专利名称：一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小分子肽领域，具体涉及一种鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽及其 生产纯化方法和应用。
背景技术：
鲨鱼是极少患恶性肿瘤的海洋动物之一，其发病率为百万分之一。美国科学家 Luer将高剂量的强致癌剂黄曲霉素Bl注射到鲨鱼体内，也不能诱发鲨鱼患癌症。给鲨鱼接 种癌细胞也不能诱发癌症。这提示鲨鱼体内具有独特的抗肿瘤机制(贺丽虹1，黄建华2， 沈颂东等，海洋科学/2005年/第29卷/第11期63-66)。多年来，世界各国的研究人员多是对鲨鱼软骨组织进行了研究，从中分离提取 了多种具有肿瘤抑制作用，尤其是抑制肿瘤新生血管生长的多种物质，如Lee等(Lee A， Langer R. Shark cartilage contains inhibitors of tumor angiogenesis)首次从一条 姥鲨的鳍和脊椎软骨中分离提取了一种强烈抑制实体瘤新生血管生成的活性蛋白质。这类从鲨鱼软骨中提取的具有血管生成抑制活性的蛋白质称之为鲨鱼血管生 成抑制因子(Shark Cartilage Angiogenesis Inhibiting Factor, SCAIF)。Sheu 等 (Sheu JR, FuCC, Tsai ML, et al. Effect of U-995, a patent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor, on anti-angiogenesis and antitumor activities[J]. Anticancer Res, 1998,18 (6A) 4435)从蓝鲨软骨中分离纯化了由两条多肽组成的新血管 生成抑制因子U-995，可显著抑制人脐静脉内皮细胞的增殖与迁移，并会引起新血管的中 断和破裂，阻止破坏由肿瘤坏死因子TNF-α诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，防止由胶原 酶诱导的胶原溶解。目前，从各种鲨鱼软骨中分离提取的物质纯度不等，相对分子量大小不一，理化性 质和生物学活性不尽相同的蛋白质和多糖类物质。更有人直接将鲨鱼软骨粉作为口服药 物，如1997年，加拿大批准鲨鱼软骨口服液AE2941/Neovastat进入III期临床试验，它是 至今进入III期临床试验为数不多的抗血管生成药物之一。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中，从鲨鱼组织中分离提取的物质纯度不等，分 子量较大不容易被细胞吸收的问题，提供一种便于吸收的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多 肽。本发明另一目的在于提供一种编码上述小分子多肽的DNA序列。本发明另一目的在于提供一种含有编码小分子多肽的DNA序列的重组表达载体。本发明另一目的在于提供一种表达上述小分子多肽的重组微生物。本发明另一目的在于提供上述小分子多肽的生产纯化方法。本发明还有一个目的在于提供上述小分子多肽的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现本发明从鲨鱼组织中克隆到一个183个氨基酸的蛋白基因，不同于目前发现的任 何一种鲨鱼血管抑制因子。但因为分子量较小的小分子肽更容易被细胞吸收，因此克隆了 该蛋白的活性区域，大小为33个氨基酸的小分子肽，该小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。编码所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。小分子多肽多需要进行融合表达，虽然有GST标签等表达体系，但是表达产物切 割时多会留有多余氨基酸，因为小分子肽的分子量相对较小，多余的氨基酸可能会影响小 分子肽的功能。因而本发明采用了 SUMO表达系统，SUMO蛋白酶对SUMO融合表达系统表达 的重组蛋白进行切割切除掉SUMO蛋白后，不会在小分子肽上有多余氨基酸残留，因此是融 合表达小分子肽的最佳系统。因此本发明采用SUMO与鲨鱼血管抑制因子活性段融合表达， 表达后利用SUMO蛋白酶切除SUMO蛋白，获得非融合的小分子肽。本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的生产纯化方法，包括如下步骤(1)分别以-SUMO和鲨鱼血管抑制因子全长基因序列为模板，设计引物，引物序列 如SEQ ID N0:12 15所示；通过PCR扩增，得到两段基因序列，将两段基因连接在一起，经 酶切后与表达载体PET3C连接，得到重组表达载体；(2)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)，挑取单克隆接种到培 养基中，IPTG诱导表达后做电泳，选取表达量高的作为发酵种子；(3)将表达量高的克隆接种到培养基中发酵，离心所得发酵菌体，收集细胞、破碎、 离心后得到上清，用Ni-NTA柱进行纯化，得到含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分 子多肽；(4)将表达量高的克隆接种到培养基中发酵，离心所得发酵菌体，收集细胞、破碎、 离心后得到上清，用Ni-NTA柱进行纯化，得到含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分 子多肽；在含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽加入SUMO酶，SUMO酶与小 分子多肽的体积比为1 100，得到鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽。体外细胞学实验证明本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽具有抑制血管内 皮细胞和两种肿瘤细胞生殖的作用，同时该小分子肽还可以抑制鸡胚尿囊膜血管的生长。体内实验证明本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽可以抑制小鼠肿瘤的生 长。因此本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽可用于制备抑制血管内皮细胞的 相关药物，或者用于制备抗肿瘤药物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)本发明提供一种鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽，该小分子肽只含有33个氨 基酸，因此体积小，易于细胞吸收，有利于融合蛋白表达，而且利于人工合成，成本低；(2)本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽经体外和在体实验证明，具有抑制 血管内皮细胞和两种肿瘤细胞生殖的作用，还可以抑制鸡胚尿囊膜血管的生长，以及抑制 小鼠肿瘤的生长，因此可制备成相关药物，具有广阔的药用价值；(3)本发明采用将待表达基因与SUMO基因相结合，从而获得可溶性蛋白的高效表达，而且SUMO片断连接了 6个His，也便于纯化，纯化后的蛋白通过SUMO酶的酶切，可以获 得目的蛋白。
图1为鲨鱼血管生成抑制因子全长cDNA全序列的PCR电泳图；其中，1为PCR扩 增产物，M为DNA Marker ；通过PCR获得了鲨鱼血管生成抑制因子SAIFcDNA，为692bp。图2为利用PCR获得融合蛋白SUM0-SAIF基因；其中，M为DNAMarker ；1为融合蛋 白基因，经PCR，获得了一条约430bp的条带，与融合蛋白SUM0-SAIF基因的大小相符。图3为重组质粒pET3C/SUM0-aSAIF酶切鉴定电泳图；其中，1，2为DNAMarker ；3， 4，5分别为挑选克隆。经BamH I.Nde I双酶切后，三个克隆中有两个获得了 430bp大小的 条带，证明其为阳性克隆。图4融合蛋白表达SDS-PAGE电泳图；其中1和2为诱导组，3为对照组，未诱导，4 为上清，即菌体破碎离心后上清；5为沉淀，即菌体破碎离心后沉淀；电泳显示，与为诱导组 相比，工程菌经诱导后在20kDa处有一条明显的蛋白条带，说明，重组融合蛋白获得表达。 经破碎离心后，在上清中有同样大小的条带，而沉淀中则含量极小，说明该融合蛋白是以可 溶性蛋白的形式存在的。图5为含有SUMO标签的重组融合蛋白的纯化电泳图；其中，M为蛋白Marker ；1 为纯化后的融合蛋白；融合蛋白经M柱亲和层析后，收集洗脱峰进行电泳，获得纯度大于 90%的融合蛋白。图6为SUMO蛋白酶酶切含有SUMO标签的重组融合蛋白的电泳图；其中，1为SUMO 酶切后的蛋白；M为蛋白Marker ；约20kDa大小的融合蛋白经SUMO酶切后获得了 16kDa大 小的SUMO蛋白和4kDa大小的非融合鲨鱼血管抑制因子小分子肽；图7为非融合蛋白纯化电泳图；其中，1为非融合蛋白；M为蛋白质Marker ；酶切液 经过M柱二次纯化，带有His标签的SUMO蛋白与M柱结合，而小分子肽则随透过峰流出， 收集透过峰进行电泳，显示获得纯度约90%的非融合小分子肽aSAIF ；图8为本发明小分子肽抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成结果图；分设对照组(1 3)和用药组(4 6)，每组各3个平行样；与对照组相比较，给药组的鸡胚尿囊膜的血管密 度明显降低。图9为本发明小分子肽抑制肿瘤体积生长结果曲线图；1)阴性对照组(生理盐水 组)8只，给0.9%的Nacl溶液，每只每天加0. Iml ；2)阳性对照组(环磷酰胺)8只，按 文献给药浓度为20mg/kg，每只每天加0. Iml0 3)给药组8只，按文献给药浓度为5mg/kg， 每只每天加0. Iml ；结果显示，用药组的肿瘤体积明显低于对照组，其结果与阳性对照组没 有明显差异；图10为本发明小分子肽抑制肿瘤重量增加结果曲线图；1)阴性对照组(生理盐 水组)8只，给0.9%的Nacl溶液，每只每天加0. Iml ；2)阳性对照组(环磷酰胺)8只，按 文献给药浓度为20mg/kg，每只每天加0. Iml ；3)给药组8只，按文献给药浓度为5mg/kg， 每只每天加0. Iml ；结果显示，用药组的肿瘤重量明显低于对照组，其结果与阳性对照组没 有明显差异。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。本发明首先通过基因克隆技术，从条纹斑竹鲨软骨组织中制备得到鲨鱼血管生成 抑制因子的全长cDNA序列，及其编码氨基酸序列，然后通过对该氨基酸进行分析，并结合 文献检索，从而确定氨基酸上第91 123区域的33个氨基酸所构成的小分子多肽，可能为 蛋白的活性区域。接着本发明将该33个氨基酸组成的小分子肽进行融合蛋白表达，并对表 达蛋白进行活性鉴定，最后证实该小分子肽确实具有很好的抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞 生殖的作用，具体试验过程如各实施例所示。实施例1鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽的获得
1. 1总RNA提取和cDNA第一链的合成从条纹斑竹鲨软骨组织中提取总RNA 提取与纯化按照Promega公司的SVTotal RNA Isolation System试剂盒的说明书操作进行。cDNA第一链的合成使用TaKaRa RNA LA PCR TM Kit (AMV)试剂盒，以上述条纹 斑竹鲨软骨组织总RNA为模板，oligo(dT)18为反转录引物，操作按试剂盒推荐方法进 行。-20°C保存备用。1. 1. 1.引物设计根据现有已知的SCAIF序列，通过分析判断SCAIF序列的保守区域，设计引物，序 列如SEQ ID NO :4 9所示。LL2PCR 扩增PCR 扩增的反应条件为94°C预变性 3min，94°C 60s，40°C 60s，72°C 60s，共 30 个 循环，最后72°C延伸5min。PCR扩增体系为PCR Buffer4dNTP2rTaq 酶0.2质粒2F2R2ddH207.8_20 μ 1PCR扩增结果如图1所示，从图中可以看出，PCR扩增得到大约700bp的产物(箭 头所指位置)。将PCR产物采用常规的切胶回收、纯化、T载体连接、转化感受态细胞、检测阳性克 隆等本领域技术人员的常用技术，将所得阳性克隆送交测序。测序结果显示PCR扩增得到一条长692bp的序列，通过对该序列进行分析以及 生物学亲缘鉴定，发现其氨基酸序列与现有的SCAIF序列具有很高的同源性，其中与狗鲨 中克隆到的基因有85. 2%的同源性，与人和斑马鱼的相关基因的同源性分别为68. 9%和62. 3%。该基因序列不同于任何一种已知的SCAIF序列，由此证明本实施例得到一条新的 鲨鱼血管生成抑制因子的全长序列，长度为692bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示。对上述SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列进行分析，结果表明该序列编码183个氨基 酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。1. 2小分子肽的基因获得对SEQ ID NO :11所示氨基酸序列进行分析，并结合相关文献检索，确定该氨基酸 序列上第91 123区域的33个氨基酸所构成的小分子肽为蛋白的活性区域，编码该小分 子肽的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，该小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。实施例2融合表达载体的构建、表达和纯化1.含有SUMO标签的融合表达载体的构建本实施例构建含有SUMO基因以及SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的融合表达载体， 具体操作如下所示以pET3C-SUM0以及实例1所获得的鲨鱼血管抑制因子全长基因SEQ ID NO 10为 模板，采用引物Fl、Rl、F2、R2，通过PCR扩增得到432bp的目的片段。引物Fl，其核苷酸序列如SEQ ID NO 12所示；引物Rl，其核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示；引物F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示；引物R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示；PCR 扩增反应条件为94°C预变性 3min，94°C 60s，40°C 60s，72°C 60s，共 30 个循 环，最后72°C延伸5min。PCR扩增体系为
PCR Buffer4
dNTP2
rTaq 酶0. 2
质粒2
Fw2
Rv2
ddH207. 8
20 μ 1
以F1、R1和F2、R2为引物，以SUMO基因和鲨鱼血管抑制因子全长基因为模板分别
进行PCR，然后再以Fl和R2为引物进行第三次PCR，PCR扩增结果如图2所示，从图中可以 看出，PCR扩增得到大约432bp的产物(箭头所指位置)。将上述PCR扩增产物和大肠杆菌表达载体PET3C分别进行BamH I.Nde I酶切后 连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，涂布平板后，挑取阳性克隆，进行酶切鉴定，酶切鉴 定结果图3所示，从图中可以看出，在挑取的三个克隆中，其中两个(3和5)经双酶切后有 一个大约430bp的条带，证明是阳性克隆。将酶切鉴定的阳性克隆送交测 序，测序结果证实本实施例已经成功构建融合表达 载体 pET3C/SUM0-aSCAIF。
2.含有SUMO标签的工程菌的构建与表达将上述构建成功的融合表达载体pET3C/SUM0_aSCAIF转化大肠杆菌感受态细胞 BL21 (DE3)，涂布LB (Amp+)平板，挑取单克隆接种到LB培养基中，当OD = 0. 6时，加入IPTG 诱导表达，诱导3h后收取菌体，进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳结果如图4所示，从图中可以看到经诱导后，在20kDa处有一条明显 条带，由此说明本实施例成功获得含有SUMO的重组融合蛋白。挑取表达量高的克隆作为菌种在摇瓶中扩大培养，同样条件下诱导表达，诱导3h 后离心收取菌体，经超声波破碎，离心后分别制备上清和沉淀的样品，进行常规SDS-PAGE 电泳，电泳鉴定发现该含有SUMO标签的融合蛋白存在于破碎上清中，因此该融合蛋白是以 可溶性形式表达的。3.含有SUMO标签的重组融合蛋白的发酵在22L发酵罐中加入IOL培养基，培养基中含蛋白胨2%，酵母粉2%，糖蜜0.5% 及磷酸缓冲液(Na2HPO4 0.2%,NaH2PO4 0. 1%,ρΗ7. 0) ；37°C培养，接种量10%;溶氧控制在 发酵前期低速，中期高速，后期低速；连续流加葡萄糖250g，同时通过流加NaOH或HCl，控制 PH变化；IPTG在发酵进行到3hr时加入，同时温度设置在32°C，诱导5hr后放罐。获得菌 体 32g/L。4. SUMO标签的去除及纯化将上述所得发酵菌体进行离心处理，收集细胞，按照1 8的比例将细胞重悬在破 碎缓冲液中(50mM Tris+300mM NaCl PH 7. 5)，超声波破碎细胞后离心，取上清，因该融合 蛋白含有一个His纯化标签，因此使用Ni-NTA柱进行纯化，纯化的具体操作参照Ni-NTA柱 说明书即可。首先用缓冲液A(20mM磷酸缓冲液+500mM Nacl+30mM咪唑PH7. 5)平衡Ni-NTA柱， 然后加入样品，再用缓冲液B (20mM磷酸缓冲液+500mM Nacl+30mM咪唑PH7. 5)进行清洗， 之后用缓冲液C(20mM磷酸缓冲液+500mMNaCl+500mM咪唑PH7. 5)洗脱，分步收取洗脱液， 进行电泳，从图5可以看出，经Ni柱一步纯化后，可以得到纯度约90%的含有SUMO标签的
重组融合蛋白。将纯化后的含有SUMO标签的重组融合蛋白，按照SUMO酶重组融合蛋白= 1 100的比例混合(ν/ν)，37°C恒温酶切12h后，电泳结果如图6所示，从图中可以看出， 分子量为20kDa的重组融合蛋白被酶切为16kDa的SUMO蛋白条带以及4kDa的目的蛋白条 带(本发明的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽其分子量约4kDa左右)，经过二次Ni柱纯 化，，连有His的SUMO蛋白可以和柱结合，而非融合的aSCAIF随着透过峰流出，从而和SUMO 蛋白分离。电泳图中可以看到透过峰中有分子量大小约为4kDa的蛋白条带，纯度可达90% 以上。收集透过峰，做蛋白电泳显示可以获得大约90%纯度的4kDa非融合的小分子肽(见 图7)。由此说明本实施例成功获得融合表达的鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽。实施例3鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽活性检测1.采用MTT实验检测实施例2制备所得鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽抑制血管 内皮细胞HUVEC、乳腺癌细胞MCF-7和人前列腺癌细胞DU145的生长情况(抑制率=(实验 组_对照组)/对照组)，MTT操作采用本领域技术人员的常规操作，检测结果如表1所示。
表1小分子肽抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞增殖的抑制率
抑制率(％)/浓度 (mg/mL)0. 050. 0250. 01250. 006HUVEC53. 20%28. 70%15. 90%9%MCF-734. 80%16. 80%8. 20%0. 80%DU14516. 50%12. 60%4. 90%2. 10%从表1可看出，本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽能够抑制血管内皮细胞 HUVEC、乳腺癌细胞MCF-7和人前列腺癌细胞DU145的生长，尤其是血管内皮细胞的生长，在 浓度为0. 05ug/ul时，抑制率可以达到53. 20%.2.对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制买回孵化第6天的鸡胚，放在实验室的恒温箱内适应ld，第二天，打开鸡胚尿囊膜 一端，将滤膜剪成直径Imm的正方形，并将实施例2制备所得鲨鱼血管生成抑制因子小分 子肽0. 3ug/ul加在滤膜上，空白对照为生理盐水，加样量为20ul，等滤膜吸收了样品后， 将其放在尿囊膜上，并用透明胶布封严，7d以后，打开透明胶布，用固定液(甲醇丙酮= 1 1，体积比)固定3min后，用剪刀剪下滤膜周围的尿囊膜，平铺于培养皿上，用相机拍 摄。实验结果如图8所示，从图中可以看出，实验组加入了鲨鱼血管抑制因子小分子 肽的样本中血管密度明显低于对照组，说明鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽可以抑制鸡 胚绒毛尿囊膜血管生成。3.对小鼠肿瘤的抑制作用小鼠乳垫接种鼠源乳腺癌4T1肿瘤细胞，设置三个组别1)阴性对照组(生理盐水组)8只，给0. 9%的Nacl溶液，每只每天加0. 1ml。2)阳性对照组(环磷酰胺)8只，按文献给药浓度为20mg/kg，每只每天加0. 1ml。3)给药组8只，给药浓度为5mg/kg，每只每天加0. Iml0给药组和对照组均每天腹腔注射0. ImL,每天给药1次。观察各组的肿瘤体积和重量变化情况，结果如图9和图10所示，从图中的各曲线 对比可以看出，无论是瘤体积还是瘤重量，阴性对照组都明显高于阳性对照组和实验组。而 且实验组的作用结果接近或好于阳性对照组。本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽对小 鼠乳腺癌4T1肿瘤细胞的生长是有明显的抑制作用的。
权利要求
一种鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽，含有33个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.编码权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的DNA序列，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO 2 所示。
3. 一种重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体含有权利要求2所述的DNA序列。
4. 一种重组微生物，其特征在于所述重组微生物是权利要求3所述重组表达载体转化 大肠杆菌感受态细胞制备得到。
5.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的生产纯化方法，其特征在于包 括如下步骤(1)分别以-SUMO和鲨鱼血管抑制因子全长基因序列为模板，设计引物，引物序列如 SEQ ID NO :12 15所示；通过PCR扩增，得到两段基因序列，将两段基因连接在一起，经酶 切后与表达载体PET3C连接，得到重组表达载体；(2)将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆接种到培养基 中，IPTG诱导表达后做电泳，选取表达量高的作为发酵种子；(3)将表达量高的克隆接种到培养基中发酵，离心所得发酵菌体，收集细胞、破碎、离心 后得到上清，用Ni-NTA柱进行纯化，得到含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多 肽；(4)将表达量高的克隆接种到培养基中发酵，离心所得发酵菌体，收集细胞、破碎、离心 后得到上清，用Ni-NTA柱进行纯化，得到含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多 肽；在含有SUMO标签的鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽加入SUMO酶，SUMO酶与小分子 多肽的体积比为1 100，得到鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽。
6.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽在抑制血管和血管内皮细胞的 生产或生长中的应用。
7.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽在制备抑制血管生成或生长的 药物中的应用。
8.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽在制备抑制血管内皮细胞生成 或生长的药物中的应用。
9.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用。本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，编码该小分子多肽的DNA序列如SEQ ID NO2所示。本发明鲨鱼血管生成抑制因子小分子多肽可以抑制血管和血管内皮细胞的生成或生长，还可抑制肿瘤细胞的增殖，可用于制备抑制血管生成或生长相关药物，或用于制备抗肿瘤药物。
文档编号C07K14/475GK101899104SQ201010191509
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者梁旭方, 洪岸, 谢秋玲, 陈小佳 申请人:暨南大学