，该功能部分包含n+1个结构单元，该延长的 寡核苷酸编码(标识)该n+1个结构单元。任选地，该方法可进一步包括步骤(5)重新组 合步骤(4)产生的r个部分，从而产生包含由功能部分组成的化合物的溶液，该功能部分包 含n+1个结构单元并且与延长的寡核苷酸可操作连接。步骤(1)至(5)可以进行一次或多 次，产生循环1至i，其中i是2或大于2的整数。在循环s+1中，其中s是i_l或更小的整 数，步骤(1)的含有m种起始化合物的溶液是循环s的步骤(5)的溶液。同样，循环s+1的 步骤(1)的起始化合物是循环s的步骤(5)的化合物。在一个优选实施方案中，在每一步骤中用常规化学反应偶联结构单元。结构单元 可以偶联产生直链或分支聚合物或低聚物，如肽、拟肽和类肽，或非低聚物分子，如包含连 接有一个或多个其他化学部分的支架结构的分子。例如，如果结构单元是氨基酸残基，则该 结构单元可以用标准肽合成方法偶联，如本领域公知的应用适当保护/脱保护策略的溶液 相或固相合成。优选地，结构单元采用溶液相化学法偶联。编码寡核苷酸是单链或双链寡 核苷酸，优选双链寡核苷酸。编码寡核苷酸优选是每个结构单元有4-12个碱基或碱基对的 寡核苷酸；编码寡核苷酸可以利用标准溶液相或固相寡核苷酸合成法偶联，但是优选利用 溶液相酶法偶联。例如，如果编码寡核苷酸的序列包含用于用一种这样的酶进行连接的起 始序列的话，则该寡核苷酸可以利用拓扑异构酶、连接酶或DNA聚合酶偶联。编码寡核苷酸 的酶偶联具有以下优点⑴比标准合成(非酶)偶联更高的添加精确度；和⑵应用更简 单的保护/脱保护策略。另一方面，本发明提供式I的化合物 其中X是包含一个或多个结构单元的功能部分；Z是在其3’末端与B连接的寡 核苷酸；Y是在其5’末端与C连接的寡核苷酸；A是与X形成共价键的官能团；B是与Z的 3’ -末端形成键的官能团；C是与Y的5’ -末端形成键的官能团；D、F和E各自独立地是双 功能连接基团；且S是原子或分子支架。这样的化合物包括应用本发明的方法合成的那些 化合物。本发明进一步涉及一种化合物文库，其包含含有功能部分的化合物，该功能部分 包含两个或多个结构单元，并且与编码该功能部分结构的寡核苷酸可操作连接。这样的文 库可包含约102至约1012或更多种不同的成员，例如102、103、104、105、106、107、108、109、1010、 10"、1012或更多不同的成员，即不同的分子结构。在一个实施方案中，该化合物文库包含各自独立地为式I的化合物 其中X是包含一个或多个结构单元的功能部分；Z是在其3’末端与B连接的寡 核苷酸；Y是在其5’末端与C连接的寡核苷酸；A是与X形成共价键的官能团；B是与Z的 3’ -末端形成键的官能团；C是与Y的5’ -末端形成键的官能团；D、F和E各自独立地是双 功能连接基团；且S是原子或分子支架。这样的文库包括应用本发明的方法合成的那些文库。另一方面，本发明提供一种鉴定与生物靶标结合的化合物的方法，该方法包括以 下步骤(a)使该生物靶标接触本发明的化合物文库，其中该化合物文库包括含有功能部 分的化合物，该功能部分包含两个或多个结构单元，并且与编码该功能部分结构的寡核苷 酸可操作连接。该步骤在适合化合物文库的至少一个成员与该靶标结合的条件下进行；(2) 除去不与该靶标结合的文库成员；(3)扩增能与该靶标结合的化合物文库至少一个成员的 编码寡核苷酸；(4)对步骤(3)的编码寡核苷酸进行测序；和利用步骤(5)测定的序列确定 能与该生物靶标结合的化合物文库成员的功能部分的结构。本发明在鉴定具有所需性质的分子方面具有几个优点。例如，本发明的方法允许 在寡核苷酸标签的存在下使用许多化学反应来构建分子。本发明的方法也提供了向这样产生的化学结构中引入寡核苷酸标签的高保真度手段。另外，它们能够合成每个成员具有高 拷贝数的文库，从而允许对生物靶标进行多轮筛选，而在最后一轮后剩余足够数量的分子 用于寡核苷酸标签的扩增和测序。附图简述

图1是双链寡核苷酸的连接的示意图，其中起始寡核苷酸具有与引入寡核苷酸的 突出端互补的突出端。起始链显示为游离的、与氨基己基连接体偶联的或通过氨基己基连 接体与苯丙氨酸残基偶联的。图2是使用夹板(splint)链进行寡核苷酸连接的示意图。在该实施方案中，夹板 是12-mer的寡核苷酸，其序列与单链起始寡核苷酸和单链引入寡核苷酸互补。图3是当起始寡核苷酸是具有共价连接链的双链，并且引入寡核苷酸是双链时， 起始寡核苷酸与引入寡核苷酸连接的示意图。图4是使用聚合酶延长寡核苷酸的示意图。起始链表示为游离的、与氨基己基连 接体偶联的或通过氨基己基连接体与苯丙氨酸残基偶联的。图5是本发明的一个实施方案的合成循环的示意图。图6是应用本发明的文库进行多轮筛选过程的示意图。图7是实施例1所述循环1至5中每一个的产物以及在封闭引物连接后的产物的 电泳凝胶。分子量标准显示于泳道1，用于DNA定量的hyperladder的指定量显示于泳道9 至12中。图8是利用叠氮化物_炔环加成作用偶联结构单元的示意图。图9和10说明通过氯代三嗪上的亲核芳族取代偶联结构单元。图11显示适合在功能部分合成中使用的代表性氯代杂芳环结构。图12说明应用叠氮化物/炔环加成反应环化直链肽。图13A是如实施例2所述在循环4之后产生的文库的层析图。图13B是如实施例2所述在循环4之后产生的文库的质谱图。发明详述本发明涉及制备化合物和组合化合物文库的方法，通过本发明的方法制备的化合 物和文库，和利用该文库鉴定具有所需性质如所需生物活性的化合物的方法。本发明进一 步涉及应用这些方法鉴定的化合物。已经应用了多种方法来产生和筛查组合化学文库。例子包括将文库的各成员彼此 物理分离的方法，例如当在多个反应容器的每一个中合成单一化合物时。但是，这些文库一 般一次筛选一种化合物，或者最多一次筛选几种化合物，因此不能获得最有效的筛选过程。 在另外一些方法中，在固体支持体上合成化合物。这样的固体支持体包括芯片，其中特定化 合物占据芯片或膜上的特定区域(“可定位的”)。在另外一些方法中，在珠上合成化合物， 每个珠含有不同的化学结构。在筛查大文库时遇到的两个困难是⑴可以筛选的不同化合物的数量；和⑵在 筛选中有活性的化合物的鉴定。在一种方法中，在筛选中有活性的化合物如下鉴定将原始 文库缩小为更小的部分或亚部，在每种情况下都选择含有活性化合物的部分或亚部，并且 进一步再分，直到获得含有一组化合物的足够小的活性亚部，以致该亚部的所有成员能够 单独合成，并且评价所需的活性。这是一项单调的、费时的工作。
解析组合文库筛查结果的另外一种方法是利用这样的文库，其中该文库的成员用 识别标签进行标记，即，该文库中存在的每个标签都与该文库中存在的不同化合物结构相 关，因此该标签的识别指出了标记分子的结构。一种标记文库方法使用寡核苷酸标签，如 美国专利号 5，573，905 ；5，708，153 ；5，723，598，6，060，596，公开的 PCT 申请 TO 93/06121 ； W093/20242 ；W0 94/13623 ；W0 00/23458 ；W0 02/074929 和 W002/103008, Brenner 和 Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5381-5383(1992) ；Nielsen 禾口 Janda(Methods :A Companion to Methods inEnzymology 6,361-371 (1994) ；Nielsen，Brenner 禾口 Janda(J. Am. Chem. Soc. 115,9812-9813 (1993))所述，这些文献均在此全文引用作为参考。这样的标 签可以利用如聚合酶链反应扩增，产生多个标签拷贝，并且通过测序鉴定该标签。标签的序 列确定了结合分子的结构，这些分子可以以纯的形式合成并且检测。迄今为止，还没有报道 使用Lerner等人公开的方法制备大文库。本发明提供了产生DNA-编码文库的方法的改 进，以及利用溶液相合成法合成功能部分的DNA编码分子大(105个成员或更多)文库的首 批实例。本发明提供了一种方法，该方法允许容易地合成寡核苷酸编码的组合文库，并且 提供向大分子集合的每个成员上添加这种寡核苷酸标签的有效、高保真的手段。本发明的方法包括合成双功能分子的方法，该双功能分子包含由结构单元组成的 第一部分(“功能部分”)，和与第一部分可操作连接的第二部分，第二部分包含标识第一 部分的结构的寡核苷酸标签，即该寡核苷酸标签指示在第一部分构建中使用了哪些结构单 元，以及结构单元连接的顺序。通常，寡核苷酸标签提供的信息足以确定用来构建活性部分 的结构单元。在某些实施方案中，寡核苷酸标签的序列足以确定功能部分中结构单元的排 列，例如，对于拟肽，为氨基酸序列。如此处所用的术语“功能部分”是指包含一个或多个结构单元的化学部分。优选 地，功能部分中的结构单元不是核酸。功能部分可以是直链或支链或环形的聚合物或寡聚 物或有机小分子。如此处所用的术语“结构单元”是与其他化学结构单位连接的，或者能够与其他这 样的单位连接的化学结构单位。当功能部分是多聚的或寡聚的时，结构单元是聚合物或寡 聚物的单体单元。结构单元也可以包括支架结构(“支架结构单元”)，支架结构上连接有 或者可以连接一个或多个其他的结构(“周围结构单元”)。应当理解，此处使用的术语“结构单元”是指存在于功能部分中的，也指以反应性 形式用于合成功能部分的化学结构单位。在功能部分内，结构单元不含由于将该结构单元 掺入功能部分中而丢失的结构单元的任何部分。例如，在键形成反应释放小分子的情况中 (见下文)，存在于功能部分中的结构单元是“结构单元残基”，即，在贡献释放分子的原子 丢失后在合成中使用的结构单元的剩余部分。结构单元可以是互补的任何化学化合物，即结构单元必须能够一起反应，形成含 有两个或多个结构单元的结构。一般地说，使用的所有结构单元都具有至少两个反应基团， 尽管也可能有一些使用的结构单元(例如在寡聚功能部分中的最后一个结构单元)各自只 含有一个反应基团。两个不同结构单元上的反应基团应当互补，即，能够一起反应形成共价 键，任选地伴随小分子如水、HC1、HF等的丢失。为了本目的，如果两个反应基团能够一起反应形成共价键，则它们互补。在一个优
15选实施方案中，键形成反应在环境条件下快速发生，基本不形成副产物。优选地，特定反应 基团将与特定互补反应基团反应正好一次。在一个实施方案中，两个结构单元的互补反应 基团例如通过亲核取代反应，形成共价键。在一个实施方案中，一对互补反应基团的一个成 员是亲电子基团，而另一个成员是亲核基团。互补亲电子和亲核基团包括在适当条件下通过亲核取代反应形成共价键的任 何两个基团。许多合适的键形成反应在本领域中公知。参见，例如，March，Advanced Organic Chemistry,第四版，New York :JohnWiley and Sons (1992),第 10-16 章；Carey 禾口 Sundberg, Advanced OrganicChemistry, Part B, Plenum(1990),第 1—11 章；禾口 Collman 等，Principles andApplications of Organotransition Metal Chemistry, University ScienceBooks, Mill Valley, Calif. (1987)，第 13-20 章；均在此全文引用作为参考。合 适的亲电子基团的例子包括反应性羰基，如酰氯基，酯基，包括羰基五氟苯酯和琥珀酰亚胺 酯，酮基和醛基；反应性磺酰基，如磺酰氯基，和反应性膦酰基。其他亲电子基团包括末端环 氧基、异氰酸酯基和烷基卤。合适的亲核基团包括伯氨基、仲氨基、羟基和羧基。合适的互补反应基团在下面描述。本领域技术人员能够容易地确定可在本方法中 使用的其他反应基团对，此处提供的实例不是限制性的。在第一个实施方案中，互补反应基团包括活化的羧基、反应性磺酰基或反应性膦 酰基或它们的组合，和伯氨基或仲氨基。在该实施方案中，互补反应基团在适当条件下反 应，形成酰胺、磺酰胺或磷酰胺键。在第二个实施方案中，互补反应基团包括环氧基和伯氨基或仲氨基。含环氧化物 的结构单元与含胺的结构单元在适当条件下反应，形成碳_氮键，生成0 _氨基醇。在另一个实施方案中，互补反应基团包括吖丙啶基和伯氨基或仲氨基。在适当条 件下，含吖丙啶的结构单元与含胺的结构单元反应，形成碳_氮键，生成1，2- 二胺。在第三 个实施方案中，互补反应基团包括异氰酸酯基和伯氨基或仲氨基。含异氰酸酯的结构单元 将与含胺的结构单元在适当条件下反应，形成碳_氮键，生成脲基。在第四个实施方案中，互补反应基团包括异氰酸酯基和羟基。含异氰酸酯的结构 单元将与含羟基的结构单元在适当条件下反应，形成碳_氧键，生成氨基甲酸酯基。在第五个实施方案中，互补反应基团包括氨基和含羰基的基团，如醛基或酮基。胺 与这些基团通过还原性胺化反应，形成新的碳_氮键。在第六个实施方案中，互补反应基团包括磷叶立德基和醛基或酮基。含磷叶立德 的结构单元将与含醛或酮的结构单元在适当条件下反应，形成碳_碳双键，生成烯。在第七个实施方案中，互补反应基团通过环加成作用反应，形成环结构。这样的互 补反应基团的一个例子是炔和有机叠氮化物，它们在适当条件下反应，形成三唑环结构。使 用这种反应连接两个结构单元的一个例子在图8中显示。用于这样的反应的适当条件在本 领域中公知，包括W0 03/101972公开的那些，该专利的全部内容在此引用作为参考。在第八个实施方案中，互补反应基团是烷基卤和亲核基团，如氨基、羟基或羧基。 这些基团在适当条件下反应，形成碳-氮(烷基卤加胺)或碳-氧(烷基卤加羟基或羧基)。在第九个实施方案中，互补官能团是卤代杂芳基和亲核基团，结构单元在适当条 件下通过芳香亲核取代连接。合适的卤代杂芳基包括氯代嘧啶、三嗪和嘌呤，它们与亲核物 质如胺在水溶液中在温和条件下反应。寡核苷酸标记的三氯三嗪与胺反应的代表性例子在图9和10中显示。合适的氯代杂芳基的例子在图11中显示。应当理解，功能部分的合成可以通过一种特定类型的偶联反应进行，例如但不限 于以上所述反应中的一种，或者通过两种或多种偶联反应如以上所述的两种或多种偶联反 应的组合进行。例如，在一个实施方案中，通过酰胺键形成(氨基和羧酸互补基团)和还原 性胺化(氨基和醛或酮互补基团)的组合，结构单元连接在一起。可以使用任何偶联化学 方法，只要与寡核苷酸的存在相匹配。在本发明某些实施方案中使用的双链(双链体)寡 核苷酸标签在化学上比单链标签更强，因此，容许较宽的反应条件范围，并且能够采用用单 链标签不可能进行的键形成反应。除了反应基团或形成功能部分使用的基团以外，结构单元还可包含一个或多个官 能团。一个或多个这样的其他官能团可以受到保护，以阻止这些官能团的不需要的反应。 用于多种官能团的合适的保护基在本领域中公知(Greene和Wuts，Protective Groups in OrRanic Synthesis,第二版，New York : John Wiley and Sons (1991),在此弓|用作为参 考)。特别有用的保护基包括叔丁基酯和醚、缩醛、三苯甲基醚和胺、乙酰基酯、三甲基硅烷 基醚、三氯乙基醚和酯和氨基甲酸酯。在一个实施方案中，每个结构单元都含有两个反应基团，这两个反应基团可以相 同也可以不同。例如，在循环s中添加的每个结构单元可以包含两个相同的反应基团，但是 它们均与步骤S-1和S+1添加的结构单元的反应基团互补。在另外一个实施方案中，每个 结构单元都含有两个自身互补的反应基团。例如，包含聚酰胺分子的文库可以通过含有两 个伯氨基的结构单元与含有两个活化羧基的结构单元反应产生。产生的化合物没有N-末 端或C-末端，因为交替的酰胺基具有相反的方向性。或者，聚酰胺文库也可以用各自含有 氨基和活化羧基的结构单元产生。在该实施方案中，在循环的步骤n中添加的结构单元具 有游离的反应基团，该反应基团与n-1结构单元上可用的反应基团互补，而优选地，第n个 结构单元上的另一反应基团受到保护。例如，如果该文库的成员从C向N方向合成，则添加 的结构单元将包含活化的羧基和受到保护的氨基。功能部分可以是多聚或寡聚部分，如肽、拟肽、肽核酸或类肽，或者它们可以是非 聚合的小分子，例如具有包含中央支架的结构和绕支架周围排列的结构的分子。直链多聚 或寡聚文库通过使用具有两个反应基团的结构单元产生，而分支多聚或寡聚文库通过使用 具有三个或更多反应基团的结构单元产生，任选地与只具有两个反应基团的结构单元组 合。这样的分子可以表示为通式W. . xn，其中每一个X都是含有n个单体单元的聚合物 的单体单元，其中n是大于1的整数。对于寡聚或多聚化合物，末端结构单元不需要含有两 个官能团。例如，对于聚酰胺文库，C-末端结构单元可包含氨基，但是羧基的存在是任选的。 类似地，N末端的结构单元可包含羧基，但是不需要含有氨基。分支寡聚或多聚化合物也可以合成，只要至少一个结构单元包含三个可与其他结 构单元反应的官能团。本发明的文库可包含直链分子、支链分子或它们的组合。也可以应用如含有两个或多个反应基团的支架结构单元，与只具有一个可用反应 基团的其他结构单元组合，来构建文库，例如在任何其他反应基团被保护或者不与该支架 结构单元中存在的其他反应基团反应时。在一个实施方案中，例如，合成的分子可以表示为 通式X (Y)n，其中X是支架结构单元；每个Y都是与X连接的结构单元，n是至少为2的整数， 优选2至大约6的整数。在一个优选实施方案中，循环1的起始结构单元是支架结构单元。在通式X (Y) n的分子中，每个Y可以相同或不同，但是在典型文库的大多数成员中，每个Y都 将不同。在一个实施方案中，本发明的文库包含聚酰胺化合物。聚酰胺化合物可以由来源 于任何氨基酸的结构单元组成，这些氨基酸包括20个天然存在的a -氨基酸，如丙氨酸 (Ala ;A)、甘氨酸(Gly ；G)、天冬酰胺(Asn ；N)、天冬氨酸(Asp ；D)、谷氨酸(Glu ；E)、组氨 酸(His ；H)、亮氨酸(Leu ；L)、赖氨酸(Lys ；K)、苯丙氨酸(Phe ；F)、酪氨酸(Tyr ；Y)、苏氨 酸(Thr ；T)、丝氨酸(Ser ；S)、精氨酸(Arg ；R)、缬氨酸(Val ；V)、谷氨酰胺(Gin ；Q)、异亮氨 酸(lie ；I)、半胱氨酸(Cys ；C)、甲硫氨酸(Met ；M)、脯氨酸(Pro ；P)和色氨酸(Trp ；W)，其 中给出了每个氨基酸的三字母和单字母编码。在它们的天然存在的形式中，上述每个氨基 酸都以L-构型存在，除非另外指出，此处即这样假设。但是在本方法中，也可以使用这些 氨基酸的D-构型形式。这些D-氨基酸在此用小写三字母或单字母编码表示，S卩，ala(a), gly(g)、leu(l)、gln(q)、thr(t)、Ser(S)等。结构单元也可以来源于其他a-氨基酸，包括 但不限于3-芳基丙氨酸，如萘基丙氨酸、苯基取代的苯丙氨酸，包括4-氟_、4_氯、4-溴和 4-甲基苯丙氨酸；3-杂芳基丙氨酸，如3-吡啶基丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、3-喹啉基丙氨 酸和3-咪唑基丙氨酸；鸟氨酸；瓜氨酸；高瓜氨酸；肌氨酸；高脯氨酸；高半胱氨酸；取代的 脯氨酸，如羟脯氨酸和氟脯氨酸；脱氢脯氨酸；正亮氨酸；0-甲基酪氨酸；0-甲基丝氨酸； 0-甲基苏氨酸和3-环己基丙氨酸。上述每个氨基酸都可以以D-或L-构型使用。结构单元也可以是非a-氨基酸的氨基酸，如a-氮杂氨基酸力，y , 5，$-氨 基酸，和N-取代的氨基酸，如N-取代的甘氨酸，其中N-取代基可以是例如取代的或未取代 的烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。在一个实施方案中，N-取代基是来自天然存在 的或非天然存在的a-氨基酸的侧链。结构单元也可以是拟肽结构，如二肽、三肽、四肽或五肽模拟物。这样的拟肽结 构单元优选来源于氨酰基化合物，使得将这些结构单元添加到生长的聚(氨酰)基上的 化学与用于其他结构单元的化学相同或相似。结构单元也可以是能够形成与肽键电子等 排的键的分子，形成包含肽骨架修饰的拟肽功能部分，如￥ [CH2S]、￥ [CH2NH]、￥ [CSNH2]、 ￥ [NHCO]、￥ [C0CH2]和V [(E)或(Z) CH = CH]。在以上使用的命名中，V表示不存在酰 胺键。代替酰胺基的结构在括号内指出。在一个实施方案中，本发明提供一种合成化合物的方法，该化合物包含或由与编 码寡核苷酸可操作连接的功能部分组成。该方法包括下列步骤(1)提供由包含n个结构 单元的起始功能部分组成的起始化合物，其中n是1或大于1的整数，其中该起始功能部分 含有至少一个反应基团，并且其中该起始功能部分与编码n个结构单元的起始寡核苷酸可 操作连接；(2)将该起始化合物与包含至少一个互补反应基团的结构单元反应，其中该至 少一个互补反应基团与步骤(1)的反应基团互补，反应条件适合所述反应基团与互补反应 基团反应形成共价键；(3)将起始寡核苷酸与引入寡核苷酸反应，反应条件适合所述引入 寡核苷酸与起始寡核苷酸连接，并存在催化所述起始寡核苷酸与引入寡核苷酸连接的酶， 从而产生包含功能部分或由该功能部分组成的分子，该功能部分含有n+1个结构单元，并 且与编码寡核苷酸可操作连接。如果步骤(3)的功能部分包含反应基团，则步骤1-3可以 重复一次或多次，从而形成循环1至i，其中i是2或大于2的整数，循环s-1的步骤(3)的 产物成为循环s的步骤(1)的起始化合物，其中s是i或更小的整数。在每个循环中，一个结构单元添加到生长的功能部分上，并且编码新结构单元的一个寡核苷酸序列添加到生长 的编码寡核苷酸上。在一个优选实施方案中，每个单个结构单元与不同的寡核苷酸相联，使得在特定 循环中添加的寡核苷酸中的核苷酸序列标识在同一循环中添加的结构单元。结构单元的偶联和寡核苷酸的连接通常在相似浓度的起始材料和试剂中发生。例 如，为了使结构单元有效偶联，优选约为微摩尔至毫摩尔例如约10iiM至约10mM的反应物 浓度。在某些实施方案中，该方法在步骤(2)之后进一步包括清除任何未反应的起始功 能部分的步骤。清除特定循环中任何未反应的起始功能部分防止了该循环的起始功能部分 与后一循环中添加的结构单元反应。这样的反应可导致产生丢失了一个或多个结构单元的 功能部分，可能产生对应于特定寡核苷酸序列的一系列功能部分结构。这种清除可以通过 任何剩余的起始功能部分与可与步骤(2)的反应基团反应的化合物进行反应来实现。优选 地，清除化合物与步骤(2)的反应基团快速反应，并且不含能够与后一循环中添加的结构 单元反应的另外的反应基团。例如，在步骤(2)的反应基团是氨基的化合物合成中，适合的 清除化合物是N-羟基琥珀酰亚胺酯，如乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。在另一实施方案中，本发明提供一种制备化合物文库的方法，其中每个化合物都 包含功能部分，该功能部分包含两个或多个结构单元残基，并且与寡核苷酸可操作连接。在 一个优选实施方案中，每个分子中存在的寡核苷酸提供了足以鉴别该分子内的结构单元和 任选地结构单元添加顺序的信息。在该实施方案中，本发明的方法包括一种合成化合物文 库的方法，其中该化合物包含功能部分，该功能部分包括两个或多个结构单元，并且与标识 该功能部分结构的寡核苷酸可操作连接。该方法包括步骤(1)提供包含m种起始化合物的 溶液，其中m是1或大于1的整数，其中起始化合物由包含n个结构单元的功能部分组成， 其中n是1或大于1的整数，该功能部分与标识该n个结构单元的起始寡核苷酸可操作连 接；⑵将步骤⑴的溶液分配到至少r个反应容器中，其中r是2或大于2的整数；(3)将 每个部分与r个结构单元之一反应，从而产生r个等份，包含由功能部分组成的化合物，该 功能部分包含n+1个结构单元，并且与起始寡核苷酸可操作连接；(4)将步骤(3)的r个部 分中的每一个与一组r个不同引入寡核苷酸之一反应，反应条件适合所述引入寡核苷酸与 起始寡核苷酸发生酶连接，从而产生r个部分，包含由功能部分组成的分子，该功能部分包 含n+1个结构单元，并且与编码该n+1个结构单元的延长的寡核苷酸可操作连接。任选地， 该方法可进一步包括步骤(5)重新组合步骤(4)中产生的r个部分，从而产生包含由功能 部分组成的分子的溶液，该功能部分包含n+1个结构单元，并且与编码该n+1个结构单元的 延长的寡核苷酸可操作连接。步骤(1)至(5)可以进行一次或多次，以产生循环1至i，其 中i是2或大于2的整数。在循环s+1中，其中s是i_l或更小的整数，步骤(1)的含有m 种起始化合物的溶液是循环s的步骤(5)的溶液。同样，循环s+1的步骤(1)的起始化合 物是循环s的步骤(4)的产物。优选地，在文库合成的每个循环中将步骤(2)的溶液分成r个部分。在该实施方 案中，每个部分与独特结构单元反应。在本发明的方法中，结构单元和引入寡核苷酸的添加顺序不是关键，分子合成的 步骤(2)和(3)，和文库合成中的步骤(3)和(4)可以颠倒，即在添加新结构单元之前，引入寡核苷酸可以与起始寡核苷酸连接。在某些实施方案中，可以同时进行这两个步骤。在某些实施方案中，该方法在步骤(2)之后进一步包括清除任何未反应的起始功 能部分的步骤。清除特定循环中任何未反应的起始功能部分防止了该循环的起始功能部分 与后一循环中添加的结构单元反应。这样的反应可导致产生丢失了一个或多个结构单元的 功能部分，可能产生对应于特定寡核苷酸序列的一系列功能部分结构。这种清除可以通过 任何剩余的起始功能部分与可与步骤(2)的反应基团反应的化合物进行反应来实现。优选 地，清除化合物与步骤(2)的反应基团快速反应，并且不含能够与后一循环中添加的结构 单元反应的另外的反应基团。例如，在步骤(2)的反应基团是氨基的化合物合成中，适合的 清除化合物是N-羟基琥珀酰亚胺酯，如乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。在一个实施方案中，通过评价候选结构单元与适当互补官能团在用于合成文库的 条件下反应的能力，从一组候选结构单元中选择文库合成中使用的结构单元。然后可以选 择在这些条件下显示适当反应性的结构单元，用于引入文库中。任选地可以纯化特定循环 的产物。当循环是中间循环时，即，最终循环之前的任何循环时，这些产物是中间产物，可以 在下一循环开始前纯化。如果该循环是最后一次循环，则该循环的产物是终产物，可以在该 化合物的任何应用前纯化。该纯化步骤可以例如除去未反应的或过量的反应物和用于寡核 苷酸连接的酶。可以使用适合将产物与溶液中存在的其他物质进行分离的任何方法，包括 液相色谱，如高效液相色谱(HPLC)，和用合适的共溶剂如乙醇沉淀。合适的纯化方法依赖于 产物的性质和用于合成的溶剂系统。反应优选地在水溶液如缓冲水溶液中进行，但是也可以在与结构单元、寡核苷酸、 中间产物和终产物的溶解性质和用于催化寡核苷酸连接的酶相匹配的混合水/有机介质 中进行。应当理解，上述方法中特定循环产生的化合物的理论数目是该循环中使用的不同 起始化合物的数目m与循环中添加的不同结构单元的数目r的积。循环中产生的不同化合 物的实际数目可以高达r和m的积(rxm)，但是如果某些结构单元与某些其他结构单元的反 应性有差异的话，则可能较低。例如，向特定起始化合物上添加特定结构单元的动力学可能 是，在合成循环的时间尺度上，可能产生很少的反应产物，甚至不产生产物。在某些实施方案中，在循环1之前、最后一次循环之后或任意两次循环之间加入 通用结构单元。例如，当功能部分是聚酰胺时，可以在最后一次循环后加入通用N-末端加 帽结构单元。也可以在任意两个循环之间引入通用结构单元，例如添加官能团，如炔基或叠 氮基，它们可以在文库合成后例如通过环化用来修饰功能部分。如此处所用的术语“可操作连接”是指两个化学结构以一种方式连接在一起，使得 它们经受预期的各种操作后仍保持连接。一般来说，功能部分和编码寡核苷酸通过合适的 连接基团共价连接。该连接基团是具有寡核苷酸连接部位和功能部分连接部位的二价部 分。例如，当功能部分是聚酰胺化合物时，该聚酰胺化合物可以与连接基团在其N-末端、 C-末端或通过一个侧链上的官能团连接。该连接基团足以通过至少一个原子，优选一个以 上原子，如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个原子，分隔聚酰胺化合物和 寡核苷酸。优选地，该连接基团具有充分的柔性，可使聚酰胺化合物与靶分子以不依赖于该 寡核苷酸的方式结合。在一个实施方案中，连接基团与聚酰胺化合物的N-末端和寡核苷酸的5’ -磷酸基连接。例如，连接基团可以来源于在一个末端上含有活化羧基而在另一末端上含有活化 酯的连接基团前体。连接基团前体与N-末端氮原子的反应将形成一个酰胺键，将该连接基 团与聚酰胺化合物或N-末端结构单元连接在一起，而连接基团前体与寡核苷酸的5’ -羟 基的反应将导致寡核苷酸与连接基团通过酯键连接。连接基团可包括，例如聚亚甲基链， 如_(CH2)n-链，或聚(乙二醇)链，如_(CH2CH20)n链，其中在两种情况中，n都是1至约20 的整数。优选地，n为2至约12，更优选约4至约10。在一个实施方案中，连接基团包括环 己基(-(CH2)6-)。当结构单元是氨基酸残基时，得到的功能部分是聚酰胺。可以利用用于形成酰胺 键的任何合适的化学方法将氨基酸偶联。优选地，氨基酸结构单元的偶联在与寡核苷酸的 酶连接相匹配的条件下进行，例如在中性或接近中性的PH和水溶液中进行。在一个实施方 案中，聚酰胺化合物以C-末端到N-末端的方向合成。在该实施方案中，第一个，或者C-末 端的结构单元在其羧基处与寡核苷酸通过合适的连接基团连接。第一个结构单元与第二个 结构单元反应，第二个结构单元优选具有活化的羧基和受到保护的氨基。可以使用适合溶 液相酰胺键形成的任何活化/保护基团策略。例如，合适的活化羧基类型包括酰氟(美国专 利号5，360, 928，在此全文引用作为参考)、对称酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺酯。如本领域所 知，通过与合适的活化化合物反应，酰基也可以原位活化。合适的活化化合物包括二环己基 碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(010、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、正丙烷-膦酸酐(PPA)、N，N-二 (2-氧-3-噁唑烷基)亚氨基-磷酰氯(B0P-C1)、溴-三-吡咯烷基磷六氟磷酸(PyBrop)、 二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)、Castro ‘ s试剂(BOP，PyBop)、0-苯并三唑基-N，N, N', N'-四甲基脲盐(HBTU)、二乙基磷酰氰(0￡ 〔幻、2，5-联苯基-2，3-二氢-3-氧-4-羟 基-噻吩二氧化物(Steglich' s 试剂；H0TD0)U,1' _ 羰基-二咪唑(CDI)和 4-(4，6-二 甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4_甲基吗啉氯(DMT-MM)。偶联试剂可以单独使用或者与添 加剂如N，N- 二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)、N-羟基-苯并三唑(HOBt)、N-羟基苯并三嗪 (HOOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、N-羟基氮杂苯并三唑(HOAt)、氮杂苯并三唑基-四甲 基脲盐(HATU，HAPyU)或2-羟基吡啶组合使用。在某些实施方案中，文库的合成需要使用 两个或多个活化策略，以能够使用结构上多样化的一组结构单元。对于每个结构单元，本领 域技术人员能够确定合适的活化策略。N末端保护基可以是与该方法的条件相匹配的任何保护基，例如，适合溶液相合成 条件的保护基。一种优选的保护基是芴甲氧羰基(“Fmoc”)。氨酰基结构单元侧链上的任 何潜在反应性官能团也可能需要适当保护。优选地，侧链保护基与N末端保护基正交，即， 在不同于除去N末端保护基所需条件的条件下除去该侧链保护基。合适的侧链保护基包括 硝基藜芦基，它可以用来既保护侧链羧基又保护侧链氨基。另外一种合适的侧链胺保护基 是N-戊-4-烯酰基。结构单元可以在掺入功能部分后修饰，例如，通过涉及一个或多个结构单元上的 官能团的适当反应进行。结构单元修饰可以在添加最后一个结构单元后发生，或者在功能 部分合成的任一中间点发生，例如，在合成过程的任一循环后发生。当合成本发明的双功能 分子文库时，可以对整个文库或文库的一部分进行结构单元修饰，从而提高文库的复杂程 度。合适的结构单元修饰反应包括可以在与功能部分和编码寡核苷酸相匹配的条件下进行的那些反应。这样的反应的例子包括氨基或羟基的酰化和磺化、氨基的烷基化、羧基的酯化 或硫酯化、羧基的酰胺化、烯的环氧化和本领域公知的其他反应。当功能部分包括含有炔或 叠氮官能团的结构单元时，可以利用叠氮/炔的环加成反应衍生化该结构单元。例如，包含 炔的结构单元可与有机叠氮化物反应，或者包含叠氮的结构单元可与炔反应，在任一种情 况下都形成三唑。结构单元修饰反应可以在添加最后一个结构单元后发生，或者在合成过 程的中间点处发生，并且能够用来向功能部分上添加多种化学结构，包括碳水化合物、金属 结合部分和用于靶向某些生物分子或组织类型的结构。在另一个实施方案中，功能部分包含一系列直链结构单元，该直链系列利用适当 的反应环化。例如，如果直链排列的至少两个结构单元包括巯基，则巯基可以氧化形成二硫 键，从而环化该直链系列。例如，功能部分可以是包含两个或多个L或D-半胱氨酸和/或L 或D-高半胱氨酸部分的寡肽。结构单元也可以包含能够一起反应环化直链系列的其他官 能团，如羧基和氨基或羟基。在一个优选实施方案中，直链系列中的一个结构单元包含炔基，而直键系列中的 另一个结构单元包含叠氮基。可以诱导叠氮基和炔基通过环加成作用反应，导致形成大环 结构。在图9所示的实施例中，功能部分是在C末端包含炔丙基甘氨酸结构单元而在N末 端包含叠氮基乙酰基的多肽。炔基与叠氮基在适当条件下的反应导致环状化合物的形成， 包括大环内的三唑结构。对于文库的情况，在一个实施方案中，文库的每个成员都包含含炔 和叠氮基的结构单元，并且可以以这种方式环化。在第二个实施方案中，文库的所有成员都 包含含炔和叠氮基的结构单元，但是只有文库的一部分环化。在第三个实施方案中，只有某 些功能部分包含含炔和叠氮基的结构单元，并且只有这些分子环化。在上述第二个和第三 个实施方案中，该文库在环加成反应后既包含环状功能部分也包含直链功能部分。利用酶法连接寡核苷酸。在一个实施方案中，起始结构单元与起始寡核苷酸可操 作连接。在第二结构单元与起始结构单元偶联之前或之后，标识第二结构单元的第二寡核 苷酸序列与起始寡核苷酸连接。用于连接起始寡核苷酸序列和弓I入寡核苷酸序列的方法在 图1和图2中描述。在图1中，起始寡核苷酸是双链，一条链包含与第二寡核苷酸的一个末 端互补的突出端序列，并且使第二寡核苷酸接触起始寡核苷酸。优选地，起始寡核苷酸的突 出序列和第二寡核苷酸的互补序列都为至少约4个碱基；更优选地两个序列长度相同。可 以用合适的酶将起始寡核苷酸和第二寡核苷酸连接起来。如果起始寡核苷酸在一条链(“顶 链”)的5’末端与第一结构单元连接，则与该顶链互补的链(“底链”)将在其5’末端包含 突出端序列，第二寡核苷酸将在其5’末端包含互补序列。在第二寡核苷酸连接后，可以添 加与第二寡核苷酸的序列互补的一条链，其位于突出端互补序列的3’方向，并且包含另外 的突出端序列。在一个实施方案中，寡核苷酸如图2所示延长。定位与生长的功能部分结合的寡 核苷酸和引入寡核苷酸，用于利用“夹板”序列连接，该序列包括与起始寡核苷酸的3’末端 互补的区域和与引入寡核苷酸的5’末端互补的区域。夹板使寡核苷酸的5’末端靠近引入 寡核苷酸的3’末端，并且利用酶连接完成连接。在图2所示的实施例中，起始寡核苷酸由16 个核碱基组成，夹板与3’末端的6个碱基互补。引入寡核苷酸由12个核碱基组成，夹板与 5’末端的6个碱基互补。夹板的长度和互补区的长度不是关键的。但是，互补区应当足够 长，以便在连接条件下能够形成稳定的二聚体，而不是在终分子中产生过大的编码核苷酸。互补区的长度优选为约4个碱基至约12个碱基，更优选约5个碱基至约10个碱基，最优选 约5个碱基至约8个碱基。在一个实施方案中，起始寡核苷酸是双链，且两条链共价连接。共价连接两条链的 一种手段如图3所示，其中利用连接部分连接两条链和功能部分。该连接部分可以是任何 化学结构，其包含适合与结构单元反应的第一官能团，适合与寡核苷酸的3’ -末端反应的 第二官能团，和适合与寡核苷酸的5’-末端反应的第三官能团。优选地，第二和第三官能团 的定向使两条寡核苷酸链为相对的方向，这可使两条链杂交。例如，连接部分可以具有通式 结构⑴ 其中A是能够与结构单元形成共价键的官能团，B是能够与寡核苷酸的5’ -末端 形成键的官能团，C是能够与寡核苷酸的3’ -末端形成键的官能团。D、F和E是将官能团 A、C和B与S连接的化学基团，S为核心原子或支架。优选地，D、E和F各自独立地为原子 链，如亚烷基链或低聚(乙二醇)链，D、E和F可以相同或不同，并且优选地有效地使两个 寡核苷酸杂交及功能部分合成。在一个实施方案中，三价连接体具有结构 在该实施方案中，NH基可用于连接结构单元，而末端磷酸基可用于连接寡核苷酸。在起始寡核苷酸是双链的实施方案中，引入寡核苷酸也是双链。如图3所示，起始 寡核苷酸的一条链可以比另一条长，提供突出端序列。在该实施方案中，引入寡核苷酸包括 与起始寡核苷酸的突出端序列互补的突出端序列。两个互补突出端序列的杂交使引入寡核 苷酸进入与起始寡核苷酸连接的位置。这种连接可以用DNA或RNA连接酶酶促进行。引入 寡核苷酸和起始寡核苷酸的突出端序列优选地长度相同，并且由两个或多个核苷酸，优选 地2个至约10个核苷酸，更优选2个至约6个核苷酸组成。在一个优选的实施方案中，引入 寡核苷酸是在每一末端都有一个突出端序列的双链寡核苷酸。在一个末端处的突出端序列 与起始寡核苷酸的突出端序列互补，而在引入寡核苷酸与起始寡核苷酸连接后，在另一末端处的突出端序列成为下一循环的起始寡核苷酸的突出端序列。在一个实施方案中，三个 突出端序列长度均为2至6个核苷酸，引入寡核苷酸的编码序列长度为3至10个核苷酸， 优选3至6个核苷酸。在一个特定实施方案中，突出端序列的长度均为2个核苷酸，编码序 列的长度为5个核苷酸。在图4所示的实施方案中，引入链在其3’末端具有与起始寡核苷酸的3’末端互 补的区域，在两条链的5’末端留有突出端。5’末端可以利用如DNA聚合酶如vent聚合酶 补平，产生双链的延长寡核苷酸。该寡核苷酸的底链可以除去，并利用相同的方法向顶链的 3’末端添加另外的序列。连续添加识别每个连续结构单元的寡核苷酸导致形成编码寡核苷酸标签。在本发 明方法的一个实施方案中，连续寡核苷酸标签可以通过酶连接偶联，产生编码寡核苷酸。酶催化的寡核苷酸连接可以用具有连接核酸片段能力的任何酶进行。酶的例 子包括连接酶、聚合酶和拓扑异构酶。在本发明的特定实施方案中，应用DNA连接酶 (EC 6. 5. 1. 1)、DNA 聚合酶(EC 2. 7. 7. 7)、RNA 聚合酶(EC 2. 7. 7. 6)或拓扑异构酶(EC 5.99. 1.2)连接寡核苷酸。每个EC类别中所含的酶可见于如Bairoch (2000) Nucleic Acids Research 28 :304_5 所述。在一个优选实施方案中，在本发明方法中使用的寡核苷酸是寡脱氧核苷酸，用来 催化寡核苷酸连接的酶是DNA连接酶。为了在连接酶存在下发生连接，即为了在两个寡核 苷酸之间形成磷酸二酯键，一个寡核苷酸必须具有游离的5’磷酸基，而另一个寡核苷酸必 须具有游离的3’羟基。可以在本发明的方法中使用的DNA连接酶的例子包括T4DNA连接酶、 Taq DNA连接酶、T4RNA连接酶、DNA连接酶(大肠杆菌)(均获自如New England Biolabs, MA)。本领域技术人员应当理解，用于连接的各种酶在特定条件如温度、缓冲液浓度、pH 和时间下具有最佳活性。这些条件中的每一个都可以调节，例如根据制造商说明进行调节， 以获得寡核苷酸标签的最佳连接。引入寡核苷酸可以是任何需要的长度，但优选长度为至少三个核碱基。更优选地， 引入寡核苷酸的长度为4个或更多的核碱基。在一个实施方案中，引入寡核苷酸的长度为 3至约12个核碱基。本发明文库中的分子的寡核苷酸优选具有共同的末端序列，如本领域 所知，该序列可以用作PCR的引物。这种共同末端序列可以在文库合成的最后一个循环中 引入作为引入寡核苷酸的末端，或者可以在文库合成后添加，例如利用此处公开的酶连接 方法添加。本发明方法的一个优选实施方案如图5所示。该过程开始于在5’末端与连接体 连接的合成DNA序列，该连接体终止于氨基。在步骤1中，在Tris缓冲液中在夹板DNA链、 DNA连接酶和二硫苏糖醇的存在下，该起始DNA序列与引入DNA序列连接。产生标记DNA序 列，该序列然后可以直接用于下一步骤中，或者在进行下一步骤之前例如利用HPLC或乙醇 沉淀纯化。在步骤2中，标记DNA与保护的活化氨基酸反应，在该实施例中，与Fmoc-保护 的氨基酸氟化物反应，产生保护的氨基酸-DNA偶联物。在步骤3中，例如在哌啶的存在下 将保护的氨基酸-DNA偶联物脱保护，任选地例如通过HPLC或乙醇沉淀纯化产生的脱保护 的偶联物。脱保护的偶联物是第一合成循环的产物，并且成为第二循环的起始材料，第二循 环向脱保护偶联物的游离氨基上添加第二氨基酸残基。
在利用PCR扩增所选分子的编码寡核苷酸的实施方案中，该编码寡核苷酸优选地 包括PCR引物序列。例如，在合成的第一循环之前，起始寡核苷酸中可以包含PCR引物序 列，或者可以与第一引入寡核苷酸一起包含。编码寡核苷酸在编码序列之后也可以包含加 帽PCR引物序列。在文库合成的最后一个循环后，该加帽序列可以与编码寡核苷酸连接，或 者可以包含在最后一个循环的引入寡核苷酸中。在引入寡核苷酸包含PCR引物序列的情况 中，这些引入寡核苷酸优选地明显长于在其他循环中添加的引入寡核苷酸，因为它们既包 含编码序列也包含PCR引物序列。对于在添加最后的结构单元和最后的引入寡核苷酸后添加加帽序列的情况，如此 处所述的文库的合成包括将加帽序列与编码寡核苷酸连接的步骤，使基本所有文库成员的 寡核苷酸部分终止于包含PCR引物序列的序列中。适合在本发明的文库中使用的PCR引 物序列在本领域中公知；合适的引物和方法例如描述在Innis等人，编，PCR Protocols AGuide to Methods and Applications, San Diego :Academic Press (1990)中，其内容在 此全文引用作为参考。优选地，通过与作为最后合成循环的产物的组合组分连接，添加该加 帽序列。加帽序列可以用文库构建中使用的酶法添加。如上所述，作为本发明方法一部分的寡核苷酸标签的核苷酸序列可以用聚合酶链 反应(PCR)确定。寡核苷酸标签由标识构成如此处所述功能部分的结构单元的多核苷酸组成。寡核 苷酸标签的核酸序列通过对寡核苷酸标签进行如下PCR反应来测定。适当样品与PCR引物 对接触，该引物对的每个成员具有预先选择的核苷酸序列。该PCR引物对通过与编码寡核 苷酸标签上的PCR引物结合部位杂交，能够启动引物延伸反应。该PCR引物结合部位优选 地设计在编码寡核苷酸标签内部。例如，PCR引物结合部位可以掺入起始寡核苷酸标签内， 而第二 PCR引物结合部位可以位于最终寡核苷酸标签内。或者，第二 PCR引物结合部位可 以掺入如此处所述的加帽序列中。在优选实施方案中，该PCR引物结合部位的长度至少为 约 5、7、10、13、15、17、20、22 或 25 个核苷酸。通过将PCR引物对，优选预定量的该引物对，与编码寡核苷酸标签的核酸，优选预 定量的该核酸，在PCR缓冲液中混合，形成PCR反应混合物，进行PCR反应。将该混合物热 循环一定的循环数，该循环数一般预先确定，足以形成PCR反应产物。足够量的产物是能够 以足以进行DNA序列测定的量分离的产物。PCR 一般通过热循环进行，即在一个温度范围内重复地提高和降低PCR反应混合 物的温度，该范围的下限为约30°C至约55°C，上限为约90°C至约100°C。提高和降低可以 是连续的，但优选是阶段的，在有利于多核苷酸合成、变性和杂交的各个温度下具有相对温 度稳定的时间段。PCR反应用任何适当的方法进行。通常在缓冲的水溶液即PCR缓冲液中发生，优选 为pH 7-9。优选含有摩尔过量的引物。为了提高该方法的效率，优选较大的摩尔过量。PCR缓冲液还含有脱氧核糖核苷酸三磷酸(多核苷酸合成底物)dATP、dCTP、dGTP 和dTTP，和聚合酶，一般是热稳定的聚合酶，都是足以进行引物延伸(多核苷酸合成)反应 的量。得到的溶液(PCR混合物)加热至约90°C -100°C约1-10分钟，优选1-4分钟。该加 热阶段之后将溶液冷却至54°C，该温度是引物杂交优选的。合成反应可以在一定温度下发 生，该温度的范围从室温到高于该温度聚合酶(诱导剂)即不再有效作用的温度。因此，例如，如果使用DNA聚合酶，则温度通常不高于约40°C。重复该热循环，直到产生所需量的PCR 产物。一种典型的PCR缓冲液每100微升缓冲液含有下列试剂50mM KC1 ； 10mMTris-HCl pH 8. 3 ；1. 5mM MgCl2 ；0. 001% (wt/vol)明胶，200iiM dATP ；200uM dTTP ；200uM dCTP ； 200 u M dGTP ；和 2. 5 单位栖热水生菌(Thermus aquaticus) (Taq)DNA 聚合酶 I。用于延伸引物序列的合适的酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶、 大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、其他可以使用的DNA聚合酶、逆转录 酶，和其他酶，包括热稳定的酶，其有利于以适当的方式组合核苷酸，形成与每条核酸链互 补的引物延伸产物。合成通常开始于每个引物的3'末端，并沿着模板链以5'方向前进， 直到合成终止，产生不同长度的分子。新合成的DNA链与其互补链形成双链分子，该双链分子可以在分析方法的后续步 骤中使用。PCR 扩增方法在美国专利号 4，683，192,4, 683，202,4, 800，159 和 4，965，188 中详细描述，并且至少在 PCR Technology principles andApplications for DNA Amplification, H. Erlich, ed. ， Stockton Press, NewYork(1989)；禾口 PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Innis 等人，编，Academic Press, San Diego, Calif. (1990)中详细描述。上述所有文献的内容在此引用作为参考。如此处所用的术语“多核苷酸”用于引物、探针和将要通过引物延伸合成的核酸片 段或区段时，定义为由两个或多个、优选三个以上脱氧核糖核苷酸组成的分子。如此处所用的术语“引物”是指从核酸限制性消化物中纯化的或合成产生的多核 苷酸，当置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即在核苷酸和聚合试剂 如DNA聚合酶、逆转录酶等的存在下，以及在合适的温度和pH下，它能够作为核酸合成的起 点。为了效率最高，引物优选是单链，但是也可以是双链形式。如果是双链，则在用来制备延 伸产物之前首先处理该引物，使它与互补链分开。优选地，引物是一种聚脱氧核糖核苷酸。 引物必须足够长，以在聚合试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多 因素，包括温度和引物来源。此处所用的引物选择为与所要扩增的每个特定序列的不同链“基本”互补。意思 是引物必须充分互补，以便与相应的模板链非随机地杂交。因此，引物序列可能反映或者可 能不反映模板的准确序列。多核苷酸引物可以用任何合适的方法制备，例如Narang等人，(1979)Meth. Enzymol. ,68 90 ；美国专利号4，356，270，美国专利号4，458，066，美国专利号4，416，988， 美国专利号4，293，652 ；和Brown等人，(1979)Meth. Enzymol. ,68 109所述的磷酸三酯或
磷酸二酯法。上述所有文献的内容在此引用作为参考。一旦扩增出编码寡核苷酸标签，即可应用核酸序列分析确定该标签的序列，并最 终确定选择的分子的组成，核酸序列分析是用于测定核苷酸序列的众所周知的方法。核酸 序列分析通过以下方法的组合进行(a)基于探针链与其互补靶标杂交或变性的生理化学 技术，和(b)与聚合酶的酶反应。本发明进一步涉及可以用本发明的方法制备的化合物，和这样的化合物的集合， 其作为分离的物质或组合形成化学结构文库。本发明的化合物包括下式的化合物 其中X是包含一个或多个结构单元的功能部分，Z是在其3’末端与B连接的寡核 苷酸，Y是在其5’末端与C连接的寡核苷酸。A是与X形成共价键的官能团，B是与Z的 3’ _末端形成键的官能团，C是与Y的5’ -末端形成键的官能团。D、F和E是将官能团A、 C和B与S连接的化学基团，S是核心原子或支架。优选地，D、E和F各自独立地是原子链， 如亚烷基链或低聚(乙二醇)链，D、E和F可以相同或不同，优选地有效地使两个寡核苷酸 杂交以及功能部分合成。优选地，Y和Z基本互补，并且在化合物中定向，从而能够在合适条件下发生 Watson-Crick碱基配对和双链体形成。Y和Z的长度相同或不同。优选地，Y和Z的长度 相同，或者Y和Z之一比另一个长1至10个碱基。在一个优选实施方案中，Y和Z各自为 10个或更多碱基的长度，并且具有10个或更多个碱基对的互补区。更优选地，Y和Z在其 全长上基本互补，即它们每十个碱基对具有不超过1个错配。最优选地，Y和Z在其全长上 互补，即，除了 Y或Z上的任何突出端区域之外，这些链通过Watson-Crick碱基配对杂交， 在它们的全长上没有错配。S可以是单一原子或分子支架。例如，S可以是碳原子、硼原子、氮原子或磷原子， 或多原子支架，如磷酸基或环基，如环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基。在 一个实施方案中，连接体是如下结构的基团 其中n、m和p各自独立地是1至约20的整数，优选2至8，更优选3至6。在一个
特定实施方案中，连接体具有以下所示的结构。
在一个实施方案中，本发明的文库包括由功能部分组成的分子，该功能部分由结构单元组成，其中每个功能部分都与编码寡核苷酸可操作连接。编码寡核苷酸的核苷酸序 列指示功能部分中存在的结构单元，在一些实施方案中，指示结构单元的连接性或排列。本 发明具有以下优点，用来构建功能部分及用来构建寡核苷酸标签的方法可以在相同的反应 介质中，优选地在水性介质中进行，从而与现有技术的方法相比简化了制备文库的方法。在 寡核苷酸连接步骤和结构单元添加步骤都可以在水性介质中进行的某些实施方案中，每个 反应都具有不同的最适PH。在这些实施方案中，结构单元添加反应可以在合适的含水缓冲 液中在合适的PH和温度下进行。然后缓冲液可以用提供适于寡核苷酸连接之pH的含水缓 冲液替换。本发明的方法的一个优点是它们能够用来制备含有大量化合物的文库。利用公知 方法如聚合酶链反应(“PCR”)扩增编码寡核苷酸序列的能力意味着，即使回收的拷贝较 少，也能够鉴定选择的分子。这允许实际应用极大的文库，其由于高度复杂性，要么包含相 对较少拷贝的任何特定文库成员，要么需要使用极大的体积。例如，由108个独特结构组成， 其中每个结构具有lxlO12个拷贝(约1皮摩尔)的文库，需要约100L的1 y M有效浓度的 溶液。对于相同的文库，如果每个成员有1，000，000个拷贝，则在liiM有效浓度下需要的 体积为100 ii L。在一个优选实施方案中，文库包含约103至约1015个拷贝的每个文库成员。假定 文库成员之间的合成效率有差异，则不同文库成员在任何特定文库中可能具有不同的拷贝 数。因此，尽管文库中理论存在的每个成员的拷贝数可能相同，但是任何特定文库成员的实 际拷贝数与任何其他成员的拷贝数无关。更优选地，本发明的化合物文库包括至少约105、 106或107个拷贝的每个文库成员，或基本上所有文库成员。“基本上所有”文库成员含意是 至少约85 %的文库成员，优选至少约90 %，更优选至少约95 %的文库成员。优选地，文库包含足够拷贝数的每个成员，可对生物靶标进行多轮(即两轮或两 轮以上)选择，在最后一轮选择后剩余足够数量的结合分子，使剩余的分子的寡核苷酸标 签能够扩增，因此能够识别结合分子的功能部分。这种选择方法的示意图在图6中显示，其 中1和2代表文库成员，B是靶分子，X是与B可操作连接的部分，使得能够从选择介质中除 去B。在该实例中，化合物1与B结合，而化合物2不与B结合。如第1轮所示，该选择过程 包括(I)在适合化合物1与B结合的条件下使包含化合物1和2的文库接触B-X ； (II)除 去未结合的化合物2，(III)从B上解离化合物1，并从反应介质中除去BX。第1轮的结果 是相对于化合物2富含化合物1的分子集合。后续使用步骤I-III的几轮导致化合物1相 对于化合物2的进一步富集。尽管图6显示了 3轮选择，但是实际上可以使用任何轮数，例 如1至10轮，以实现所需的结合分子相对于非结合分子的富集。在图6所示的实施方案中，在任何选择轮数之后剩余的化合物没有扩增(更多拷 贝的合成)。这样的扩增可以产生与选择后剩余的化合物的相对量不一致的化合物的混合 物。这种不一致是由于这一事实，即某些化合物可能比其他化合物更容易合成，因此可能在 选择后以与其存在不成比例的方式扩增。例如，如果化合物2比化合物1更容易合成，则第 2轮后剩余的分子的扩增将导致化合物2相对于化合物1的不成比例扩增，获得的化合物的 混合物具有更低的(如果有的话)化合物1相对于化合物2的富集。在一个实施方案中，利用任何公知的固定技术将靶标固定在固体支持体上。固体 支持体可以是，例如层析柱或膜中所含的水不溶性基质。编码文库可以加到层析柱中所含的水不溶性基质上。然后洗柱，除去非特异性结合物。然后通过改变PH、盐浓度、有机溶剂 浓度或其他方法，如与已知配体竞争靶标，使与靶标结合的化合物解离。在另外一个实施方案中，靶标在溶液中游离，与编码文库温育。通过大小分离步 骤，如凝胶过滤或超滤，选择性分离与靶标(在此也称作“配体”)结合的化合物 。在一个实 施方案中，编码化合物与靶生物分子的混合物通过大小排阻层析柱(凝胶过滤)，从未结合 的化合物中分离任何配体_靶标复合物。将该配体_靶标复合物转移到反相层析柱上，将 配体与靶标解离。解离的配体然后通过PCR扩增和编码寡核苷酸的序列分析进行分析。在 靶标的固定可导致活性丧失的情况下，该方法特别有利。一旦通过上述方法鉴定了单一配体，即可以应用各种水平的分析获得结构-活性 关系的信息，并指导配体亲和力、特异性和生物活性的进一步优化。对于来源于同一支架的 配体，可以利用三维分子模建鉴定这些配体共同的显著结构特征，从而产生可能在靶生物 分子上共同部位结合的小分子配体家族。可以应用多种筛选方法获得对一个靶标具有高亲和力而对于另一个密切相关的 靶标具有显著较弱亲和力的配体。一种筛选策略是在平行实验中鉴定两个生物分子的配 体，接着通过交叉参考对比排除共同的配体。在该方法中，每个生物分子的配体都可以如以 上所述单独鉴定。该方法与固定的靶生物分子和在溶液中游离的靶生物分子都匹配。对于固定的靶生物分子，另外一种策略是增加一个预选步骤，以从文库中排除与 非靶生物分子结合的所有配体。例如，第一生物分子可以如上所述与文库接触。然后从形 成的任何第一生物分子_配体复合物中分离不与第一生物分子结合的化合物。然后第二生 物分子接触不与第一生物分子结合的化合物。与第二生物分子结合的化合物可以如上所述 鉴定，它们对于第二生物分子比对于第一生物分子具有显著较高的亲和力。也可以使用通过上述方法鉴定的具有未知功能的生物分子的配体，来确定该生物 分子的生物功能。这是有利的，因为尽管新的基因序列不断鉴定，但是这些序列编码的蛋白 质的功能和这些蛋白质作为新药发现及开发靶标的有效性难以确定，并且可能是应用基因 组信息治疗疾病的最大障碍。通过本发明所述方法获得的靶标特异性配体可以在全细胞生 物测定或适当的动物模型中应用，用于理解靶蛋白质的功能和靶蛋白质用于治疗性干预的 有效性。该方法也可证实靶标特别适合小分子药物发现。在一个实施方案中，本发明的文库中的一种或多种化合物鉴定为特定生物分子的 配体。然后可以在体外试验中评价这些化合物与生物分子结合的能力。优选地，合成结合 化合物的功能部分，其不含寡核苷酸标签或连接体部分，并且评价这些功能部分与生物分 子结合的能力。也可以用体外无细胞或基于细胞的试验评价功能部分与生物分子结合对生物分 子功能的影响。对于具有已知功能的生物分子，试验可以包括比较在存在及不存在配体的 情况下生物分子的活性，例如，通过直接测定活性，如酶活性，或者通过间接测定，例如该生 物分子影响的细胞功能。如果该生物分子具有未知的功能，则表达该生物分子的细胞可以 接触配体，并且评价该配体对该细胞的生存力、功能、表型和/或基因表达的影响。这样的 体外试验可以是，例如，细胞死亡测定、细胞增殖测定或病毒复制试验。例如，如果该生物分 子是病毒表达的蛋白质，则感染病毒的细胞可以与该蛋白质的配体接触。然后可以评价该 配体与蛋白质的结合对病毒生存力的影响。
利用本发明的方法鉴定的配体也可以在体内模型中或在人体内进行评价。例如， 配体可以在产生该生物分子的动物或生物体中进行评价。可以测定动物或生物体在健康状 态(例如疾病进展)上产生的任何变化。 对于一种未知功能的生物分子，如蛋白质或核酸分子，与生物分子结合的配体对 产生该生物分子的细胞或生物体的影响可以提供关于该生物分子生物功能的信息。例如， 观察到特定细胞过程在配体存在下受到抑制，指示该过程至少部分依赖于该生物分子的功 能。利用本发明的方法鉴定的配体也可以用作与与它们结合的生物分子的亲和试剂。 在一个实施方案中，利用这样的配体实现生物分子的亲和纯化，例如，通过利用连接有一种 或多种这样的配体的固相对含有该生物分子的溶液进行层析。通过下面的实施例进一步说明本发明，这些实施例不应视为限制。在本申请全文 中引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请以及附图和序列表的内容，都在此引用作 为参考。
实施例实施例1 具有大约IO5个成员的文库的合成和表征含有大约IO5个不同成员的文库的合成使用下列试剂完成化合物1 脱氧核糖核苷酸的单字母密码A =腺苷C =胞苷G=鸟苷T=胸苷结构单元前体 寡核苷酸标签序列标签编号5，-P04-GCAACGAAG (SEQ ID NO 1)1. 1ACCGTTGCT-P03-5，(SEQ ID NO 2)
5，-p03_gcgtacaag(seq id no :3)1.2accgcatgt-p03_5，(seq id no :4)
5' -po3-gctctgtag(seq id no 5)1.3accgagaca-p03-5，(seq id no 6)5，-p03-gtgccatag(seq id no :7)1.4accacggta-p03_5，(seq id no 8)5，-p03-gttgaccag(seq id no :9)1.5accaactgg-p03-5，(seq id no 10)5，-p03-cgacttgac(seq id no :11)1.6caagtcgca-p03_5，(seq id no 12)5，-p03-cgtagtcag(seq id no :13)1.7acgcatcag-p03_5，(seq id no 14)5，-p03_ccagcatag(seq id no :15)1.8acggtcgta-p03-5，(seq id no 16)5，-p03-cctacagag(seq id no :17)1.9acggatgtc-p03_5，(seq id no 18)5，-p03-ctgaacgag (seq id no 19)1. 10cgttcagca-p03-5，(seq id no 20)5，-p03-ctccagtag (seq id no 21)1. 11acgaggtca-p03_5，(seq id no 22)5，-p03-taggtccag (seq id no :23)1. 12acatccagg-p03_5，(seq id no 24)5，-p03-gcgtgttgt (seq id no 25)2. 1tccgcacaa-p03-5，(seq id no 26)5，-p03-gcttggagt(seq id no :27) 2.2tccgaacct-p03-5，(seq id no 28)5，-p03_gtcaagcgt(seq id no :29) 2.3tccagttcg-p03-5，(seq id no 30)5，-p03-caagagcgt(seq id no :31) 2.4tcgttctcg-p03-5，(seq id no 32)5，-p03_cagttcggt(seq id no :33) 2.5tcgtcaagc-p03_5，(seq id no 34)5，-po3-cgaaggagt (seq id no :35) 2.6tcgcttcct-p03-5，(seq id no 36)5，-po3-cggtgttgt (seq id no :37) 2.7tcgccacaa-p03-5，(seq id no 38)5，-p03-cgttgctgt(seq id no :39) 2.8tcgcaacga-p03-5，(seq id no 40)5，-p03-ccgatctgt(seq id no :41) 2.9
tcggctaga-p03-5，(seq id no 42)5，-p03-ccttctcgt (seq id no 43) 2. 10tcggaagag-p03_5，(seq id no 44)5，-p03-tgagtccgt (seq id no 45) 2. 11tcactcagg-p03-5，(seq id no 46)
5，-p03-tgctacggt (seq id no 47) 2. 12tcagattgc-p03_5，(seq id no 48)5，-p03-gtgcgttga (seq id no 49) 3. 1cacacgcaa-p03-5，(seq id no 50)5，-p03-gttggcaga(seq id no :51) 3.2cacaaccgt-p03_5，(seq id no 52)5，-p03-cctgtagga(seq id no :53) 3.3caggacatc-p03_5，(seq id no 54)5，-p03-ctgcgtaga(seq id no :55) 3.4cagacgcat-p03-5，(seq id no 56)5，-p03-cttacgcga(seq id no :57) 3.5cagaatgcg-p03_5，(seq id no 58)5，-p03_tggtcacga(seq id no :59) 3.6caaccagtg-p03-5，(seq id no 60)5，-po3-tcagagcga (seq id no :6i) 3.7caagtctcg-p03-5，(seq id no 62)5，-p03-ttgctcgga(seq id no :63) 3.8caaacgagc-p03_5，(seq id no 64)5，-p03_gcagttgga(seq id no :65) 3.9cacgtcaac-p03_5，(seq id no 66)5，-p03-gcctgaaga (seq id no 67) 3. 10cacggactt-p03-5，(seq id no 68)5，-p03-gtagccaga (seq id no 69) 3. 11cacatcggt-p03_5，(seq id no 70)5，-p03-gtcgcttga (seq id no 71) 3. 12cacagcgaa-p03_5，(seq id no 72)5，-p03-gcctaagtt (seq id no 73) 4. 1ctcggattc-p03-5，(seq id no 74)5，-p03-gtagtgctt(seq id no :75) 4.2ctcatcacg-p03-5，(seq id no 76)5，-p03-gtcgaagtt(seq id no :77) 4.3ctcagcttc-p03-5，(seq id no 78)5，-p03-gtttcggtt(seq id no :79) 4.4ctcaaagcc-p03-5，(seq id no 80)
5，-P03-CAGCGTTTT(SEQ ID NO :81) 4.5CTGTCGCAA-P03-5，(SEQ ID NO 82)5，-P03-CATACGCTT(SEQ ID NO :83) 4.6CTGTATGCG-P03-5，(SEQ ID NO 84)5，-P03-CGATCTGTT(SEQ ID NO :85) 4.7CTGCTAGAC-P03-5，(SEQ ID NO 86) 5，-P03-CGCTTTGTT(SEQ ID NO :87) 4.8CTGCGAAAC-P03-5，(SEQ ID NO 88)5，-P03-CCACAGTTT(SEQ ID NO :89) 4.9CTGGTGTCA-P03-5，(SEQ ID NO 90)5，-P03-CCTGAAGTT (SEQ ID NO 91) 4. 10CTGGACTTC-P03-5，(SEQ ID NO 92)5，-P03-CTGACGATT (SEQ ID NO 93) 4. 11CTGACTGCT-P03-5，(SEQ ID NO 94)5，-P03-CTCCACTTT (SEQ ID NO 95) 4. 12CTGAGGTGA-P03-5，(SEQ ID NO 96)5，-P03-ACCAGAGCC (SEQ ID NO 97) 5. 1AATGGTCTC-P03-5，(SEQ ID NO 98)5，-P03-ATCCGCACC(SEQ ID NO :99) 5.2AATAGGCGT-P03-5，(SEQ ID NO : 100)5' -PO3-GACGACACC (SEQ ID NO 101) 5.3AACTGCTGT-P03-5，(SEQ ID NO : 102)5' -PO3-GGATGGACC (SEQ ID NO 103) 5.4AACCTACCT-P03-5，(SEQ ID NO : 104)5' -PO3-GCAGAAGCC (SEQ ID NO 105)5.5AACGTCTTC-P03-5，(SEQ ID NO : 106)5' -PO3-GCCATGTCC (SEQ ID NO 107)5.6AACGGTACA-P03_5，(SEQ ID NO : 108)5' -PO3-GTCTGCTCC (SEQ ID NO 109)5.7AACAGACGA-P03_5，(SEQ ID NO : 110)5' -PO3-CGACAGACC (SEQ ID NO 111)5.8AAGCTGTCT-P03-5，(SEQ ID NO : 112)5' -PO3-CGCTACTCC (SEQ ID NO 113)5.9AAGCGATGA-P03_5，(SEQ ID NO : 114)5，-PO3-CCACAGACC (SEQ ID NO 115)5. 10AAGGTGTCT-P03-5，(SEQ ID NO : 116)5，-PO3-CCTCTCTCC (SEQ ID NO : 117)5. 11AAGGAGAGA-P03_5，(SEQ ID NO : 118)5，-PO3-CTCGTAGCC (SEQ ID NO 119)5. 12
AAGAGCATC-P03_5，(SEQ ID NO : 120)IX 连接酶缓冲液50mM Tris, pH 7. 5 ； IOmM 二硫苏糖醇；IOmMMgCl2 ；2. 5mM ATP ； 50mM NaCl。IOX 连接酶缓冲液500mM Tris, pH 7. 5 ； IOOmM 二硫苏糖醇；IOOmM MgCl2 ；25mM ATP ； 500mM NaCl。循环1向12个PCR 管的每一个中加入50 μ L ImM化合物1的水溶液；75 μ L 0. 80mM标 签1. 1-1. 12之一的溶液；15 μ L IOX连接酶缓冲液和10 μ L去离子水。将这些管加热到 950C 1分钟，然后冷却到16°C 10分钟。向每个管中加入在50 μ 1 IX连接酶缓冲液中的 5，000 单位的 Τ4 DNA 连接酶(2. 5 μ L，2，000，000 单位 /mL 溶液(New England Biolabs,目 录号M0202))，获得的溶液在16°C下温育16小时。连接后，将样品转移到1. 5ml Eppendorf管中，用20 μ L 5Μ NaCl水溶液和500 μ L 冷(_20°C )乙醇处理，在_20°C下保持1小时。离心后，弃去上清液，用70%乙醇水溶液 在-20°C下洗涤沉淀物。然后将每个沉淀物溶解于150 μ L 150mM硼酸钠缓冲液，pH 9. 4中。在DMF中制备以分别0. 25Μ的浓度含有结构单元前体BBl至ΒΒ12之一、N, N- 二 异丙基乙醇胺和0- (7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸的贮存液，并在 室温下搅拌20分钟。向上述每个沉淀溶液中添加结构单元前体溶液，提供相对于连接体10 倍过量的结构单元前体。搅拌获得的溶液。20分钟后向反应混合物中加入另外10个当量 的结构单元前体，40分钟后加入另外10个当量。DMF在反应混合物中的终浓度为22%。然 后在4°C下搅拌反应溶液过夜。使用50mM乙酸四乙铵水溶液(pH = 7. 5)和乙腈，和2-46% 乙腈的梯度，通过RP-HPLC在14分钟内监测反应的进展。当约95%的起始材料(连接体) 酰化时终止反应。酰化后合并反应混合物，冻干至干燥。然后通过HPLC纯化冻干的物质， 合并对应于文库的级分(酰化产物)，并冻干。该文库溶解于2. 5ml 0. OlM磷酸钠缓冲液(pH = 8. 2)中，向其中加入0. Iml哌啶 (4% ν/ν)。加入哌啶产生在混合时不溶解的混浊。反应混合物在室温下搅拌50分钟，然后 离心(14，OOOrpm)混浊的溶液，用200 μ 1移液管除去上清液，将沉淀物重悬浮于0. Iml水 中。含水洗液与上清液混合，弃去沉淀。通过加入过量的冰冷的乙醇使乙醇在反应液中的 终浓度为70% ν/ν，从溶液中沉淀脱保护的文库。离心含水乙醇混合物，产生含有该文库的 白色沉淀物。用冷70%乙醇水溶液洗涤沉淀物一次。除去溶剂后，使沉淀物风干(约5分 钟)，除去痕量的乙醇，然后在循环2中使用。在第1轮中使用的标签和相应的结构单元前 体在下面的表1中列出。表 1
结构单元前体 标签^ BBiITn
ΒΒ2 Γθ 循环2-5对于其中每一个循环，将前一循环产生的混合的溶液分成12等份，每份50 μ 1，置 于PCR管中。向每管中加入含有不同标签的溶液，除循环3-5省略循环1所述的HPLC纯化 步骤之外，如循环1所述进行连接、纯化和酰化。用于循环2-5的标签与结构单元前体的对 应关系在表2中给出。利用以上对于标签连接所述的方法，将循环5的产物与以下所示的封闭引物连接。5，-P03-GGCACATTGATTTGGGAGTCAGTGTAACTAAACCCTCAGT-PO3-5，表2 结果上述合成过程具有产生含有125(约249，000)个不同结构的文库的能力。通过对 每一循环的产物进行凝胶电泳，监测文库的合成。5个循环中每一个的结果和封闭引物连接 后的最终文库在图7中显示。标为“headpiece”的化合物是化合物1。该图显示每个循环 导致预期的分子量增加，每一循环的产物在分子量上基本均勻。实施例2 具有大约IO8个成员的文库的合成和表征含有大约IO8个不同成员的文库的合成使用下列试剂实现化合物2 脱氧核糖核苷酸的单字母密码A =腺苷C =胞苷G=鸟苷T =胸苷结构单元前体 表3 循环1中使用的寡核苷酸标签
标签编号顶链序列底链序列
5 ’-P03-AAATCGATGTGGTC ACTCAG5 '-P03-GAGTGACCACATCGATTTGG
1.1(SEQIDN0:121)(SEQ ID NO: 122) 5'-P03-AAATCGATGTGGACTAGGAG5 '-P03-CCTAGTCCACATCGATTTGG
1.2(SEQ ID NO: 123)(SEQ ID NO: 124)
5 '-P03-AAATCGATGTGCCGTATGAG5 '-P03-CATACGGCACATCGATTTGG
1.3(SEQ ID NO: 125)(SEQ ID NO: 126) 5'-P03-AAATCGATGTGCTGAAGGAG5 '-P03-CCTTC AGCACATCGATTTGG
1.4(SEQ ID NO: 127)(SEQ ID NO: 128)
5，-P03-AAATCGATGTGGACTAGCAG5，-P03-GCTAGTCCACATCGATTTGG
1.5(SEQ ID NO: 129)(SEQ ID NO: 130)
5 '-P03-AAATCGATGTGCGCTAAGAG5 '-P03-CTTAGCGCACATCGATTTGG
1.6(SEQ ID NO: 131)(SEQ ID NO: 132)
5 '-P03-AAATCGATGTGAGCCGAGAG5 '-P03-CTCGGCTC AC ATCG ATTTGG
1.7(SEQIDNO:133)(SEQ ID NO: 134)
1.85 '-P03-AAATCGATGTGCCGTATCAG5 '-P03-GATACGGCACATCGATTTGG(SEQIDNO:135)(SEQ ID NO:136)
5 ’ -P03-AAATCGATGTGCTGAAGCAG5 ’ -P03 -GCTTC AGC AC ATCGATTTGG
1.9(SEQ ID NO: 137)(SEQ ID NO: 138)
5 '-P03-AAATCGATGTGTGCGAGTAG5 '-P03-ACTCGCACACATCGATTTGG
1.10(SEQ ID NO: 139)(SEQ ID NO: 140)
5 ’ -P03-AAATCGATGTGTTTGGCGAG5' -P03-CGCCAAACACATCGATTTGG
1.11(SEQ ID NO: 141)(SEQ IDNO:142)
5 '-P03-AAATCGATGTGCGCTAACAG5' -P03 -GTT AGCGC AC ATCGATTTGG
1.12_(SEQ ID NO: 143)_(SEQ ID NO: 144)_
5 '-P03-AAATCGATGTGAGCCGACAG5'-P03-GTCGGCTC AC ATCGATTTGG
1.13(SEQ ID NO: 145)(SEQ ID NO: 146)
5 '-P03-AAATCGATGTGAGCCGAAAG5'-P03-TTCGGCTC AC ATCGATTTGG
1.14(SEQ ID NO: 147)(SEQ ID NO: 148)
5 '-P03-AAATCGATGTGTCGGTAGAG5'-P03-CTACCGACACATCGATTTGG
1.15(SEQ ID NO: 149)(SEQ ID NO: 150)
5 '-P03-AAATCGATGTGGTTGCCGAG5，-P03、CGGCAACCACATCGATTTGG
1.16(SEQ ID NO: 151)(SEQ ID NO: 152)
5' -P03-AAATCGATGTGAGTGCGTAG5'-P03-ACGCACTCACATCGATTTGG
1.17(SEQ ID NO: 153)(SEQ ID NO: 154) 5'-P03-AAATCGATGTGGTTGCCAAG5'-P03-TGGCAACCACATCGATTTGG
1.18(SEQ ID NO: 155)(SEQ ID NO: 156)
5' -P03 -AAATCGATGTGTGCGAGGAG5'-P03-CCTCGCACACATCGATTTGG
1.19(SEQ ID NO: 157)(SEQ ID NO: 158) 5'-P03-AAATCGATGTGGAACACGAG5 '-P03-CGTGTTCCACATCGATTTGG
1.20(SEQ ID NO: 159)(SEQ ID NO: 160) 5'-P03-AAATCGATGTGCTTGTCGAG5 '-P03-CGAC AAGC AC ATCGATTTGG
1.21(SEQIDNO:161)(SEQ ID NO: 162) 5'-P03-AAATCGATGTGTTCCGGTAG5 '-P03-AOCCGGAAC AC ATCG ATTTGG
1.22(SEQ ID NO: 163)(SEQ ID NO: 164) 5'-P03-AAATCGATGTGTGCGAGCAG5 '-P03-GCTCGCACACATCGATTTGG
1.23(SEQ ID NO: 165)(SEQ ID NO: 166) 5'-P03-AAATCGATGTGGTCAGGTAG5' -P03-ACCTGACC AC ATCGATTTGG
1.24_(SEQ ID NO: 167)_(SEQ ID NO: 168)_
5'-P03-AAATCGATGTGGCCTGTTAG5' -P03-AAC AGGCC ACATCGATTTGG
1.25(SEQ ID NO: 169)(SEQ ID NO: 170)
5 '-P03-AAATCGATGTGGAACACCAG5' -P03-GGTGTTCC AC ATCGATTTGG
1.26(SEQ ID NO: 171)(SEQ ID NO: 172) 5，-P03-AAATCGATGTGCTTGTCCAG5，-P03-GGACAAGCACATCGATTTGG
1.27(SEQ ID NO: 173)(SEQ ID NO: 174)
5 '-P03-AAATCGATGTGTGCGAGAAG5 '-P03-TCTCGCACACATCGATTTGG1.28(SEQIDNO:175)(SEQ ID NO:176)
5 '-P03-AAATCGATGTGAGTGCGGAG5 '-P03-CCGC ACTC AC ATCGATTTGG
1.29(SEQ ID NO: 177)(SEQ ID NO: 178)
5 '-P03-AAATCGATGTGTTGTCCGAG5 '-P03-CGGACAACACATCGATTTGG
1.30(SEQ ID NO: 179)(SEQ ID NO: 180)
5 '-P03-AAATCGATGTGTGGAACGAG5 '-P03-CGTTCCACACATCGATTTGG
1.31(SEQ ID NO: 181)(SEQ ID NO: 182)
5 '-P03-AAATCGATGTGAGTGCGAAG5 '-P03-TCGC ACTC ACATCGATTTGG
1.32(SEQ ID NO: 183)(SEQ ID NO: 184)
5 '-P03-AAATCGATGTGTGGAACCAG5'-P03-GGTTCCACACATCGATTTGG
1.33(SEQ ID NO: 185)(SEQ ID NO: 186)
5 '-P03-AAATCGATGTGTTAGGCGAG5'-P03-CGCCTAACACATCGATTTGG
1.34(SEQ ID NO: 187)(SEQ ID NO: 188)
5 '-P03-AAATCGATGTGGCCTGTGAG5 '-P03-CAC AGGCCAC ATCG ATTTGG
1.35(SEQ ID NO: 189)(SEQ ID NO: 190) 5'-P03-AAATCGATGTGCTCCTGTAG5 '-P03-AC AGGAGC AC ATCG ATTTGG
1.36_(SEQ ID NO: 191)_(SEQ ID NO: 192)_
5'-P03-AAATCGATGTGGTCAGGCAG5'-P03-GCCTGACC AC ATCG ATTTGG
1.37(SEQIDNO:193)(SEQ ID NO:194)
5 '-P03-AAATCGATGTGGTCAGGAAG5 '-P03-TCCTGACC ACATCGATTTGG
1.38(SEQ ID NO: 195)(SEQ ID NO: 196)
5 '-P03-AAATCGATGTGGTAGCCGAG5，-P03-CGGCTACCACATCGATTTGG
1.39(SEQ ID NO: 197)(SEQ ID NO: 198)
5 '-P03-AAATCGATGTGGCCTGTAAG5 '-P03-TACAGGCCAC ATCGATTTGG
1.40(SEQ ID NO: 199)(SEQ ID N0:200)
5 '-P03-AAATCGATGTGCTTTCGGAG5 '-P03-CCG AAAGC AC ATCG ATTTGG
1.41(SEQ ID N0:201)(SEQ ID N0:202)
5 '-P03-AAATCGATGTGCGTAAGGAG5 '-P03-CCTT ACGC AC ATCG ATTTGG
1.42(SEQ ID N0:203)(SEQ ID N0:204)
5 '-P03-AAATCGATGTGAGAGCGTAG5 '-P03-ACGCTCTCAC ATCGATTTGG
1.43(SEQ ID N0:205)(SEQ ID N0:206)
5 '-P03-AAATCGATGTGGACGGCAAG5 '-P03-TGCCGTCC AC ATCGATTTGG
1.44(SEQ ID N0:207)(SEQ ID N0:208)
5 '-P03-AAATCGATGTGCTTTCGCAG5 '-P03-GCGAAAGC AC ATCGATTTGG
1.45(SEQ ID N0:209)(SEQ ID N0.210) 5'-P03-AAATCGATGTGCGTAAGCAG5'-P03-GCTTACGCACATCGATTTGG
1.46(SEQIDNO:211)(SEQ ID NO:212)
1.475 '-P03-AAATCGATGTGGCTATGGAG5 '-P03-CC ATAGCC AC ATCG ATTTGG
(SEQIDNO:213)(SEQIDNO:214)5 '-P03-AAATCGATGTGACTCTGGAG5 '-P03-CCAGAGTCACATCGATTTGG1.48(SEQIDNO:215)(SEQIDNO:216)5 '-P03-AAATCGATGTGCTGGAAAG5 '-P03-TTCCAGCACATCGATTTGG1.49(SEQIDNO:217)(SEQIDNO:218)5，-P03-AAATCGATGTGCCGAAGTAG5 '-P03-ACTTCGGCACATCGATTTGG1.50(SEQIDNO:219)(SEQ ID N0:220)5 '-P03-AAATCGATGTGCTCCTGAAG5，-P03-TCAGGAGCACATCGATTTGG1.51(SEQIDNO:221)(SEQ ID NO:222)5 '-P03-AAATCGATGTGTCCAGTCAG5'-P03-GACTGGACACATCGATTTGG1.52(SEQ ID NO:223)(SEQ ID NO:224)5 '-P03-AAATCGATGTGAGAGCGGAG5 '-P03-CCGCTCTCACATCGATTTGG1.53(SEQ ID NO:225)(SEQ ID NO:226)5，-P03-AAATCGATGTGAGAGCGAAG5 '-P03-TCGCTCTCACATCGATTTGG1.54(SEQ ID NO:227)(SEQ ID NO:228)5' -P03-AAATCGATGTGCCGAAGGAG5 '-P03-CCTTCGGCACATCGATTTGG1.55(SEQ ID NO:229)(SEQ ID N0:230)5 '-P03-AAATCGATGTGCCGAAGCAG5 '-P03-GCTTCGGCACATCGATTTGG1.56(SEQIDNO:231)(SEQ ID NO:232)5 '-P03-AAATCGATGTGTGTTCCGAG5 '-P03-CGGAACACACATCGATTTGG1.57(SEQ ID NO:233)(SEQ ID NO:234)5 '-P03-AAATCGATGTGTCTGGCGAG5 '-P03-CGCCAGACACATCGATTTGG1.58(SEQIDNO-.235)(SEQ ID NO-.236)5 '-P03-AAATCGATGTGCTATCGGAG5 '-P03-CCGATAGCACATCGATTTGG1.59(SEQ ID NO:237)(SEQIDNO:238)5 ’ -P03-AAATCGATGTGCGAAAGGAG5 ’ -P03-CCTTTCGC ACATCGATTTGG1.60(SEQ ID NO:239)(SEQ ID N0:240)5 ’ -P03-AAATCGATGTGCCGAAGAAG5，-P03-TCTTCGGC ACATCGATTTGG1.61(SEQIDNO:241)(SEQ ID NO:242)5 '-P03-AAATCGATGTGGTTGCAGAG5 ’ -P03-CTGCAACCACATCGATTTGG1.62(SEQ ID NO:243)(SEQ ID NO:244)5 '-P03-AAATCGATGTGGATGGTGAG5 '-P03-CACCATCCACATCGATTTGG1.63(SEQ ID NO:245)(SEQ ID NO:246)5'-P03-AAATCGATGTGCTATCGCAG5 ’ -P03-GCGATAGCACATCGATTTGG1.64(SEQ ID NO:247)(SEQ ID NO:248)5 '-P03-AAATCGATGTGCGAAAGCAG5' -P03-GCTTTCGC ACATCGATTTGG1.65(SEQ ID NO:249)(SEQ ID N0:250)5 '-P03-AAATCGATGTGACACTGGAG5'-P03-CCAGTGTCACATCGATTTGG1.66(SEQIDNO:251)(SEQ ID NO:252)D315]
465 '-P03-AAATCGATGTGTCTGGCAAG
1.67(SEQ ID NO:253)
5 '-P03-AAATCGATGTGGATGGTCAG
1.68(SEQ ID NO:255)
5 '-P03-AAATCGATGTGGTTGCACAG
1.69(SEQ ID NO:257)
5 '-P03-AAATCGATGTGGGCATCGAG
1.70(SEQ ID NO:259)
5 '-P03-AAATCGATGTGTGCCTCCAG
1.71(SEQIDNO:261)
5 '-P03-AAATCGATGTGTGCCTCAAG
1.72_(SEQ ID NO:263)_
5'-P03-TGCCAGACACATCGATTTGG (SEQ ID NO:254)
5 '-P03-GACCATCCACATCGATTTGG (SEQ ID NO:256)
5 '-P03-GTGCAACCACATCGATTTGG (SEQ ID NO:258)
5'-P03-CGATGCCCCATCCGA TTT GG (SEQ ID N0:260)
5 '-P03-GGAGGCACACATCGATTTGG (SEQ ID NO:262)
5 '-P03-TGAGGCACACATCGATTTGG (SEQ ID NQ:264)_
1.73
1.74
1.75
1.76
1.77
1.78
1.79
1.80
1.81
1.82
5'-P03 - AAATCGATGTGGGC ATCC AG (SEQ ID NO:265)
5 '-P03-AAATCGATGTGGGCATCAAG (SEQ ID NO:267)
5 ’ -P03-AAATCGATGTGCCTGTCGAG (SEQ ID NO:269)
5 ’ -P03-AAATCGATGTGGACGGATAG (SEQIDNO:271)
5'-P03-AAATCGATGTGCCTGTCCAG (SEQ ID NO:273)
5 '-P03-AAATCGATGTGAAGCACGAG (SEQ ID NO:275)
5 '-P03-AAATCGATGTGCCTGTCAAG (SEQ ID NO:277)
5 '-P03-AAATCGATGTGAAGCACCAG (SEQ ID NO:279)
5 '-P03-AAATCGATGTGCCTTCGTAG (SEQIDNO:281)
5 '-P03-AAATCGATGTGTCGTCCGAG
5，-P03 -GGATGCCC ACATCGATTTGG (SEQ ID NO:266)
5，-P03-TGATGCCCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:268)
5'-P03-CGA CAG GCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID N0:270)
5'-P03-ATC CGT CCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:272)
5 '-P03-GGA CAG GCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:274)
5'-P03-CGT GCT TCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:276)
5'-P03-TGA CAG GCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:278)
5 '-P03-GGT GCT TCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID N0:280)
5'-P03-ACG AAG GCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:282)
5'-P03-CGG ACG ACA CAT CGA TTT1.83
1.84
(SEQ ID NO:283)
5 '-P03-AAATCGATGTGGAGTCTGAG (SEQ ID NO:285)
5'-P03-AAATCGATGTGTGATCCGAG (SEQ ID NO:287)_
GG
(SEQ ID NO:284)
5'-P03-CAG ACT CCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:286)
5'-P03-CGG ATC ACA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NQ.-288)_
5 '-P03-AAATCGATGTGTCAGGCGAG
1.85(SEQ ID NO:289)
5 '-P03-AAATCGATGTGTCGTCCAAG
1.86(SEQIDNO:291)
5'-P03-AAATCGATGTGGACGGAGAG
1.87(SEQ ID NO:293)
5 '-P03-AAATCGATGTGGTAGCAGAG
1.88(SEQ ID NO:295) 5'-P03-AAATCGATGTGGCTGTGTAG
1.89(SEQ ID NO:297)
5 ’ -P03 - AAATCGATGTGG ACGG AC AG
1.90(SEQIDNO-.299)
5'-P03-AAATCGATGTGTCAGGCAAG
1.91(SEQIDNO:301)
5 ’ -P03-AAATCGATGTGGCTCGAAAG
1.92(SEQ ID N0:303)
5' -P03-AAATCGATGTGCCTTCGGAG
1.93(SEQ ID N0:305)
5'-P03-AAATCGATGTGGTAGCACAG
1.94(SEQ ID N0;307)
5 '-P03-AAATCGATGTGGAAGGTCAG
1.95(SEQ ID N0:309)
5'-P03-CGC CTG ACA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID N0:290)
5'-P03-TGG ACG ACA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:292)
5'-P03-CTC CGT CCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:294)
5，-P03-CTG CTA CCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID NO:296)
5 '-P03-ACACAGCCACATCGATTTGG (SEQ ID NO:298)
5'-P03-GTC CGT CCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID N0:300)
5，-P03-TGC CTG ACA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID N0:302)
5'-P03-TTCGAGCCACATCGATTTGG (SEQ ID N0:304)
5'-P03-CCG AAG GCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID N0:306)
5'-P03-GTG CTA CCA CAT CGA TTT GG
(SEQ ID N0:308)
5'-P03-GAC CTT CCA CAT CGA TTT GG
(SEQIDNO:310)1.96
5'-P03-ACA GCA CCA CAT CGA TTT 5 '-P03-AAATCGATGTGGTGCTGTAG GG
(SEQIDNO:311)_(SEQIDNO:312)_ 表4 循环2中使用的寡核苷酸标签
标签
编号顶链序列底链序列5'-P03-GTT GCC TGT5'-P03-AGG CAA CCT2.1(SEQIDNO:313)(SEQIDNO:314)5'-P03-CAG GAC GGT5'-P03-CGT CCT GCT2.2(SEQ ID NO:315)(SEQIDNO:316)5'-P03-AGA CGT GGT5'-P03-CAC GTC TCT2.3(SEQIDNO.-317)(SEQIDNO.-318)5'-P03-CAG GAC CGT5'-P03-GGT CCT GCT2.4(SEQIDNO:319)(SEQ ID N0:320)5'-P03-CAG GAC AGT5'-P03-TGT CCT GCT2.5(SEQ ID NO:321)(SEQ ID NO:322)5'-P03-CAC TCT GGT5'-P03-CAG AGT GCT2.6(SEQ ID NO:323)(SEQ ID NO:324)5'-P03-GAC GGC TGT5'-P03-AGC CGT CCT2.7(SEQ ID NO:325)(SEQ ID NO-.326)5'-P03-CAC TCT CGT5'-P03-GAG AGT GCT2.8(SEQ ID NO:327)(SEQ ID NO:328)5'-P03-GTA GCC TGT5'-P03-AGGCTACCT2.9(SEQ ID NO:329)(SEQ ID N0:330)5'-P03-GCC ACT TGT5'-P03-AAGTGG CCT2.10(SEQIDNO:331)(SEQ ID NO:332)5'-P03-CAT CGC TGT5'-P03-AGC GAT GCT2.11(SEQ ID NO:333)(SEQ ID NO:334)5'-P03-CAC TGG TGT5，-P03-ACC AGT GCT2.12(SEQIDNO:335)(SEQIDNO:336)5'-P03-GCC ACT GGT5，-P03-CAG TGG CCT2.13(SEQ ID NO:337)(SEQIDNO:338)5'-P03-TCT GGC TGT5'-P03-AGC CAG ACT2.14(SEQ ID NO:339)(SEQ ID N0:340)5'-P03-GCC ACT CGT5，-P03-GAG TGG CCT2.15(SEQ ID NO:341)(SEQ ID NO:342)
2.16
2.17
2.18
2.19
2.20 2.21 2.22 2.23
2.24
2.25
2.26
2.27
2.28
2.29
2.30
2.31
2.32
2.33
2.34
2.35
5'-P03-TGC CTC TGT (SEQ ID NO:343) 5'-P03-CAT CGC AGT (SEQ ID NO:345) 5'-P03-CAG GAA GGT (SEQ ID NO:347) 5'-P03-GGC ATC TGT (SEQ ID NO-.349) 5'-P03-CGG TGC TGT (SEQ ID NO:351) 5'-P03-CAC TGG CGT (SEQIDNO:353) 5'-P03-TCTCCTCGT (SEQIDNO:355) 5，-P03-CCT GTC TGT (SEQIDNO:357) 5'-P03-CAA CGC TGT (SEQIDNO:359)
5'-P03-TGC CTC GGT (SEQIDNO:361) 5'-P03-ACA CTG CGT (SEQ ID NO:363) 5'-P03-TCG TCC TGT (SEQ ID NO:365) 5'-P03-GCT GCC AGT (SEQ ID NO:367) 5'-P03-TCA GGC TGT (SEQ ID NO:369) 5'-P03-GCC AGG TGT (SEQIDNO:371) 5'-P03-CGG ACC TGT (SEQ ID NO:373) 5'-P03-CAA CGC AGT (SEQ ID NO:375) 5'-P03-CAC ACG AGT (SEQ ID NO:377) 5'-P03-ATG GCC TGT (SEQ ID NO:379)
5'-P03-CCA GTC TGT
5，-P03-AGA GGC ACT (SEQ ID NO:344) 5'-P03-TGC GAT GCT (SEQ ID NO:346) 5'-P03-CTT CCT GCT (SEQ ID NO:348) 5'-P03-AGA TGC CCT (SEQIDNO-.350) 5，-P03-AGC ACC GCT (SEQIDNO.352) 5，-P03-GCC AGT GCT (SEQIDNO:354) 5 '-P03-GAGGAGACT (SEQ ID NO:356) 5，-P03-AGA CAG GCT (SEQ ID NO: 3 5 8) 5'-P03-AGC GTT GCT (SEQ ID NO:36Q)
5'-P03-CGA GGC ACT (SEQ ID NO:362) 5'-P03-GCA GTG TCT (SEQ ID NO:364) 5'-P03-AGG ACG ACT (SEQ ID NO:366) 5'-P03-TGG CAG CCT (SEQ ID NO:368) 5'-P03-AGC CTG ACT (SEQ ID N0:370) 5'-P03-ACC TGG CCT (SEQ ID NO:372) 5，-P03-AGG TCC GCT (SEQ ID NO:374) 5'-P03-TGC GTT GCT (SEQ ID NO:376) 5，_P03-TCG TGT GCT (SEQ ID NO:378) 5'-P03-AGG CCA TCT (SEQIDNC>:380)
5'-P03-AGA CTG GCT
50
(SEQIDNO.-381)(SEQ ID NO:382)5’-P03-GCC AGG AGT5，-P03-TCC TGG CCT2.36(SEQIDNO:383)(SEQ ID NO:384)5'-P03-CGG ACC AGT5'-P03-TGG TCC GCT2.37(SEQIDNO:385)(SEQ ID NO:386)5'-P03-CCT TCG CGT5'-P03-GCG AAG GCT2.38(SEQIDNO:387)(SEQ ID NO:388)5'-P03-GCA GCC AGT5'-P03-TGG CTG CCT2.39(SEQIDNO:389)(SEQ ID N0:390)5'-P03-CCA GTC GGT5，-P03-CGA CTG GCT2.40(SEQIDNO:391)(SEQ ID NO:392)5'-P03-ACT GAG CGT5'-P03-GCT CAG TCT2.41(SEQ ID NO:393)(SEQ ID NO:394)5，-P03-CCA GTC CGT5，-P03-GGA CTG GCT2.42(SEQ ID NO:395)(SEQ ID NO:396)5'-P03-CCA GTC AGT5'-P03-TGA CTG GCT2.43(SEQ ID NO:397)(SEQ ID NO:398)5'-P03-CAT CGA GGT5'-P03-CTC GAT GCT2.44(SEQ ID NO:399)(SEQ ID N0:400)5'-P03-CCA TCG TGT5'-P03-ACG ATG GCT2.45(SEQIDNO:401)(SEQ ID N0:402)5'-P03-GTG CTG CGT5'-P03-GCA GCA CCT2.46(SEQ ID N0:403)(SEQ ID N0:404)5'-P03-GAC TAC GGT5'-P03-CGT AGT CCT2.47(SEQ ID N0:405)(SEQ ID N0:406)5'-P03-GTG CTG AGT5，-P03-TCAGCACCT2.48(SEQ ID N0:407)(SEQ ID N0:408)5'-P03-GCTGCATGT5'-P03-ATGCAGCCT2.49(SEQ ID N0:409)(SEQ ID N0:410)5'-P03-GAGTGGTGT5'-P03-ACCACTCCT2.50(SEQIDNO:411)(SEQIDNO:412)5'-P03-GACTACCGT5'-P03-GGTAGTCCT2.51(SEQIDNO:413)(SEQ ID NO:414)5，-P03-CGGTGATGT5'-P03-ATCACCGCT2.52(SEQIDNO:415)(SEQ ID NO:416)5'-P03-TGCGACTGT5'-P03-AGTCGCACT2.53(SEQIDNO:417)(SEQIDNO:418)5'-P03-TCTGGAGGT5'-P03-CTCCAGACT2.54(SEQIDNO:419)(SEQ ID N0:420)
515 '-P03-AGCACTGGT5，-P。3-CAGTGCTCT2.55(SEQIDNO-.421)(SEQIDNO:422)5'-P03-TCGCTTGGT5'-P03-CAAGCGACT2.56(SEQ ID NO:423)(SEQ ID NO:424)5，-P。3、AGCACTCGT5'-P03-GAGTGCTCT2.57(SEQ ID NO:425)(SEQIDNO:426)5'-P03-GCGATTGGT5'-P03-CAATCGCCT2.58(SEQ ID NO:427)(SEQ ID NO:428)5，-P03、CCATCGCGT5'-P03-GCGATGGCT2.59(SEQ ID NO:429)(SEQ ID N0:430)5'-P03-TCGCTTCGT5'-P03-GAAGCGACT2.60(SEQ ID NO:431)(SEQ ID NO:432)5，-P03-AGTGCCTGT5'-P03-AGGCACTCT2.61(SEQ ID NO:433)(SEQ ID NO:434)5'-P03-GGCATAGGT5'-P03-CTATGCCCT2.62(SEQ ID NO:435)(SEQ ID NO:436)5'-P03-GCGATTCGT5'-P03-GAATCGCCT2.63(SEQ ID NO:437)(SEQ ID NO:438)5'-P03-TGCGACGGT5'-P03-CGTCGCACT2.64(SEQ ID NO:439)(SEQ ID N0:440)5，-P03-GAGTGGCGT5'-P03-GCCACTCCT2.65(SEQ ID NO:441)(SEQ ID NO:442)5'-P03-CGGTGAGGT5'-P03-CTCACCGCT2.66(SEQ ID NO.-443)(SEQ ID NO:444)5 '-P03-GCTGCAAGT5'-P03-TTGCAGCCT2.67(SEQ ID NO:445)(SEQ ID NO:446)5'-P03-TTCCGCTGT5'-P03-AGCGGAACT2.68(SEQ ID NO:447)(SEQ ID NO:448)5，-P03-GAGTGGAGT5'-P03-TCCACTCCT2.69(SEQ ID NO:449)(SEQ ID N0:450)5 '-P03-ACAGAGCGT5'-P03-GCTCTGTCT2.70(SEQ ID NO:451)(SEQ ID NO:452)5'-P03-TGCGACCGT5'-P03-GGTCGCACT2.71(SEQ ID NO:453)(SEQ ID NO:454)5'-P03-CCTGTAGGT5'-P03-CTACAGGCT2.72(SEQ ID NO:455)(SEQ ID NO:456)5'-P03-TAGCCGTGT5'-P03-ACGGCTACT2.73(SEQ ID NO:457)(SEQ ID NO:458)2.745'-P03-TGCGACAGT5’-P03-TGTCGCACT 表5.循环3中使用的寡核苷酸标签
(SEQIDNO.-531)
5'-P03-TCA GGA CGA
3.15(SEQ ID NO:533) 5'-P03-AAA GGC GGA
3.16(SEQ ID NO:535) 5'-P03-CTC CTC GGA
3.17(SEQ ID NO:537) 5'-P03-CAG ATG CGA
3.18(SEQ ID N0.539) 5'-P03-GCA GCAAGA
3.19(SEQIDNO:541) 5'-P03-GTG GAG TGA
3.20(SEQ ID NO:543) 5'-P03-CCA GTA GGA
3.21(SEQ ID NO:545) 5'-P03-ATGGCACGA
3.22(SEQ ID NO:547) 5'-P03-GGA CTG TGA
3.23(SEQ ID NO:549) 5'-P03-CCG AAC TGA
3.24_(SEQIDNO:551)
(SEQ ID NO:532)
5'-P03-GTC CTG AAC (SEQ ID NO:534) 5，-P03-CGC CTT TAC (SEQ ID NO:536) 5，-P〇3-CGA GGA GAC (SEQ ID NO:538) 5'-P03-GCA TCT GAC (SEQ ID N0:540) 5'-P03-TTG CTG CAC (SEQ ID NO:542) 5'-P03-ACT CCA CAC (SEQ ID NO:544) 5'-P03-CTA CTG GAC (SEQ ID NO:546) 5'-P03-GTG CCA TAC (SEQ ID NO:548) 5'-P03-ACA GTC CAC (SEQ ID N0:550) 5'-P03-AGT TCG GAC (SEQ ID NO:552)
5'-P03-CTC CTC AGA
3.25(SEQ ID NO:553) 5'-P03-CAC TGC TGA
3.26(SEQ ID NO:555) 5，-P03-AGC AGG CGA
3.27(SEQ ID NO:557) 5'-P03-AGC AGG AGA
3.28(SEQ ID NO:559) 5'-P03-AGA GCC AGA
3.29(SEQIDNO:561) 5'-P03-GTC GTT GGA
3.30(SEQ ID NO:563) 5'-P03-CCG AAC GGA
3.31(SEQ ID NO:565) 5，-P03-CAC TGC GGA
3.32(SEQ ID NO:567) 5'-P03-GTG GAG CGA
3.33(SEQ ID NO:569)
5'-P03-TGA GGA GAC (SEQ ID NO: 554) 5'-P03-AGC AGT GAC (SEQ ID NO:556) 5'-P03-GCC TGC TAC (SEQ ID NO:558) 5'-P03-TCC TGC TAC (SEQ ID N0:560) 5'-P03-TGG CTC TAC (SEQ ID NO:562) 5'-P03-CAA CGA CAC (SEQ ID NO:564) 5'-P03-CGT TCG GAC (SEQ ID NO:566) 5'-P03-CGC AGT GAC (SEQ ID NO: 568) 5，-P03-GCT CCA CAC (SEQ ID NO:570)
5，-P03-GTG GAG AGA5'-P03-TCT CCA CAC3.34(SEQIDNO:571)(SEQ ID NO: 572)5'-P03-GGA CTG CGA5'-P03-GCA GTC CAC3.35(SEQIDNO:573)(SEQ ID NO:574)5'-P03-CCG AAC CGA5'-P03-GGT TCG GAC3.36(SEQ ID NO:575)(SEQ ID NO:576)5'-P03-CAC TGC CGA5'-P03-GGC AGT GAC3.37(SEQ ID NO:577)(SEQ ID NO:578)5'-P03-CGAAACGGA5'-P03-CGT TTC GAC3.38(SEQ ID NO:579)(SEQ ID N0:580)5'-P03-GGA CTG AGA5'-P03-TCA GTC CAC3.39(SEQIDNO:581)(SEQ ID NO:582)5'-P03-CCG AAC AGA5'-P03-TGT TCG GAC3.40(SEQ ID NO:583)(SEQ ID NO:584)5，-P03-CGA AAC CGA5'-P03-GGT TTC GAC3.41(SEQ ID NO:585)(SEQIDNO:586)5'-P03-CTG GCT TGA5'-P03-AAG CCA GAC3.42(SEQ ID NO:587)(SEQ ID NO:588)5，-P03-CAC ACC TGA5'-P03-AGG TGT GAC3.43(SEQ ID NO:589)(SEQ ID N0:590)5'-P03-AAC GAC CGA5'-P03-GGT CGT TAC3.44(SEQ ID NO:591)(SEQ ID NO:592)5'-P03-ATC CAG CGA5'-P03-GCT GGA TAC3.45(SEQ ID NO:593)(SEQIDNO:594)5'-P03-TGCGAAGGA5'-P03-CTT CGC AAC3.46(SEQ ID NO:595)(SEQIDNO:596)5'-P03-TGCGAACGA5'-P03-GTT CGC AAC3.47(SEQ ID NO:597)(SEQ ID NO:598)5'-P03-CTG GCT GGA5，-P03-CAG CCA GAC3.48(SEQ ID NO:599)(SEQ ID N0:600)5'-P03-CAC ACC GGA5，-P03-CGG TGT GAC3.49(SEQIDNO:601)(SEQ ID N0:602)5'-P03-AGT GCA GGA5'-P03-CTG CAC TAC3.50(SEQ ID N0:603)(SEQ ID N0:604)5'-P03-GAC CGT TGA5'-P03-AAC GGT CAC3.51(SEQ ID N0:605)(SEQ ID N0:606)5'-P03-GGT GAG TGA5'-P03-ACT CAC CAC3.52(SEQ ID N0:607)(SEQ ID N0:608)3.535'-P03-CCTTCCTGA5'-P03-AGG AAG GAC
56(SEQ ID N0:609)(SEQ ID N0:610)
5 '-P03-CTG GCT AGA5，-P03-TAG CCA GAC
3.54(SEQIDNO:611)(SEQ ID NO:612) 5'-P03-CAC ACC AGA5'-P03-TGG TGT GAC
3.55(SEQIDNO:613)(SEQ ID NO:614) 5，-P03-AGC GGT AGA5'-P03-TAC CGC TAC
3.56(SEQIDNO:615)(SEQ ID NO:616) 5，-P03-GTC AGA GGA5'-P03-CTC TGA CAC
3.57(SEQIDNO:617)(SEQ ID NO:618) 5'-P03-TTC CGA CGA5'-P03-GTC GGA AAC
3.58(SEQIDNO:619)(SEQ ID N0:620) 5'-P03-AGG CGT AGA5'-P03-TAC GCC TAC
3.59(SEQIDNO:621)(SEQ ID NO:622) 5'-P03-CTC GAC TGA5'-P03-AGT CGA GAC
3.60_(SEQ ID NO.-623)(SEQ ID NO:624)
5'-P03-TAC GCT GGA5'-P03-CAG CGT AAC
3.61(SEQ ID NO:625)(SEQ ID NO:626) 5'-P03-GTT CGG TGA5'-P03-ACC GAA CAC
3.62(SEQ ID NO:627)(SEQ ID NO:628)
5'-P03-GCC AGC AGA5'-P03-TGC TGG CAC
3.63(SEQ ID NO:629)(SEQ ID N0:630) 5'-P03-GAC CGT AGA5'-P03-TAC GGT CAC
3.64(SEQIDNO:631)(SEQ ID NO:632)
5，-P03-GTG CTC TGA5'-P03-AGA GCA CAC
3.65(SEQ ID NO:633)(SEQ ID NO:634)
5'-P03-GGT GAG CGA5'-P03-GCT CAC CAC
3.66(SEQ ID NO:635)(SEQ ID NO:636) 5'-P03-GGT GAG AGA5'-P03-TCT CAC CAC
3.67(SEQ ID NO:637)(SEQ ID NO:638) 5'-P03-CCT TCCAGA5'-P03-TGG AAG GAC
3.68(SEQ ID NO:639)(SEQ ID N0:640)
5'-P03-CTC CTA CGA5'-P03-GTA GGA GAC
3.69(SEQ ID NO:641)(SEQ ID NO:642) 5'-P03-CTC GAC GGA5'-P03-CGT CGA GAC
3.70(SEQ ID NO;643)(SEQ ID NO:644) 5'-P03-GCC GTT TGA5'-P03-AAA CGG CAC
3.71(SEQ ID NO:645)(SEQ ID NO:646) 5'-P03-GCG GAG TGA5'-P03-ACT CCG CAC
3.72_(SEQ ID NO:647)(SEQ ID NO:648)5’-P03-CGT GCT TGA5'-P03-AAG CAC GAC
3.73(SEQ ID NO:649)(SEQ ID N0:650) 5，-P03-CTC GAC CGA5，-P03-GGT CGA GAC
3.74(SEQIDNO:651)(SEQ ID NO:652)
5'-P03-AGA GCA GGA5'-P03-CTG CTC TAC
3.75(SEQ ID NO:653)(SEQ ID NO:654) 5'-P03-GTG CTC GGA5，-P03-CGA GCA CAC
3.76(SEQ ID NO:655)(SEQ ID NO:656)
5，-P03-CTC GAC AGA5，-P03-TGT CGA GAC
3.77(SEQ ID NO:657)(SEQ ID NO:658) 5，-P03-GGA GAG TGA5'-P03-ACT CTC CAC
3.78(SEQ ID NO:659)(SEQ ID N0:660) 5'-P03-AGG CTG TGA5，-P03-ACA GCC TAC
3.79(SEQIDNO:661)(SEQ ID NO:662) 5，-P03-AGA GCA CGA5，-P03-GTG CTC TAC
3.80(SEQ ID NO:663)(SEQ ID NO:664) 5'-P03-CCA TCC TGA5'-P03-AGG ATG GAC
3.81(SEQ ID NO:665)(SEQ ID NO:666) 5'-P03-GTT CGG AGA5'-P03-TCC GAA CAC3.82(SEQ ID NO:667)(SEQ ID NO:668)
5'-P03-TGG TAG CGA5'-P03-GCT ACC AAC
3.83(SEQ ID NO:669)(SEQ ID N0:670) 5'-P03-GTG CTC CGA5'-P03-GGA GCA CAC
3.84_(SEQIDNO:671)(SEQ ID NO:672)
5'-P03-GTG CTC AGA5'-P03-TGA GCA CAC
3.85(SEQ ID NO:673) (SEQ ID NO:674) 5'-P03-GCC GTT GGA5'-P03-CAA CGG CAC
3.86(SEQ ID NO:675)(SEQ ID NO:676)
5'-P03-GAG TGC TGA5'-P03-AGC ACT CAC
3.87(SEQ ID NO:677)(SEQ ID NO:678) 5'-P03-GCT CCT TGA5'-P03-AAG GAG CAC
3.88(SEQ ID NO:679)(SEQ ID N0:680)
5 ’-P03-CCG AAA GGA5'-P03-CTT TCG GAC
3.89(SEQIDNO:681)(SEQ ID NO:682) 5'-P03-CAC TGA GGA5'-P03-CTC AGT GAC
3.90(SEQ ID NO:683)(SEQ ID NO:684) 5'-P03-CGT GCT GGA5'-P03-CAG CAC GAC
3.91(SEQ ID NO:685)(SEQ ID NO:686)
3.925'-P03-CCG AAA CGA5'-P03-GTT TCG GAC(SEQ ID NO:687)(SEQ ID NO:688)
5’-P03-GCG GAG AGA5'-P03-TCT CCG CAC 3.93(SEQ ID NO:689)(SEQ ID N0:690)
5'-P03-GCC GTT AGA5'-P03-TAA CGG CAC3.94(SEQIDNO:691)(SEQ ID NO:692)
5'-P03-TCT CGT GGA5'-P03-CAG GAG AAC
3.95(SEQ ID NO:693)(SEQ ID NO:694) 5'-P03-CGT GCT AGA5 '-P03-TAG CAC GAC
3.96_(SEQ ID NO:695)(SEQ ID NO:696)表6.循环4中使用的寡核苷酸标签
标签编号顶链序列_底链序列_
5'-P03-GCCTGTCTT5'-P03-GAC AGG CTC
4.1(SEQ ID NO:697)(SEQ ID NO:698) 5'-P03-CTCCTGGTT5'-P03-CCA GGA GTC
4.2(SEQ ID NO:699)(SEQ ID N0:700) 5'-P03-ACTCTGCTT5'-P03-GCA GAG TTC
4.3(SEQ ID N0:701)(SEQ ID N0:702) 5'-P03-CATCGCCTT5'-P03-GGC GAT GTC
4.4(SEQ ID N0:703)(SEQ ID N0:704)
5 '-P03-GCCACTATT5 '-P03-TAG TGG CTC
4.5(SEQ ID N0:705)(SEQ ID N0:706) 5'-P03-CACACGGTT5，-P03-CCG TGT GTC4.6(SEQ ID N0:707)(SEQ ID N0:708)
5'-P03-CAACGCCTT5'-P03-GGC GTT GTC
4.7(SEQ ID N0:709)(SEQ ID NO:710) 5'-P03-ACTGAGGTT5'-P03-CCT CAG TTC
4.8(SEQIDNO:711)(SEQ ID NO:712) 5'-P03-GTGCTGGTT5'-P03-CCA GCA CTC
4.9(SEQIDNO:713)(SEQ ID NO:714) 5'-P03-CATCGACTT5'-P03-GTC GAT GTC
4.10(SEQIDNO:715)(SEQ ID NO:716) 5'-P03-CCATCGGTT5'-P03-CCG ATG GTC
4.11(SEQIDNO:717)(SEQ ID NO:718) 5'-P03-GCTGCACTT5'-P03-GTG CAG CTC
4.12_(SEQ ID NO:719)(SEQ ID NO:72Q)5 '-P03-ACAGAGGTT5'-P03-CCT CTG TTC
4.13(SEQIDNO:721)(SEQ ID NO:722)
5’-P03-AGTGCCGTT5'-P03-CGG CAC TTC
4.14(SEQ ID NO:723)(SEQ ID NO:724)
5'-P03-CGGACATTT5'-P03-ATG TCC GTC
4.15(SEQ ID NO:725)(SEQ ID NO:726)
5 '-P03-GGTCTGGTT5'-P03-CCA GAC CTC
4.16(SEQ ID NO:727)(SEQ ID NO:728)
5'-P03-GAGACGGTT5'-P03-CCG TCT CTC
4.17(SEQ ID NO:729)(SEQ ID NO:730) 5'-P03-CTTTCCGTT5'-P03-CGG AAA GTC
4.18(SEQ ID NO:731)(SEQ ID NO:732) 5，-P03-CAGATGGTT5，-P03-CCA TCT GTC
4.19(SEQ ID NO:733)(SEQ ID NO:734)
5 '-P03-CGGACACTT5'-P03-GTG TCC GTC
4.20(SEQIDNO:735)(SEQ ID NO:736) 5'-P03-ACTCTCGTT5'-P03-CGA GAG TTC
4.21(SEQIDNO:737)(SEQ ID NO:738)
5'-P03-GCAGCACTT5'-P03-GTG CTG CTC4.22(SEQ ID NO:739)(SEQ ID N0:740)
5'-P03-ACTCTCCTT5'-P03-GGA GAG TTC
4.23(SEQ ID NO:741)(SEQ ID NO:742) 5'-P03-ACCTTGGTT5'-P03-CCA AGG TTC
4.24_(SEQ ID NO:743)(SEQ ID NO:744)
5'-P03-AGAGCCGTT5'-P03-CGG CTC TTC
4.25(SEQ ID NO:745)(SEQ ID NO:746)
5' -P03-ACCTTGCTT5，-P03-GCA AGG TTC
4.26(SEQ ID NO:747)(SEQ ID NO:748)
5，-P03-AAGTCCGTT5' -P03-CGG ACT TTC
4.27(SEQ ID NO:749)(SEQ ID N0:750)
5'-P03-GGA CTG GTT5'-P03-CCA GTC CTC
4.28(SEQIDNO-.751)(SEQ ID NO:752) 5'-P03-GTCGTTCTT5'-P03-GAA CGA CTC
4.29(SEQ ID NO:753)(SEQ ID NO:754)
5'-P03-CAGCATCTT5'-P03-GAT GCT GTC
4.30(SEQ ID NO:755)(SEQ ID NO:756)
5 ’-P03-CTATCCGTT5'-P03-CGG ATA GTC
4.31(SEQ ID NO:757)(SEQ ID NO:758)
4.325，-P03-ACACTCGTT5，-P03-CGA GTG TTC(SEQ ID NO:759)(SEQ ID N0:760) 5'-P03-ATCCAGGTT5，-P03-CCT GGA TTC
4.33(SEQ ID NO:761)(SEQ ID NO:762) 5'-P03-GTTCCTGTT5 '-P03-CAG GAA CTC
4.34(SEQ ID NO:763)(SEQ ID NO:764)
5，-P03-ACACTCCTT5，-P03-GGA GTG TTC
4.35(SEQ ID NO:765)(SEQ ID NO:766) 5'-P03-GTTCCTCTT5'-P03-GAG GAA CTC
4.36_(SEQ ID NQ:767)(SEQ ID NO:768)
5 '-P03-CTGGCTCTT5，-P03-GAG CCA GTC
4.37(SEQ ID NO:769)(SEQ ID NO:770) 5'-P03-ACGGCATTT5 ’-P03-ATG CCG TTC
4.38(SEQ ID NO:771)(SEQ ID NO:772) 5’-P。3-GGTGAGGTT5'-P03-CCT CAC CTC
4.39(SEQ ID NO:773)(SEQ ID NO:774)
5，-P03-CCTTCCGTT5，-P03-CGG AAG GTC
4.40(SEQ ID NO:775)(SEQ ID NO:776) 5'-P03-TACGCTCTT5'-P03-GAG CGT ATC
4.41(SEQ ID NO:777)(SEQ ID NO:778)
5'-P03-ACGGCAGTT5'-P03-CTG CCG TTC
4.42(SEQ ID NO:779)(SEQ ID N0:780 5'-P03-ACTGACGTT5'-P03-CGT CAG TTC
4.43(SEQ ID NO:781)(SEQ ID NO:782) 5'-P03-ACGGCACTT5'-P03-GTG CCG TTC
4.44(SEQ ID NO:783)(SEQ ID NO:784) 5'-P03-ACTGACCTT5'-P03-GGT CAG TTC
4.45(SEQ ID NO:785)(SEQ ID NO:786) 5'-P03-TTTGCGGTT5'-P03-CCG CAA ATC
4.46(SEQ ID NO:787)(SEQ ID NO:788) 5，-P03-TGGTAGGTT5，-P03-CCT ACC ATC
4.47(SEQ ID NO:789)(SEQ ID N0:790) 5'-P03-GTTCGGCTT5'-P03-GCC GAA CTC
4.48_(SEQ ID NO:791)(SEQ ID NO:792)
5'-P03-GCC GTT CTT5'-P03-GAA CGG CTC
4.49(SEQ ID NO:793)(SEQ ID NO:794)
5'-P03-GGAGAGGTT5'-P03-CCT CTC CTC
4.50(SEQ ID NO:795)(SEQ ID NO:796)
5'-P03-CACTGACTT5'-P03-GTC AGT GTC
4.51(SEQ ID NO:797)(SEQ ID NO:798)5’-P03-CGTGCTCTT5'-P03-GAG CAC GTC
4.52(SEQ ID NO:799)(SEQ ID N0:800) 5'-P03-AATCCGCTT5 '-P03-GCGGATTTC
4.53(SEQ ID NO:801)(SEQ ID NO:802)
5 '-P03-AGGCTGGTT5 ’-P03-CCA GCC TTC
4.54(SEQ ID NO:803)(SEQ ID NO:804) 5'-P03-GCTAGTGTT5，-P03-CAC TAG CTC
4.55(SEQ ID NO:805)(SEQ ID NO:806)
5'-P03-GGAGAGCTT5'-P03-GCT CTC CTC
4.56(SEQ ID NO:807)(SEQ ID NO:808)
5'-P03-GGAGAGATT5'-P03-TCT CTC CTC
4.57(SEQ ID N0:809)(SEQ ID N0:810)
5 '-P03-AGGCTGCTT5 '-P03-GCA GCC TTC
4.58(SEQIDNO:811)(SEQ ID NO:812)
5'-P03-GAGTGCGTT5’-P03-CGC ACT CTC
4.59(SEQIDNO:813)(SEQ ID NO:814)
5 '-P03-CCATCCATT5'-P03-TGG ATG GTC
4.60_(SEQ ID NO:815)(SEQ ID NO:816)
5 '-P03-GCTAGTCTT5 '-P03-GAC TAG CTC4.61(SEQIDNO:817)(SEQ ID NO:818)
5'-P03-AGGCTGATT5'-P03-TCA GCC TTC
4.62(SEQIDNO:819)(SEQ ID NO:820)
5'-P03-ACAGACGTT5'-P03-CGT CTG TTC
4.63(SEQIDNO:821)(SEQ ID NO:822) 5'-P03-GAGTGCCTT5'-P03-GGC ACT CTC
4.64(SEQ ID NO:823)(SEQ ID NO:824) 5'-P03-ACAGACCTT5'-P03-GGT CTG TTC
4.65(SEQ ID NO:825)(SEQ ID NO:826)
5'-P03-CGAGCTTTT5'-P03-AAG CTC GTC
4.66(SEQ ID NO:827)(SEQ ID NO:828) 5'-P03-TTAGCGGTT5'-P03-CCG CTA ATC
4.67(SEQ ID NO:829)(SEQ ID N0:830) 5'-P03-CCTCTTGTT5'-P03-CAA GAG GTC
4.68(SEQ ID NO:831)(SEQ ID NO:832) 5'-P03-GGTCTCTTT5'-P03-AGA GAC CTC
4.69(SEQ ID NO:833)(SEQ ID NO:834) 5'-P03-GCCAGATTT5'-P03-ATC TGG CTC
4.70(SEQIDNO:835)(SEQ ID NO:836)
4.715' -P03-GAGACCTTT5 '-P03-AGG TCT CTC(SEQ ID NO:837)(SEQ ID NO:838)
5'-P03-CACACAGTT5'-P03-CTG TGTGTC 4.72_(SEQ ID NO:839)(SEQ ID N0:840)
5'-P03-CCTCTTCTT5'-P03-GAA GAG GTC
4.73(SEQIDNO:841)(SEQ ID NO:842) 5'-P03-TAGAGCGTT5'-P03-CGC TCT ATC
4.74(SEQ ID NO:843)(SEQ ID NO:844) 5'-P03-GCACCTTTT5'-P03-AAG GTG CTC
4.75(SEQ ID NO:845)(SEQ ID NO:846) 5’-P03-GGCTTGTTT5'-P03-ACA AGC CTC
4.76(SEQ ID NO:847)(SEQ ID NO:848) 5'-P03-GACGCGATT5'-P03-TCG CGT CTC
4.77(SEQ ID NO:849)(SEQ ID N0:850)
5 '-P03-CGAGCTGTT5'-P03-CAG CTC GTC
4.78(SEQ ID NO:851)(SEQ ED NO:852) 5'-P03-TAGAGCCTT5'-P03-GGC TCT ATC
4.79(SEQ ID NO:853)(SEQ ID NO:854)
5'-P03-CATCCGTTT5'-P03-ACG GAT GTC
4.80(SEQ ID NO:855)(SEQ ID NO:856)
5'-P03-GGTCTCGTT5'-P03-CGA GACCTC
4.81(SEQ ID NO:857)(SEQ ID NO:858) 5'-P03-GCCAGAGTT5'-P03-CTC TGG CTC
4.82(SEQ ID NO:859)(SEQ ID N0:860)
5 '-P03-GAGACCGTT5'-P03-CGG TCT CTC
4.83(SEQ ID NO:861)(SEQ ID NO:862) 5'-P03-CGAGCTATT5，-P03-TAG CTC GTC
4.84_(SEQ ID NO:863)(SEQ ID NO:864)
5 ’ -P03-GCAAGTGTT5' -P03 -CAC TTG CTC
4.85(SEQ ID NO:865)(SEQ ID NO:866) 5'-P03-GGTCTCCTT5'-P03-GGA GAC CTC
4.86(SEQ ID NO:867)(SEQ ID NO:868)
5'-P03-GCCAGACTT5 '-P03-GTC TGG CTC
4.87(SEQ ID NO:869)(SEQ ID NO:870) 5'-P03-GGTCTCATT5'-P03-TGA GAC CTC
4.88(SEQIDNO:871)(SEQ ID NO:872)
5'-P03-GAGACCATT5'-P03-TGG TCT CTC
4.89(SEQ ID NO:873)(SEQ ID NO:874) 5'-P03-CCTTCAGTT5'-P03-CTG AAG GTC
4.90(SEQ ID NO:875)(SEQ ID NO:876) IX 连接酶缓冲液50mMTris,pH 7. 5 ;10mM 二硫苏糖醇；IOmMMgCl2 ;2mM ATP ；
50mM NaCl。IOX 连接酶缓冲液500mM Tris,pH 7. 5 ； IOOmM 二硫苏糖醇；IOOmM MgCl2 ；20mM
ATP ； 500mM NaCl。水溶性间隔基与化合物2的连接将化合物2在硼酸钠缓冲液(150mM，pH 9. 4)中的溶液(60mL，ImM)冷却到4°C，向其中加入在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF) (16mL, 0. 15M)中的40当量的N-Fmoc-15-氨 基-4，7，10，13-四氧杂硬脂酸(S-Ado)，接着加入40当量的4-(4，6-二甲氧基[1.3. 5]三 嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物水合物(DMTMM)的水溶液(9. 6mL, 0. 25M)。混合物在4°C下 轻轻摇动2小时，之后加入40当量的S-Ado和DMTMM，并在4°C下再摇动16小时。酰化后，加入0. IX体积的5M NaCl水溶液和2. 5X体积的冷(_20°C )乙醇，使该 混合物在_20°C下静置至少1小时。然后在4°C下以14，OOOrpm离心该混合物15分钟，获 得白色沉淀物，用冷EtOH洗涤，然后在冻干机中室温干燥30分钟。将固体溶解在40mL水 中，使用WatersXterra RP18柱通过反相HPLC纯化。使用50mM乙酸三乙铵缓冲液pH7. 5和 99%乙腈/1%水溶液，利用二元流动相梯度分布洗脱产物。通过冻干浓缩纯化的物质，将 获得的残余物溶解于5mL水中。向溶液中加入0. IX体积的哌啶，在室温下轻轻摇动混合物 45分钟。然后如上所述通过乙醇沉淀纯化产物，并且离心分离。将获得的沉淀物用冷EtOH 洗涤两次，通过冻干干燥，获得纯化的化合物3。 循环1向96孔板的每个孔中加入12. 5 μ L 4mM化合物3的水溶液；100 μ L如表3所示 的寡核苷酸标签1.1至1.96之一的ImM溶液(化合物3与标签的摩尔比为1 2)。将板 加热至95°C 1分钟，然后冷却至16°C 10分钟。向每孔中加入IOyL IOX连接酶缓冲液、30 单位 T4DNA 连接酶(IyL 30 单位 / μ L 溶液(FermentasLife Science,目录号 EL0013))、 76. 5μ 1水，获得的溶液在16°C下温育16小时。连接反应后，向每孔中直接加入20μ L 5Μ NaCl水溶液，然后加入500 μ L冷 (-20 0C )乙醇，在_20°C下保持1小时。在Beckman CoulterAllegra 6R离心机上，使用 Beckman Microplus Carriers，以3200g将板离心1小时。通过将板倒置小心除去上清 液，用70%冷乙醇水溶液在-20°C下洗涤沉淀物。每种沉淀物然后溶解于硼酸钠缓冲液 (50 μ L, 150mM, pH 9. 4)中至浓度为ImM,并冷却至4°C。向每种溶液中加入在DMF中的40当量的96种结构单元前体之一(13yL，0. 15M)， 然后加入40当量的DMT-MM水溶液(8μ L，0. 25M)，溶液在4°C下轻轻摇动。2小时后，加入 另外40当量的各种结构单元前体之一和DMTMM，溶液在4°C下轻轻摇动16小时。酰化后， 向每种溶液中加入在DMF中的10当量乙酸-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(2 μ L，0. 25Μ)，轻轻摇 动10分钟。酰化后，合并96个反应混合物，加入0. 1倍体积的5Μ NaCl水溶液和2. 5倍体积 的冷无水乙醇，使溶液在_20°C下静置至少1小时。然后离心该混合物。离心后，用微量移 液器除去尽可能多的上清液，用冷乙醇洗涤沉淀物，再次离心。用200yL移液管除去上清 液。向管中加入70%冷乙醇，获得的混合物在4°C下离心5分钟。弃去上清液，剩余的乙醇通过在室温下冻干10分钟除去。然后将沉淀物溶解在 2mL水中，并使用Waters Xterra RP18柱通过反相HPLC纯化。使用50mM乙酸三乙铵水缓 冲液pH 7. 5和99%乙腈/1%水溶液，利用二元流动相梯度分布洗脱文库。收集、合并和冻 干含有该文库的级分。将获得的残余物溶解在2. 5mL水中，加入250 μ L哌啶。轻轻摇动溶 液45分钟，然后如前所述用乙醇沉淀。获得的沉淀物通过冻干干燥，然后溶解在硼酸钠缓 冲液(4. 8mL, 150mM, pH 9. 4)中至浓度为 ImM。将溶液冷却至4°C，加入在DMF中的40当量的每种N-Fmoc-炔丙基甘氨酸(1. 2mL,0. 15M)和DMT-MM水溶液(7. 7mL，0. 25M)。混合物在4°C下轻轻摇动2小时，之后加入另外 40当量的N-Fmoc-炔丙基甘氨酸和DMT-MM，溶液再摇动16小时。稍后如上所述通过EtOH 沉淀和反相HPLC纯化该混合物，并且如前所述用哌啶处理除去N-Fmoc基团。在通过EtOH 沉淀进行最终纯化后，通过冻干干燥获得的沉淀物，并进入合成的下一循环。循环2-4 对于这些循环中的每一个，将来自前一循环的干燥沉淀物溶解在水中，并且根据 文库DNA成分的消光系数，通过分光光度法测定文库的浓度，其中化合物2的初始消光系数 为131，500L/(mole. cm)。用水调节文库的浓度，使后续连接反应中的终浓度为0. 25mM。然 后将文库在96孔板中分成96个等份。向每个孔中加入含有不同标签的溶液(文库与标签 的摩尔比为1 2)，如循环1所述进行连接。循环2、3、4中使用的寡核苷酸标签分别在表 4、5、6中列出。对于循环1-4中的每一个，标签与结构单元前体之间的对应关系在表7中提 供。如以上对于循环1所述，通过加入乙醇沉淀文库，并将其溶解在硼酸钠缓冲液(150mM， PH 9. 4)中至浓度为ImM。随后的酰化和纯化如循环1所述进行，不同之处在于循环3中省 略了 HPLC纯化。利用以上对于标签连接所述的方法，将循环4的产物与以下所示的封闭引物连接。5，-PO3-CAG AAG ACA GAC AAG CTT CAC CTG C (SEQ IDNO 889)5，-PO3-GCA GGT GAA GCT TGT CTG TCT TCT GAA (SEQ IDNO 890)结果上述合成程序能够产生含有964(约IO8)个不同结构的文库。通过对每一循环的 产物进行凝胶电泳和LC/MS，监测文库的合成。完成后，用几种方法分析文库。图13a是循 环4后，但在封闭引物连接前的文库的层析图；图13b是同一合成阶段的文库的质谱图。平 均分子量通过负离子LC/MS分析测定。离子信号用ProMass软件解析。该结果与预测的该 文库的平均质量一致。通过琼脂糖凝胶电泳分析文库的DNA成分，显示文库物质中的大多数对应于正确 大小的连接产物。对从文库采样获得的PCR产物的分子克隆进行DNA序列分析，显示DNA 连接高保真度地发生，并且接近于完成。文库环化在循环4结束时，在通常的酰化条件下，用叠氮基乙酸将文库的一部分在N-末端 加帽。将通过EtOH沉淀纯化的产物溶解在磷酸钠缓冲液(150mM，pH 8)中至浓度为ImM， 并加入各为4当量的CuSO4水溶液(200mM)、抗坏血酸水溶液(200mM)和以下所示化合物的 DMF溶液(200mM)。反应混合物然后在室温下轻轻摇动2小时。
Ph」 ^
{
Ph为了测定环化程度，从文库环化反应中取出5 μ L等份，用如实施例4所述制备的荧光标记的叠氮化物或炔(1μ L IOOmM DMF贮存液)处理。16小时后，根据500nm下的 HPLC分析，炔或叠氮化物标记都未掺入文库中。该结果表示该文库不再含有能够环加成的 叠氮基或炔基，因此该文库一定已经通过环化或分子间反应与自身发生了反应。如前所述 通过反相HPLC纯化环化的文库。用未环化的文库进行的对照实验显示上述荧光标记完全 掺入。实施例4 用于环化测定的荧光标记的制备在单独的管中，炔丙基甘氨酸或2-氨基-3-苯丙基叠氮(各Symol)与 FAM-OSu (Molecular Probes Inc.) (1. 2 当量)在 pH 9. 4 的硼酸盐缓冲液(250 μ L)中混 合。反应在室温下进行3小时，然后冻干过夜。经HPLC纯化获得定量产率的需要的荧光炔 和叠氮化物。 实施例5 利用叠氮/炔环加成反应环化各化合物叠氮基乙酰基-Gly-Pro-Phe-Pra-NH2的制备利用0. 3mmol Rink-酰胺树脂，以Fmoc-保护的氨基酸和HATU为活化剂，用标 准固相合成技术合成指定的序列(Pra = C-炔丙基甘氨酸)。使用叠氮基乙酸对该四肽 加帽。用20% TFA/DCM从树脂上切割肽4小时。经RP HPLC纯化获得为白色固体的产物 (75mg,51% ) ο 1H NMR(DMS0_d6，400ΜΗζ) :8· 4_7· 8 (m，3H)，7· 4_7· 1 (m，7H)，4· 6_4· 4 (m，1H)， 4. 4-4. 2 (m, 2Η)，4. 0-3. 9 (m, 2H)，3. 74 (dd, 1H, J = 6Hz, 17Hz)，3. 5-3. 3 (m, 2H)，3. 07 (dt, 1H, J = 5Hz,14Hz),2. 92(dd,1H, J = 5Hz,16Hz),2. 86(t,1H, J = 2Hz)，2. 85-2. 75(m， 1H) , 2. 6-2. 4(m，2H) ,2. 2-1. 6(m，4H)。IR (mul 1) 2900，2100，1450，1300CHT1。ESIMS 497. 4([M+H],100% ), 993. 4 ([2M+H], 50 % )。具有离子源破碎的 ESIMS :519· 3 ([M+Na]， 100% ) ,491. 3(100% ) ,480. 1 ([M-NH2], 90 % ), 452. 2 ([M-NH2-CO], 20 % ) ,424. 2(20% )， 385. 1 ([M-Pra] ,50% ), 357. 1 ([M-Pra-CO] ,40% ), 238. 0 ([M-Pra-Phe], 100% ) 叠氮基乙酰基-Gly-Pro-Phe-Pra-NH2的环化
叠氮基乙酰基肽(31mg，0. 62mmol)溶解在MeCN(30mL)中。加入二异丙基乙胺 (DIEA, ImL)和Cu(MeCN)4PF6(Img)。搅拌1. 5小时后，蒸发溶液，将获得的残余物回收在 20%MeCN/H20中。离心除去不溶性盐后，对溶液进行制备型反相HPLC。需要的环肽分离 为白色固体(10mg，32% )。1H NMR (DMS0-d6,400MHz) :8· 28 (t，1H，J = 5Hz)，7· 77 (s，1H)，
7.2-6. 9 (m, 9H)，4. 98 (m, 2H)，4. 48 (m, 1H)，4. 28 (m, 1H)，4. 1-3. 9 (m, 2H)，3. 63 (dd, 1H, J = 5Hz, 16Ηζ)，3· 33 (m，2Η)，3. O (m，3Η)，2. 48 (dd, 1H, J = 11Hz, 14Hz)，1. 75 (m, IHO, 1. 55 (m, 1H)，1. 32 (m, 1H)，1. 05 (m, 1H) IR(mull) 2900,1475，1400cm—1。ESIMS 497. 2 ([M+H], 100% ), 993. 2([2M+H],30% )，1015. 2 ([2M+Na], 15 % )。具有离子源破碎的 ESIMS 535. 2(70% )， 519. 3([M+Na], 100 % ),497. 2([M+H],80 % ),480. 1 ([Μ-ΝΗ2],30 % ),452. 2([M-NH2-CO]， 40% ) ,208. 1(60% )。叠氮基乙酰基-Gly-Pro-Phe-Pra-Gly-OH的制备利用0. 3mmol甘氨酸-Wang树脂，以Fmoc-保护的氨基酸和HATU为活化剂，合成 指定的序列。在最后的偶联步骤中使用叠氮基乙酸对该五肽加帽。用50% TFA/DCM切割该 肽2小时。经RP HPLC纯化获得为白色固体的肽(83mg ；50% ) 1H NMR(DMS0-d6,400MHz)
8.4-7. 9 (m, 4H)，7. 2 (m, 5H)，4. 7-4. 2 (m, 3H)，4. 0-3. 7 (m, 4H)，3. 5-3. 3 (m, 2H)，3. 1 (m, 1H)，2. 91 (dd, 1H, J = 4Hz, 16Hz)，2. 84 (t, 1H, J = 2. 5Hz)，2. 78 (m, 1H)，2. 6-2. 4 (m, 2H)， 2. 2-1. 6(m，4H)。IR(mull) 2900，2100，1450，1350CHT1。ESIMS 555. 3 ([M+H], 100% ) 具有 离子源破碎的ESIMS 577. 1 ([M+Na] ,90%), 555. 3 ([M+H], 80% ), 480. 1 ([M-Gly], 100% ), 385. 1 ([M-Gly-Pra],70 % ),357. 1 ([M-GIy-Pra-CO],40 % ),238. 0([M-Gly-Pra-Phe]， 80% )。叠氮基乙酰基-Gly-Pro-Phe-Pra-Gly-OH的环化将肽(32mg，0. 058mmol)溶解于MeCN(60mL)中。加入二异丙基乙胺(ImL)和 Cu(MeCN)4PF6(Img),搅拌溶液2小时。蒸发溶剂，对粗产物进行RP HPLC以除去二聚体 和三聚体。环状单体分离为无色玻璃状(6mg，20 % )。ESIMS 555. 6 ([M+H], 100 % ), 1109. 3([2M+H],20% )，1131. 2 ([2M+Na], 15% )。具有离子源破碎的 ESIMS :555· 3 ([M+H]， 100% ), 480. 4 ([M-Gly], 30 % ), 452. 2 ([M-Gly-CO] ,25% ), 424. 5 ([M_Gly-2C0], 10%,只 在环形结构中才有可能)。直链肽与DNA的偶联化合物2(45nmol)溶解在45 μ L硼酸钠缓冲液(ρΗ 9. 4 ;150mM)中。在4°C下加 入直链肽(18yL在DMF中的IOOmM贮存液；180nmol ； 40当量)，然后加入DMT_MM(3. 6 μ L500mM在水中的贮存液；180nmol ；40当量)。搅拌2小时后，LCMS显示完全反应，经乙醇沉淀 分离产物。ESIMS 1823. 0([M-3H]/3,20% )，1367. 2 ([M-4H]/4, 20 % )，1093. 7 ([M-5H]/5, 40% ) ,911. 4([M-6H]/6,100% )。环肽与DNA的偶联 化合物2 (20nmol)溶解在20 μ L硼酸钠缓冲液(ρΗ 9. 4，150mM)中。在4°C下加入 直链肽(8yL IOOmM在DMF中的贮存液；80nmol ；40当量)，然后加入DMT-MM (1. 6 μ L 500mM 在水中的贮存液；SOnmol ；40当量)。搅拌2小时后，LCMS显示完全反应，经乙醇沉淀分离产 物。ESIMS 1823. 0([M-3H]/3,20% )，1367. 2 ([M-4HJ/4, 20% )，1093. 7 ([M-5H]/5,40% )， 911. 4([M-6H]/6,100% ) DNA-连接的肽的环化直链肽-DNA偶联物(IOnmol)溶解在ρΗ 8的磷酸钠缓冲液(10 μ L，150mm)中。在 室温下加入各为4当量的CuS04、抗坏血酸和Sharpless配体(0. 2 μ L 200mM贮存液)。反 应进行过夜。RP HPLC显示没有直链肽-DNA，产物与标准环肽-DNA共洗脱。未见痕量二聚 体或其他寡聚体。 LC 条件Targa C18，2. IX 40mm, 10-40% MeCN在40mM TEAA水溶液中，8分钟实施例6 芳香亲核取代反应应用于功能部分的合成用氰尿酰氯对化合物3进行芳基化的一般程序化合物2以ImM的溶液溶解在ρΗ 9. 4硼酸钠缓冲液中。将溶液冷却至4°C，然后 以MeCN中的500mM溶液加入20当量的氰尿酰氯。2小时后，经LCMS证实反应完全，获得的 二氯三嗪-DNA偶联物经乙醇沉淀分离。二氯三嗪-DNA的胺取代程序
二氯三嗪-DNA偶联物以ImM的浓度溶解在pH 9. 5硼酸盐缓冲液中。在室温下以DMF溶液加入40当量的脂肪族胺。该反应后进行LCMS，通常在2小时后完成。获得的烷基 氨基_ 一氯三嗪-DNA偶联物经乙醇沉淀分离。一氯三嗪-DNA的胺取代程序烷基氨基-一氯三嗪-DNA偶联物以ImM的浓度溶解在pH 9. 5硼酸盐缓冲液中。 在42C下以DMF溶液加入40当量的第二种脂肪族胺。该反应后进行LCMS，通常在2小时后 完成。获得的二氨基三嗪-DNA偶联物经乙醇沉淀分离。实施例7 还原性胺化反应应用于功能部分的合成含仲胺的DNA-连接体与醛结构单元还原性胺化的一般程序化合物2与N-末端脯氨酸残基偶联。获得的化合物以ImM的浓度溶解在磷酸钠 缓冲液(50 μ L，150mM, pH 5. 5)中。向该溶液中加入各为40当量的DMF中的醛结构单元 (8 μ L，0. 25Μ)和DMF中的氰基硼氢化钠(8 μ L，0. 25Μ)，将溶液在80°C下加热2小时。烷基 化后，通过乙醇沉淀纯化该溶液。含醛的DNA-连接体与胺结构单元还原性胺化的一般程序与含醛基的结构单元偶联的化合物2以ImM的浓度溶解在磷酸钠缓冲液(50 μ L， 250mM，pH 5. 5)中。向该溶液中加入各为40当量的DMF中的胺结构单元(8μ L，0. 25M)禾口 DMF中的氰基硼氢化钠(8 μ L，0. 25M)，将溶液在80°C下加热2小时。烷基化后，通过乙醇沉 淀纯化该溶液。实施例8 类肽构建反应应用于功能部分的合成在DNA-连接体上进行类肽合成的一般程序 化合物2以ImM的浓度溶解在硼酸钠缓冲液(50 μ L，150mM, pH9. 4)中，冷却到 4°C。向该溶液中加入40当量的DMF中的N-羟基琥珀酰亚氨基溴乙酸酯(13μ ，0. 15Μ)， 该溶液在4°C下轻轻摇动2小时。酰化后，DNA-连接体经乙醇沉淀纯化，以ImM的浓度再溶 解在硼酸钠缓冲液(50 μ L，150mM, pH 9. 4)中，并冷却到4°C。向该溶液中加入40当量的 DMF中的胺结构单元(13μ ，0. 15Μ)，溶液在4°C下轻轻摇动16小时。烷化后，DNA-连接体 经乙醇沉淀纯化，以ImM的浓度再溶解在硼酸钠缓冲液(50 μ L，150mM, pH 9. 4)中，并冷却 到4°C。通过分步加入N-羟基琥珀酰亚氨基溴乙酸酯，接着加入胺结构单元，继续类肽合 成。实施例9 叠氮化物_炔环加成反应应用于功能部分合成一般程序含炔的DNA偶联物以约ImM的浓度溶解在pH 8. 0的磷酸盐缓冲液。在室温下 向该混合物中加入10当量的有机叠氮化物和各为5当量的硫酸铜(II)、抗坏血酸和配体 (三-((1-苄基三唑-4-基)甲基)胺。该反应后进行LCMS，通常在1-2小时后完成。获 得的三唑-DNA偶联物可通过乙醇沉淀分离。
实施例10 从编码文库内鉴定Abl激酶的配体为了鉴定对治疗目标具有确定性质的单一化合物，在DNA-编码文库中相对于不 需要的文库成员富集目标分子的能力是极为重要的。为了证明这种富集能力，合成了 rhAbl 激酶(GenBank U07563)的已知结合分子(描述于 Shah 等人，Science 305，399-401 (2004)， 在此引用作为参考)。利用标准化学方法将该化合物通过前面实施例中所述的连接体连接 到双链DNA寡核苷酸上，产生与通过实施例1和2所述方法产生的产物(与寡核苷酸连接 的功能部分)相类似的分子。通常如实施例2所述产生的文库和DNA-连接的Abl激酶结 合分子设计为具有独特的DNA序列，使两种物质都能进行qPCR分析。DNA-连接的Abl激酶 结合分子与文库以1 1000的比例混合。该混合物用rhAble激酶平衡，该酶在固相上捕 获，洗涤除去未结合的文库成员，洗脱结合的分子。洗脱物中文库分子与DNA-连接的Abl 激酶抑制剂的比例为1 1，表示DNA-连接的Abl-激酶结合分子获得500倍以上的富集， 与文库分子相比1000-倍过量。等同方案本领域技术人员应当认识到，或者仅应用常规实验就能够确定此处所述的本发明 的特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案包括在权利要求书的范围之内。
权利要求
一种合成包含与编码寡核苷酸可操作连接的功能部分的分子的方法，该方法包括以下步骤(a)提供由包含n个结构单元的起始功能部分组成的起始化合物，其中n是1或大于1的整数，其中该起始功能部分包含至少一个反应基团，并且与起始寡核苷酸可操作连接；(b)将该起始化合物与包含至少一个互补反应基团的结构单元反应，其中该至少一个互补反应基团与步骤(a)的反应基团互补，反应条件适合所述互补反应基团反应形成共价键；(c)将所述起始寡核苷酸与标识步骤(b)的结构单元的引入寡核苷酸反应，反应条件适合所述引入寡核苷酸与起始寡核苷酸连接形成编码寡核苷酸，并存在催化起始寡核苷酸与引入寡核苷酸连接的酶；从而产生包含功能部分的分子，该功能部分含有n+1个结构单元，并且与编码寡核苷酸可操作连接。
2.权利要求1的方法，其中步骤(c)的功能部分包含反应基团，重复步骤(a)至(c)一 次或多次，从而形成循环1至i，其中i是2或大于2的整数，其中循环s的步骤(c)的产物 是循环s+1的起始化合物，其中s是i_l或更小的整数。
3.权利要求1的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之前，或者步骤(b)在步骤(c)之前。
4.权利要求1的方法，其中所述结构单元的至少一个是氨基酸或活化的氨基酸。
5.权利要求1的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自氨基、羧基、磺酰基、膦 酰基、环氧基、吖丙啶基和异氰酸酯基。
6.权利要求1的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自羟基、羧基、磺酰基、膦 酰基、环氧基、吖丙啶基和异氰酸酯基。
7.权利要求1的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自氨基和醛基或酮基。
8.权利要求7的方法，其中所述反应基团与互补反应基团之间的反应在还原条件下进行。
9.权利要求1的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自磷叶立德基和醛基或酮基。
10.权利要求1的方法，其中所述反应基团和互补反应基团通过环加成作用反应，形成 环结构。
11.权利要求10的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自炔和叠氮基。
12.权利要求10的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自卤代杂芳基和亲核基团。
13.权利要求12的方法，其中所述卤代杂芳基选自氯代嘧啶、氯代三嗪和氯代嘌呤。
14.权利要求12的方法，其中所述亲核基团是氨基。
15.权利要求1的方法，其中所述酶选自DNA连接酶、RNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚 合酶和拓扑异构酶。
16.权利要求1的方法，其中所述起始寡核苷酸是双链或单链的。
17.权利要求16的方法，其中所述起始寡核苷酸包含PCR引物序列。
18.权利要求16的方法，其中所述起始寡核苷酸是单链的，且引入寡核苷酸是单链的； 或者起始寡核苷酸是双链的，且引入寡核苷酸是双链的。
19.权利要求18的方法，其中起始功能部分和起始寡核苷酸通过连接部分连接。
20.权利要求19的方法，其中所述起始寡核苷酸是双链的，所述连接部分与起始功能 部分和与起始寡核苷酸的两条链共价偶联。
21.权利要求1的方法，其中所述引入寡核苷酸为3到10个核苷酸的长度。
22.权利要求2的方法，其中循环i的引入寡核苷酸包含PCR封闭引物。
23.权利要求2的方法，其在循环i中进一步包括以下步骤(d)将包含封闭PCR引物序列的寡核苷酸与编码寡核苷酸连接。
24.权利要求23的方法，其中在催化所述连接的酶的存在下，将包含封闭PCR引物序列 的寡核苷酸与编码寡核苷酸连接。
25.权利要求2的方法，其在循环i后进一步包括以下步骤(e)环化所述功能部分。
26.权利要求25的方法，其中所述功能部分包含炔基和叠氮基，且将该化合物在适合 炔基和叠氮基环加成作用形成三唑基的条件下处理，从而环化该功能部分。
27.一种合成化合物文库的方法，其中化合物包含功能部分，该功能部分包含两个或 多个结构单元并且与标识该功能部分结构的起始寡核苷酸可操作连接，该方法包括下列步 骤(a)提供包含m种起始化合物的溶液，其中m是1或大于1的整数，其中起始化合物由 包含n个结构单元的功能部分组成，其中n是1或大于1的整数，该功能部分与标识该n个 结构单元的起始寡核苷酸可操作连接；(b)将步骤(a)的溶液分配到r个反应容器中，其中r是2或大于2的整数，从而产生 r个等份的溶液；(c)将每个反应容器中的起始化合物与r个结构单元之一反应，从而产生r个等份，该 等份包含由功能部分组成的化合物，该功能部分包含n+1个结构单元，并且与起始寡核苷 酸可操作连接；和(d)在适合引入寡核苷酸与起始寡核苷酸发生酶连接的条件下，在催化引入寡核苷酸 与起始寡核苷酸连接的酶的存在下，将每个等份中的起始寡核苷酸与一组r个不同引入寡 核苷酸之一反应；从而产生r个等份，这些等份包含由功能部分组成的分子，该功能部分包含n+1个结构 单元，并且与编码该n+1个结构单元的延长的寡核苷酸可操作连接。
28.权利要求27的方法，其选一步包括以下步骤(e)组合所述r个等份中的两个或多个等份，从而产生包含由功能部分组成的分子的 溶液，该功能部分包含n+1个结构单元，并且与编码该n+1个结构单元的延长的寡核苷酸可 操作连接。
29.权利要求28的方法，其中混合r个等份。
30.权利要求28的方法，其中步骤(a)至(e)进行一次或多次，产生循环1至i，其中 i是2或大于2的整数，其中在循环s+1中，其中s是i_l或更小的整数，步骤(a)的含m种 起始化合物的溶液是循环s的步骤(e)的溶液。
31.权利要求7或权利要求8的方法，其中在循环1至i的至少一个中，步骤(d)在步 骤(c)之前。
32.权利要求28的方法，其中至少一个结构单元是氨基酸。
33.权利要求7的方法，其中所述酶是DNA连接酶、RNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合 酶或拓扑异构酶。
34.权利要求28的方法，其中所述起始寡核苷酸是双链寡核苷酸。
35.权利要求34的方法，其中所述引入寡核苷酸是双链寡核苷酸。
36.权利要求28的方法，其中所述起始化合物包含连接体部分，该连接体部分包含适 合与结构单元键合的第一官能团、适合与寡核苷酸的5’末端键合的第二官能团，和适合与 寡核苷酸的3’末端键合的第三官能团。
37.权利要求36的方法，其中所述连接体部分具有结构 其中A是适合与结构单元键合的官能团； B是适合与寡核苷酸的5’末端键合的官能团； C是适合与寡核苷酸的3’末端键合的官能团； S是原子或支架； D是将A与S相连接的化学结构； E是将B与S相连接的化学结构；且 F是将C与S相连接的化学结构。
38.权利要求37的方法，其中 A是氨基；B是磷酸基；且 C是磷酸基。
39.权利要求37的方法，其中D、E和F各自独立地为亚烷基或低聚(乙二醇)基。
40.权利要求37的方法，其中S是碳原子、氮原子、磷原子、硼原子、磷酸基、环基或多环基。
41.权利要求40的方法，其中连接体部分具有结构 其中n、m和p各自独立地为1至约20的整数。
42.权利要求41的方法，其中n、m和p各自独立地为2至8的整数。
43.权利要求42的方法，其中n、m和p各自独立地为3至6的整数。
44.权利要求41的方法，其中连接体部分具有结构
45.权利要求27的方法，其中所述起始化合物的每一个都包含反应基团，并且其中所 述r个结构单元的每一个都包含与所述反应基团互补的互补反应基团。
46.权利要求45的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自氨基、羧基、磺酰基、 膦酰基、环氧基、吖丙啶基和异氰酸酯基。
47.权利要求45的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自羟基、羧基、磺酰基、 膦酰基、环氧基、吖丙啶基团和异氰酸酯基。
48.权利要求45的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自氨基和醛基或酮基。
49.权利要求45的方法，其中所述反应基团与互补反应基团之间的反应在还原条件下 进行。
50.权利要求45的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自磷叶立德基和醛基或酮基。
51.权利要求45的方法，其中所述反应基团和互补反应基团通过环加成作用反应，形 成环结构。
52.权利要求51的方法，其中所述反应基团和互补反应基团选自炔和叠氮基。
53.权利要求45的方法，其中所述反应基团和互补官能团选自卤代杂芳基和亲核基团。
54.权利要求53的方法，其中所述卤代杂芳基选自氯代嘧啶、氯代三嗪和氯代嘌呤。
55.权利要求53的方法，其中所述亲核基团是氨基。
56.权利要求28的方法，其在循环i后进一步包括以下步骤 (f)环化一个或多个功能部分。
57.权利要求56的方法，其中步骤(f)的功能部分包含叠氮基和炔基。
58.权利要求57的方法，其中所述功能部分保持在适合叠氮基和炔基环加成反应形成 三唑基的条件下，从而形成环状功能部分。
59.权利要求58的方法，其中所述环加成反应在铜催化剂的存在下进行。
60.权利要求59的方法，其中步骤(f)的一个或多个功能部分中的至少一个包含至少 两个巯基，并且该功能部分保持在适合两个巯基反应形成二硫基的条件下，从而环化该功 能部分。
61.权利要求27的方法，其中所述起始寡核苷酸包含PCR引物序列。
62.权利要求28的方法，其中循环i的引入寡核苷酸包含PCR封闭引物。
63.权利要求28的方法，其在循环i后进一步包括以下步骤(d)将包含封闭PCR引物序列的寡核苷酸与编码寡核苷酸连接。
64.权利要求63的方法，其中在催化所述连接的酶的存在下，所述包含封闭PCR引物序 列的寡核苷酸与编码寡核苷酸连接。
65.下式的化合物 其中X是包含一个或多个结构单元的功能部分； Z是在其3’末端与B连接的寡核苷酸； Y是在其5’末端与C连接的寡核苷酸； A是与X形成共价键的官能团； B是与Z的3’ -末端形成键的官能团； C是与Y的5’ -末端形成键的官能团； D、F和E各自独立地是双功能连接基团；且 S是原子或分子支架。
66.权利要求65的化合物，其中D、E和F各自独立地是亚烷基链或低聚(乙二醇)链。
67.权利要求65的化合物，其中Y和Z基本互补，并且在化合物中定向，从而在适当条 件下能够发生Watson-Crick碱基配对和双链体形成。
68.权利要求65的化合物，其中Y和Z具有相同的长度或不同的长度。
69.权利要求68的化合物，其中Y和Z具有相同的长度。
70.权利要求65的化合物，其中Y和Z各为10个或更多碱基的长度，并且具有10个或 更多碱基对的互补区。
71.权利要求65的化合物，其中S是碳原子、硼原子、氮原子、磷原子或多原子支架。
72.权利要求71的化合物，其中S是磷酸基或环基。
73.权利要求72的化合物，其中S是环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基。
74.权利要求65的化合物，其中连接体部分具有结构 其中n、m和p各自独立地为1至约20的整数。
75.权利要求74的化合物，其中n、m和p各自独立地为2至8的整数。
76.权利要求75的化合物，其中n、m和p各自独立地为3至6的整数。
77.权利要求65的化合物，其中连接体部分具有结构
78.权利要求65的化合物，其中X和Y包含PCR引物序列。
79.—种包含至少约102种不同化合物的化合物文库，该化合物包含功能部分，该功能 部分包含两个或多个结构单元并且与识别该功能部分结构的寡核苷酸可操作连接。
80.权利要求79的化合物文库，该文库包含各为至少约105个拷贝的不同化合物。
81.权利要求79的化合物文库，该文库包含各为至少约106个拷贝的不同化合物。
82.权利要求79的化合物文库，其包含至少约104种不同的化合物。
83.权利要求79的化合物文库，其包含至少约106种不同的化合物。
84.权利要求79的化合物文库，其包含至少约108种不同的化合物。
85.权利要求79的化合物文库，其包含至少约101(1种不同的化合物。
86.权利要求79的化合物文库，其包含至少约1012种不同的化合物。
87.权利要求79的化合物文库，其中该文库包含多种独立地为式I的化合物 其中X是包含一个或多个结构单元的功能部分； Z是在其3’末端与B连接的寡核苷酸； Y是在其5’末端与C连接的寡核苷酸； A是与X形成共价键的官能团； B是与Z的3’ -末端形成键的官能团； C是与Y的5’ -末端形成键的官能团； D、F和E各自独立地是双功能连接基团；且 S是原子或分子支架。
88.权利要求87的化合物文库，其中对于每一种式I的化合物，A、B、C、D、E、F和S各 自具有相同的身份。
89.权利要求87的化合物文库，该文库基本由多种式I的化合物组成。
90.权利要求87的化合物文库，其中D、E和F各自独立地是亚烷基链或低聚(乙二醇)链。
91.权利要求87的化合物文库，其中Y和Z基本互补，并且在化合物中定向，从而在适 当条件下能够发生Watson-Crick碱基配对和双链体形成。
92.权利要求87的化合物文库，其中Y和Z具有相同的长度或不同的长度。
93.权利要求87的化合物文库，其中Y和Z具有相同的长度。
94.权利要求87的化合物文库，其中Y和Z各自为10个或更多碱基的长度，并且具有 10个或更多碱基对的互补区。
95.权利要求87的化合物文库，其中S是碳原子、硼原子、氮原子、磷原子或多原子支^K o
96.权利要求87的化合物文库，其中S是磷酸基或环基。
97.权利要求96的化合物文库，其中S是环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基。
98.权利要求87的化合物文库，其中连接体部分具有结构 其中n、m和p各自独立地是1至约20的整数。
99.权利要求98的化合物文库，其中n、m和p各自独立地是2至8的整数。
100.权利要求99的化合物，其中n、m和p各自独立地是3至6的整数。
101.权利要求87的化合物，其中连接体部分具有结构
102.权利要求87的化合物文库，其中X和Z包含PCR引物序列。
103.由权利要求1的方法制备的一种化合物。
104.由权利要求27的方法制备的一种化合物文库。
105.一种鉴定能与生物靶标结合的一种或多种化合物的方法，该方法包括以下步骤(a)在适合化合物文库的至少一个成员与靶标结合的条件下使该生物靶标接触通过权 利要求27的方法制备的化合物文库；(b)除去不与该靶标结合的文库成员；(c)扩增能与该靶标结合的化合物文库至少一个成员的编码寡核苷酸；(d)对步骤(c)的编码寡核苷酸进行测序；和(e)利用步骤(d)测定的序列确定能与该生物靶标结合的化合物文库成员的功能部分 的结构；从而鉴定能与生物靶标结合的一种或多种化合物。
106.一种鉴定能与生物靶标结合的化合物的方法，该方法包括以下步骤(a)在适合化合物文库的至少一个成员与靶标结合的条件下，使生物靶标接触包含至 少约102种不同化合物的化合物文库，该化合物包含功能部分，该功能部分包含两个或多个 结构单元，并且与标识该功能部分的结构的寡核苷酸可操作连接；(b)除去不与该靶标结合的文库成员；(c)扩增能与该靶标结合的化合物文库至少一个成员的编码寡核苷酸；(d)对步骤(c)的编码寡核苷酸进行测序；和 (e)利用步骤(d)测定的序列确定能与该生物靶标结合的化合物文库成员的功能部分 的结构；从而鉴定能与该生物靶标结合的一种或多种化合物。
107.权利要求106的方法，其中所述文库包含各为至少约105个拷贝的不同化合物。
108.权利要求106的方法，其中所述文库包含各为至少约106个拷贝的不同化合物。
109.权利要求106的方法，其中所述文库包含至少约104种不同的化合物。
110.权利要求106的方法，其中所述文库包含至少约106种不同的化合物。
111.权利要求106的方法，其中所述文库包含至少约108种不同的化合物。
112.权利要求106的方法，其中所述文库包含至少约101(1种不同的化合物。
113.权利要求106的方法，其中所述化合物文库包含至少约1012种不同的化合物。
114.权利要求106的方法，其中所述化合物文库包含多种独立地为式I的化合物 (I)其中X是包含一个或多个结构单元的功能部分； Z是在其3’末端与B连接的寡核苷酸； Y是在其5’末端与C连接的寡核苷酸； A是与X形成共价键的官能团； B是与Z的3’ -末端形成键的官能团； C是与Y的5’ -末端形成键的官能团； D、F和E各自独立地是双功能连接基团；且 S是原子或分子支架。
115.权利要求114的方法，其中对于每一种式I的化合物，A、B、C、D、E、F和S各自具 有相同的身份。
116.权利要求114的方法，其中所述化合物文库基本由多种式I的化合物组成。
117.权利要求114的方法，其中D、E和F各自独立地是亚烷基链或低聚(乙二醇)链。
118.权利要求114的方法，其中Y和Z基本互补，并且在化合物中定向，从而在适当条 件下能够发生Watson-Crick碱基配对和双链体形成。
119.权利要求114的方法，其中Y和Z具有相同的长度或不同的长度。
120.权利要求119的方法，其中Y和Z具有相同的长度。
121.权利要求114的方法，其中Y和Z各自为10个或更多碱基的长度，并且具有10个 或更多碱基对的互补区。
122.权利要求114的方法，其中S是碳原子、硼原子、氮原子、磷原子或多原子支架。
123.权利要求114的方法，其中S是磷酸基或环基。
124.权利要求123的方法，其中S是环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基。
125.权利要求114的方法，其中连接体部分具有结构 其中n、m和p各自独立地为1至约20的整数。
126.权利要求125的方法，其中n、m和p各自独立地为2至8的整数。
127.权利要求126的方法，其中n、m和p各自独立地为3至6的整数。
128.权利要求127的方法，其中连接体部分具有结构
129.权利要求114的方法，其中X和Z包含PCR引物序列。
全文摘要
本发明提供一种合成包含编码寡核苷酸标签的分子文库的方法。
文档编号C07H21/04GK101864412SQ20101015936
公开日2010年10月20日 申请日期2004年12月17日 优先权日2003年12月17日
发明者丹尼斯·本杰明, 乔治·J·富兰克林, 保罗·A·森特里尔拉, 克里斯托弗·C·阿里科·马恩德尔, 尼尔斯·雅各布·维斯特·汉森, 巴里·摩根, 戴维德·I·伊斯雷尔, 斯蒂芬·菲利普·克里泽, 斯蒂芬·黑尔, 理查德·瓦格纳, 雷克沙·A·阿查雅, 马修·克拉克, 马尔科尔姆·J·卡瓦尔纳, 马尔科尔姆·L·格夫特 申请人:普雷西斯药品公司